Name: Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer lipoproteïnen extraheren uit bacteriële cellen met niet-ionische surfactant-fasepartitionering voor immunologisch onderzoek. Deze methode bereidt N-terminale lipopeptiden voor structurele analyse via MALDI-TOF massaspectrometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek in het laboratorium van Meredith werd gesteund door opstarten middelen die door de Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Wij danken Dr. Tatiana Laremore voor deskundig technisch advies en toegang tot de apparatuur op de Penn State Proteomics en massaspectrometrie Core faciliteit, University Park, PA, waar de massaspectrometrische analyses werden uitgevoerd.

1. groei en Lysis van de cel
<ol><li>Groeien bacteriën in 15 mL al soja broth (TSB) of soortgelijke rijke media tot laat-exponentiële groeifase (OD600 van 1.0-1.5). Oogsten van cellen door middel van centrifugeren, een keer wassen met Tris-gebufferde zoutoplossing/EDTA (TBSE) en blijven met protocol of bevriezen tot gebruik. Opmerking: TBSE: 20 mM Tris-waterstofchloride (HCl), pH 8,0 130 mM natriumchloride (NaCl), en 5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)). Lipoproteïne expressie en wijziging kunnen worden beïnvloed door groei omstandigheden (bijvoorbeeld zuurtegraad, zoutgehalte, groei media) en de groei fase15. Celgroei kan worden geschaald als gewenste, maar 15 mL van cellen wordt aanbevolen voor een één preparaat van lipoproteins aangezien overtollige biomassa lipoproteïne opbrengst kan verminderen. Één 15-mL preparaat levert over het algemeen genoeg monster voor optimaal laden van ~ 2-4 rijstroken op een standaard SDS-pagina mini gel.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 800 μL TBSE met 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) en 0,5 mg/mL lysozym. Breng de oplossing aan de buis van een schroefdraad microcentrifuge 2.0-mL met schroefdop en O-ring en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Opmerking: Sommige soorten zijn niet gevoelig voor lysis door lysozym. Een passende lytische enzym zouden moeten worden vervangen om steun in cellysis.</li>
	<li>~ 800 μL 0.1 mm Zirkonia/kiezelzuur kralen toevoegen aan de buis en breek cellen door schudden bij maximale snelheid (7000 rpm) op een homogenizer voor 5 cycli van 30 s elk, met 2 min rusten op ijs tussen elke cyclus.</li>
	<li>Centrifuge monster bij 3000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C (tot pellet kralen en ongebroken cellen). Het supernatant overbrengen in een nieuwe 2.0-mL microcentrifuge buis en houd op ijs.</li>
	<li>200 μl TBSE toevoegen aan de resterende pellet en terugkeren naar de homogenizer voor een extra cyclus. Centrifugeer (zoals hierboven) en combineren van supernatant met het vorige supernatant (moet 800-1000 μL totale volume).</li>
</ol>2. de verrijking van Lipoproteins door TX-114 fase partitioneren
<ol><li>Aanvulling van het supernatant met TX-114 oppervlakteactieve stof aan een definitieve concentratie van 2% (vol/vol) door een gelijk volume van 4% (vol/vol) de oppervlakteactieve stof in ijskoude TBSE toe te voegen en uit te broeden op ijs voor 1 h, mengen door inversie elke ~ 15 min. Opmerking: Wanneer gekoeld, de bovendrijvende substantie en oppervlakteactieve stof zullen mengbaar.</li>
	<li>De buis overbrengen in een waterbad 37 ° C en incubeer gedurende 10 min voor het opwekken van fase-separatie zichtbaar. Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te handhaven bi-phasic scheiding.</li>
	<li>Voorzichtig uit de bovenste waterfase Pipetteer en gooi deze weg. Ijskoude TBSE toevoegen aan de onderste fase van de oppervlakteactieve stof te vullen van de buis naar het oorspronkelijke volume en omkeren als u wilt mengen. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.</li>
	<li>De buis overbrengen in een waterbad 37 ° C en incubeer gedurende 10 min voor het opwekken van fase-separatie zichtbaar, dan Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal stap 2.3-2.4 nogmaals voor een totaal van 3 scheidingen. Verwijder de bovenste waterfase en negeren.</li>
