Metabole Mapping: Kwantitatieve enzym cytochemie en histochemie te bepalen van de activiteit van Dehydrogenases in cellen en weefsels

Deze video laat zien hoe metabolische mapping wordt uitgevoerd. Een procedure om de activiteit van specifieke enzymen, genaamd dehydrogenases, te kwantificeren. De cellen hechten zich aan een microscoopglaasje of een bevroren weefsel.

Decennia geleden ontwikkelden we een hele reeks metabolische mappingtechnieken, toen enzymistochemie genaamd, om activiteit in weefsels en cellen onder de microscoop te detecteren. Echter, metabolisme raakte verouderd tijdens de genetische revolutie aan het einde van de vorige eeuw. Maar nu is metabolisme weer populair.

Kijk bijvoorbeeld naar de kankercellen. Het metabolisme wordt nu beschouwd als een therapeutisch doelwit, en daarom zijn activiteitsbepalingen in cellen en weefsels weer populair. Een belangrijk onderdeel van de reactiebuffer is polyvinylalcohol, of PVA.

Dit wordt opgelost in fosfaatbuffer met een concentratie van 18%PVA is stoffig en giftig bij inademing, dus zorg ervoor dat u PVA weegt onder een afzuiging. Vanwege de hoge PVA-concentratie in de fosfaatbuffer, verwarm de reactiebufferfles op een waterbad terwijl u roert. Zorg ervoor dat de dop los op de fles wordt geschroefd, anders kan de fles exploderen.

Het kan tot 15 minuten duren voordat het PVA volledig is opgelost in de fosfaatbuffer. Als dat het geval is, moet de oplossing transparant zijn met kleine luchtbellen die door het roeren zijn veroorzaakt. De stroperige PVA-oplossing