	<li>Pellet van neergeslagen eiwitten die in de loop van extracties (zichtbaar aan de onderkant van de buis), gevormd door toevoeging van 1 deel ijskoude TBSE aan de fase van de oppervlakteactieve stof verwijderen. Centrifugeer bij 4 ° C bij 16.000 x g gedurende 2 min naar de pellet onoplosbare eiwitten. Opmerking: Monster moet een enkele fase blijven. Als fasescheiding optreedt, opnieuw chill monster en Centrifugeer nogmaals. De pellet is over het algemeen samengesteld uit niet-lipoproteïne verontreinigingen, maar voor verdere analyse kan worden gehandhaafd.</li>
	<li>Onmiddellijk overdracht het supernatant tot een koker van de verse 2.0-mL microcentrifuge met 1250 μL van 100% aceton. Pipetteer omhoog en omlaag grondig te wassen van het monster van de tip als het visceuze zal zijn. Meng door inversie en na een nacht bebroeden bij-20 ° C te precipiteren eiwit.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te pellet lipoproteïnen met aandacht voor de oriëntatie van de buis. Lipoproteins van de vormen een dunne, witte film langs de buitenmuur van de buis.</li>
	<li>Wassen pellet tweemaal met 100% aceton. Decanteren van aceton en laat monster aan de lucht droog.</li>
	<li>Voeg 20-40 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 of een standaard Laemmli SDS-PAGE monster buffer16 en grondig resuspendeer door pipetteren op en neer tegen de muur met de neergeslagen lipoproteïnen. Schrapen van de kant van de buis met het uiteinde van de pipet te verjagen lipoproteïnen. Opmerking: Lipoproteins zal niet oplossen in de Tris buffer, maar veeleer vormen een schorsing.<ol>
<li>Lipoproteins van de bij-20 ° C bewaren tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SDS-PAGE, Electroblotting en kleuring met Ponceau S
<ol><li>Lipoproteins van de afzonderlijke door SDS-PAGE met behulp van standaardmethoden16. Opmerking: Het juiste gel acrylamide percentage zal variëren afhankelijk van de beoogde gebruik en de grootte van de lipoproteïnen. Hier, werden E. faecalis lipoproteïnen gescheiden over een 10% Tris-glycine gel, terwijl een 16,5% Tris-tricine gel werd gebruikt voor de kleinere E. coli lipoproteïne Lpp17.</li>
	<li>De lipoproteïnen overbrengen in een nitrocellulose overdracht membraan met behulp van een standaard electroblotting procedure. Opmerking: Een semi-droge overdracht met behulp van Bjerrum Schafer-Nielsen buffer plus 0,1% SDS werd uitgevoerd bij 25 V, 1,3 mA voor 15 min18. Afwisselend, Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan kan worden gebruikt, maar aangezien er meer hydrofobe dan nitrocellulose, het efficiënt elutie van hydrofobe lipopeptides van het membraan bij latere stappen verminderen kan.</li>
	<li>Het membraan van het nitrocellulose overbrengen in een container en bedek met Ponceau S oplossing (0,2% (m/v) Ponceau S in 5% azijnzuur). Rock zacht gedurende 5 minuten of totdat de rood-roze bands zijn zichtbaar.</li>
	<li>Giet af oplossing Ponceau S en spoel zorgvuldig het membraan van het nitrocellulose met dH2O te verwijderen overtollige vlek. Opmerking: Ponceau gebeitste banden zal snel destain. Als bands verdwijnen, herhaal kleuring proces.</li>
	<li>Accijnzen met een schone scheermesje, de gewenste band en overdracht aan een microcentrifuge buis. Was driemaal uit met 1 mL van dH2O van volledig destain van de band. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Opslaan van de verwijderde sectie bedekt met water bij-20 ° C tot gebruik.</li>
	<li>Overdracht van de sectie op een schoon oppervlak en met een schone scheermesje, dobbelstenen de nitrocellulose-strip in kleine stukjes van ongeveer 1 mm x 1 mm. Verzamel de stukken in een laag eiwitgehalte van 0,5 mL bindende microcentrifuge buis.</li>
	<li>Wassen van de stukken twee keer met 0,5 mL van vers bereide 50 mM Ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3), pH 7,8 in krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) rang water.</li>
</ol>4. al spijsvertering, Lipopeptide extractie van het membraan van het Nitrocellulose, afzetting op MALDI Target, en Data-acquisitie
<ol><li>Resuspendeer nitrocellulose stukken in 20 μL van een 20 μg/mL oplossing van trypsine in 50 mM NH4HCO3, pH 7,8 in HPLC rang water. Vortex te mengen, draai vervolgens kort om ervoor te zorgen dat alle stukken volledig gedekt zijn door de trypsine-oplossing. Betrekking hebben op het deksel van de buis met behulp van paraffine film ter voorkoming van verdamping en incubeer digest's nachts bij 37 ° C.</li>
	<li>Draai het monster bij 16.000 x g gedurende 30 s en verwijder de vloeistof door pipetteren. Opmerking: Dit verwijdert trypsinized hydrofiele peptiden die kunnen later worden onderzocht door de MALDI-TOF MS voor eiwit identificatie.</li>
	<li>50 μl van 0,5% trifluorazijnzuur (TFA) in HPLC rang water toevoegen. Vortex te mengen, draai vervolgens aan het monster kort ervoor te zorgen dat alle stukken vallen door de oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De vloeistof afzuigen door pipetteren. Let op: TFA is schadelijk bij inademing. Omgaan met de nodige voorzichtigheid en gebruik in de chemische zuurkast. Aanraking met de huid vermijden.</li>
	<li>Herhaal stap 4.3 met 50 μl van 10% acetonitril in HPLC rang water. Let op: Acetonitril is schadelijk bij inademing. Omgaan met de nodige voorzichtigheid en gebruik in de chemische zuurkast. Aanraking met de huid vermijden.</li>
	<li>Herhaal stap 4.3 met 50 μl van 20% acetonitril in HPLC rang water. Opmerking: Dit verwijdert elk matig hydrofobe peptiden losjes gebonden aan de nitrocellulose.</li>
	<li>Elueer de strak-gebonden lipopeptides, toevoegen van 15 μl van 10 mg/mL vers-en-klare α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) matrix opgelost in chloroform-methanol (2:1, v/v) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met intermitterende vortexing.<ol>
<li>Afwisselend, voeg 15 μL chloroform-methanol om Elueer lipopeptides en vermeng ze met matrix op een later tijdstip. Andere matrices, zoals 2,5-dihydroxybenzoic zuur (DHB), moeten worden getest als alternatieven voor CHCA als onbevredigende resultaten worden verkregen voor de samenstelling van een bepaalde lipopeptide. Let op: Zowel de chloroform en de methanol zijn schadelijk inademing. Omgaan met de nodige voorzichtigheid en gebruik in de chemische zuurkast. Aanraking met de huid vermijden.</li>
		<li>
Optioneel: Ter bevordering van natrium adduct van vorming, de oplossing van CHCA in chloroform-methanol met waterige natriumbicarbonaat (NaHCO3) aanvulling op een eindconcentratie van 1 mM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het monster kort draaien. Met een pipet, moet u de vloeistof zorgvuldig overbrengen in een nieuwe laag eiwitgehalte bindende microcentrifuge buis. Deze oplossing zal het grootste deel van de N-terminal lipopeptides bevatten. Opmerking: De nitrocellulose mag geheel of gedeeltelijk los in de chloroform-methanol-oplossing. Dit MS resultaat niet negatief zal beïnvloeden, en kan worden gebruikt als een alternatieve methode om lipopeptide rendement verhogen. PVDF membraan zal niet op dezelfde manier oplossen.</li>
	<li>Stort 1 μL van de eluted lipopeptides met CHCA op een gepolijst stalen MALDI doel. Opmerking: De chloroform-methanol zal verdampen snel, achterlating van gekristalliseerde CHCA en lipopeptides. Een optionele tweede 1 μL aliquoot kan worden gestort op dezelfde plek te monster concentratie verhogen. Chloroform-methanol kan aanzienlijk worden verspreid na afzetting op het doel en als zodanig moet worden gezorgd om te voorkomen dat het monster mengen op de doelgroep. Het wordt aanbevolen te deponeren en schieten meerdere plekken van elk monster.</li>
	<li>Onmiddellijk overgaan tot massaspectrometrie. Scan alle gebieden van de plek voor lipopeptide signaal, vooral als de spot twee lagen van monster, bevat zoals de tweede laag de lipopeptides aan de buitenste rand van de plek duwen kan. Opmerking: Aanbevolen startende laser intensiteit is 25%, al is het mogelijk om meerdere spectra (20 of meer scans) om voldoende signaal-/ ruisverhouding som te verwerven signaal intensiteit te verhogen. Hier, spectra werden verworven over een MALDI-TOF-TOF instrument (Zie de Tabel van materialen) met behulp van een fabriek geconfigureerde instrument-methode voor de detectie van de positieve-ion reflector over het bereik van de m/z 700-3500. Het instrument was gekalibreerd met een mengsel van de al peptide bovien serumalbumine (BSA).</li>
</ol>

<ol><li>Babu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+bacterial+lipoproteins+%28DOLOP%29+with+functional+assignments+to+predicted+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins.</a> J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).</li>
<li>Narita, S., Tokuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipoproteins%3B+biogenesis%2C+sorting+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).</li>
<li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).</li>
<li>Nguyen, M. T., Götz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria%3A+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).</li>
<li>Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+in+bacteria%3A+structures+and+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways.</a> FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+bacterial+lipoprotein+structures+conserved+in+low-GC+content+Gram-positive+bacteria+are+recognized+by+Toll-like+receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Triacylated+ATP+Binding+Cluster+Transporter+Substrate-binding+Lipoprotein+of+Staphylococcus+aureus+Functions+as+a+Native+Ligand+for+Toll-like+Receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2.</a> J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).</li>
<li>Asanuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+evidence+of+%CE%B1-aminoacylated+lipoproteins+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus.</a> FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).</li>
<li>Armbruster, K. M., Meredith, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Lyso-Form+N-Acyl+Intramolecular+Transferase+in+Low-GC+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes.</a> J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).</li>
<li>Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acylation+state+of+surface+lipoproteins+of+Mollicute+Acholeplasma+laidlawii%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii.</a> J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).</li>
<li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+mouse+spleen+B-cell+proliferation+and+secretion+of+immunoglobulin+by+lipid-associated+membrane+proteins+of+Mycoplasma+fermentans+incognitus+and+Mycoplasma+penetrans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans.</a> Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).</li>
<li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extract+of+Mycoplasma+penetrans+proteinase+K-digested+lipid-associated+membrane+proteins+rapidly+activates+NF-kappaB+and+activator+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1.</a> Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).</li>
<li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+electroblotted+proteins+by+mass+spectrometry%3A+protein+identification+after+Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).</li>
<li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Nitrocellulose+Membranes+for+Protein+Characterization+by+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment-mediated+accumulation+of+diacyl+lipoproteins+over+their+triacyl+counterparts+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus.</a> J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schӓgger, H. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).</li>
<li>Gravel, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59259-169-8:321">Protein Blotting by the Semidry Method.</a> The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-59745-198-7_120">Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).</li>
<li>Wilkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+peptide+characterization+using+PEPTIDEMASS+-+a+World-Wide-Web-accessible+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://web.expasy.org/docs/expasy_tools05.pdf">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).</li>
<li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).</li>
<li>Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+lipids%3A+ionization+and+prompt+fragmentation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hierin beschrijft twee verschillende fasen van de karakterisering van het lipoproteïne: verrijking door TX-114 fase partitionering en structurele bepaling door MALDI-TOF MS. Tijdens de extractie van de TX-114 verwijdert extra centrifugeren contaminerende eiwitten die tijdens dit proces precipiteren, gevolgd door aceton neerslag hoogverrijkt lipoproteïnen opleveren. Door de omvang van elk preparaat aan 15 mL waarde van cellen te beperken, kunnen verschillende monsters worden gemakkelijk verwerkt parallel en i...

Lipoproteins van de bacteriële worden gekenmerkt door een geconserveerde N-terminale lipide gemodificeerde cysteïne die ankers van het domein van de bolvormige eiwit op het oppervlak van de celmembraan. Ze zijn universeel verspreid in bacteriën, die 2 tot 5% van alle cellulaire genen binnen een typisch genoom1. Lipoproteins van de spelen een kritieke rol in een grote verscheidenheid van cellulaire processen, waaronder de opname van de voedingsstoffen, signaaltransductie, vergadering van eiwitcomplexen, en ter handhaving cel envelop structurele integriteit2. Pathogene bacteriën dienen lipoproteïnen als virulentie factoren3,4. Erkenning van N-terminal lipopeptides door Toll-like receptor (TLR) 2 aanzet tijdens een infectie, een aangeboren immune reactie op het verwijderen van de invasie ziekteverwekkers. Afhankelijk van de N-terminale acylering staat, zijn de lipoproteïnen algemeen erkend door alternatieve TLR2 heterodimeric complexen. TLR2-TLR1 herkent N-GEACYLEERDE lipopeptides, terwijl TLR2-TLR6 bindt gratis lipopeptide α-amino termini. Eenmaal gebonden, samenkomen de signaalroutes om te induceren secretie van proinflammatoire cytokines3,4.
Eerder werd gedacht dat lipoproteins van gram-positieve bacteriën waren diacylated en die van gram-negatieve bacteriën triacylated, die verschillen in de afwezigheid of de aanwezigheid van een vetzuur amide-linked op het geconserveerde N-terminale cysteine residu. Deze veronderstelling werd gesteund door het ontbreken van reeks orthologs in gram-positieve genoom te Lnt, de gram-negatieve N-acyl-transferase die triacylated lipoproteïnen5vormt. Echter, recente studies is gebleken dat lipoproteïne triacylation in gram-positieve Firmicutes die ontbreken lnt, evenals drie nieuwe N-terminale lipoproteïne structuren, genoemd de peptide, lyso en N -acetyl vormen6,7 ,8. Deze bevindingen stellen vragen over mogelijk nog-te-worden-ontdekt lipoproteïne vormen, naast het fundamentele vragen over de manier waarop deze roman lipoproteins worden gemaakt en welke fysiologische doel of voordeel de verschillende vormen geven. Bovendien tonen zij duidelijk aan het huidige onvermogen van de genomica te voorspellen lipoproteïne structuur. Inderdaad, we onlangs geïdentificeerd een nieuwe klasse van lipoproteïne N-acyl enzym, genaamd Lit, van Enterococcus faecalis en Bacillus cereus , dat lyso-formulier lipoproteïnen9 maakt. Dit wijst op de noodzaak om het experimenteel verifiëren lipoproteïne structuur, die uitdagend vanwege hun zeer hydrofobe aard en de beperkte methoden beschikbaar worden kan voor het karakteriseren van hun moleculaire structuur.
Ter vergemakkelijking van studies over lipoproteïne inductie van de immuunrespons van de gastheer, alsook de structurele vaststelling van N-terminale, hebben we verschillende eerder beschreven protocollen om te zuiveren lipoproteins van de bacteriële en de voorbereiding van de N-terminale al aangepast lipopeptides voor analyse door MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteïnen zijn verrijkt met behulp van een gevestigde Triton X-114 (voortaan aangeduid als oppervlakteactieve stof of TX-114) fase partitioneren methode, met optimalisatie lipoproteïne opbrengst te verwijderen van contaminerende niet-lipoproteïnen. Deze lipoproteins zijn geschikt voor direct gebruik in TLR testen of voor verdere zuivering door SDS-PAGE. Voor MALDI-TOF MS, overdracht van de lipoproteïnen aan het membraan van het nitrocellulose voorziet een steiger efficiënt in situ de spijsvertering van de trypsine, wassen en latere elutie van het oppervlak van de membraan, resulterend in sterk gezuiverd N-terminal lipopeptides. Nitrocellulose is aangetoond dat het oog op het hanteren van de steekproef en verbetering van de reeks dekking voor zeer hydrofobe peptides van integraal membraan eiwitten13,14, evenals lipoproteïnen9,10 . De methode heeft als extra voordeel van peptiden op basis van polariteit, zodat de tussenliggende wassen oplossingen kunnen worden geanalyseerd voor hoge vertrouwen eiwit identificatie gelijktijdig met N-terminale structurele bepaling in een enkele experiment . Dit protocol een unieke functies opzettelijke natrium adduct vorming te bevorderen van bovenliggende ion fragmentatie naar dehydroalanyl ionen tijdens MS/MS, helpend in structurele toewijzing van de N- acylering staat. De N-terminus is zowel de meest variabele en belangrijke functie gerelateerde TLR erkenning van lipoproteïnen. Tezamen, hebben dit protocol intensieve en reproduceerbare studies op lipoproteïnen, met de afzonderlijke fasen van zuivering en bepaling van de structurele door MALDI-TOF MS gemakkelijk aangepast afhankelijk van het algemene doel van het experiment.

<table><tbody><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,01 mm Zirkonia/silica kralen</td><td>BioSpec Products</td><td>110791012</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMD</td><td>AX0116-6</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>EMD</td><td>AX0142-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Fluka Analytical</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace NT Nitrocellulose</td><td>PALL Life Sciences</td><td>66485</td><td></td></tr><tr><td>Bos serum albumine (BSA) digest standaard</td><td>Protea</td><td>PS-204-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550025</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kwaliteit water</td><td>EMD</td><td>WX0008-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP535-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Pierce trypsine protease</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Acros Organics</td><td>161470100</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind buisje 0,5mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-hydrochloride (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93422</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische sojabroodbouillon (TSB)</td><td>BD</td><td>211822</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnaminezuur (MS kwaliteit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNALyser</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF doel</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Uitgerust met een 355 nm frequentie-verdrievoudigd Nd:YAG smartbeam-II laser</td></tr></tbody></table>

verrijking van lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van n-terminal lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Lipoproteïnen zijn belangrijke bestanddelen van de bacteriële celenvelop en krachtige activators van de zoogdieren aangeboren immuunrespons. Ondanks hun belang voor zowel celfysiologie en immunologie, moet nog veel worden ontdekt over roman lipoproteïne formulieren, hoe ze worden gesynthetiseerd en het effect van de verschillende vormen op de immuniteit van de gastheer. Opdat de grondige studies over lipoproteïnen, dit protocol beschrijft een methode voor bacteriële lipoproteïne verrijking en voorbereiding van N-terminale al lipopeptides voor structurele bepaling door laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie-tijd van de vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS). Uitbreiding op een gevestigde Triton X-114 fase partitioneren methode voor lipoproteïne winning en de verrijking van de bacteriële cel membraan, het protocol bevat aanvullende stappen om te verwijderen van niet-lipoproteïne contaminanten, lipoproteïne rendement verhogen en zuiverheid. Aangezien lipoproteïnen worden vaak gebruikt in Toll-like receptor (TLR) testen, is het essentieel om eerst het karakteriseren van de structuur van de N-terminal door MALDI-TOF MS. Herein, een methode is bedoeld om te isoleren van geconcentreerde hydrofobe peptiden verrijkt met N-terminal lipopeptides geschikt voor een directe analyse door Lipoproteins van de MALDI-TOF-MS/MS. die zijn gescheiden door Poly-Acrylamide gelelektroforese (SDS-pagina) voor natrium Dodecyl Sulfaat worden overgedragen aan een membraan van het nitrocellulose, verteerd in situ met Trypsine, opeenvolgend gewassen om te verwijderen van polar al peptiden, en ten slotte met chloroform-methanol geëlueerd. Wanneer gekoppeld aan MS van de meer polar trypsinized peptiden van wassen oplossingen, biedt deze methode de mogelijkheid om zowel het lipoproteïne te identificeren en te karakteriseren zijn N-terminus in een enkele experiment. Opzettelijke natrium adduct vorming kan ook worden gebruikt als een instrument ter bevordering van meer structureel informatieve fragmentatie spectra. Uiteindelijk, verrijking van lipoproteins en bepaling van hun structuren van N-terminale toestaat meer uitgebreide studies op deze alomtegenwoordige klasse van bacteriële eiwitten.

Een schematische voorstelling van het protocol wordt gegeven in Figuur 1. Het lipoproteïne-verrijkt breuk Enterococcus faecalis ATCC 19433 onttrokken door TX-114 is afgebeeld in Figuur 2. Ter vergelijking: de banding patroon van de neergeslagen eiwitoplossing blijkt ook. Eiwitten uit dit gedeelte werden bevestigd door MALDI-MS te zijn zeer overvloedig besmetten van eiwitten dan lipoproteïnen (tabel 1). D...

De verrijking van bacteriële lipoproteins met behulp van een fase van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof partitioneren methode wordt beschreven voor direct gebruik in TLR testen of andere toepassingen. Verdere stappen zijn gedetailleerd voor te bereiden al lipopeptides van N-terminale structurele karakterisering door massaspectrometrie.

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

Het algemene doel van deze procedure is om lipoproteïnen uit bacteriële cellen te extraheren voor directe toepassingen en om N-terminale lipopeptiden verder voor te bereiden voor structurele analyse door middel van MALDI-TOF massaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, aangezien de N-terminale structuur van de lipoproteïnen de herkenning en signalering van Toll-achtige receptoren beïnvloedt, wat de immuunrespons van de gastheer beïnvloedt. Het unieke voordeel van deze techniek is de optionele maar opzettelijke vorming van natriumadducta, die fragmentatie bevordert naar de diagnostische dehydroalanyl ion, wat helpt bij de structurele toewijzing van de acylatietoestand van het lipoproteïne.Laat bacteriën groeien in 15 milliliter tryptische sojabouillon of soortgelijk rijk media tot de late exponentiële fase. Verzamel de cellen door centrifugatie voordat je ze eenmaal wast met Tris-gebufferde saline EDTA of TBSE. resuspendeer de cellen in 800 microliter TBSE met één millimolair PMSF en 0,5 milligram per milliliter lysozyme.Breng de oplossing over naar een 2,0-milliliter microcentrifugebuis met schroefdop en O-ri

enrichment-bacterial-lipoproteins-preparation-n-terminal-lipopeptides

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the enrichment of bacterial lipoproteins using a non-ionic detergent that undergoes phase separation upon warming. Through sequential temperature shifts and centrifugation steps, lipoproteins are selectively partitioned into the detergent phase, while non-lipoprotein contaminants...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins Using Non-Ionic Detergent Phase Separation

Isolatie en karakterisering van het lipide Een domein van lipopolysaccharide (LPS) van gram-negatieve bacteriën geeft inzicht in celoppervlak gebaseerde mechanismen van resistentie tegen antibiotica, bacteriële overleving en fitness, en hoe chemisch diverse lipide Een moleculaire species verschillend moduleren gastheer aangeboren immuunrespons.

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.

Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography

Veel voorspelde (fosfo)lipasen zijn slecht gekarakteriseerd met betrekking tot hun substraatspecificiteit en fysiologische functies. Hier bieden we een protocol om enzymactiviteiten te optimaliseren, naar natuurlijke substraten te zoeken en fysiologische functies voor deze enzymen voor te stellen.

Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Deze methode biedt een kader voor het bestuderen van de opname van exogene vetzuren uit complexe gastheer bronnen in bacteriële membranen, met name Staphylococcus aureus. Om dit te bereiken, protocollen voor de verrijking van lipoproteïne deeltjes uit kip eierdooier en daaropvolgende vetzuur profilering van bacteriële fosfolipiden met behulp van massaspectrometrie worden beschreven.

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Dit protocol beschrijft een efficiënte celvrije methode voor de productie van hoogwaardig proteoliposoom door middel van een bilayer-dialysemethode met behulp van een tarwecelvrij systeem en liposomen. Deze methode biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en ontwikkeling van antilichamen.

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Shotgun massaspectrometrie-gebaseerde lipidomics levert een gevoelige kwantitatieve momentopname van een breed spectrum van lipidenklassen tegelijkertijd in een enkele meting van verschillende knaagdierweefsels.

Shotgun Lipidomics van Knaagdier weefsels

Leer lipoproteïnen extraheren uit bacteriële cellen met niet-ionische surfactant-fasepartitionering voor immunologisch onderzoek. Deze methode bereidt N-terminale lipopeptiden voor structurele analyse via MALDI-TOF massaspectrometrie.

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Meer video's verkennen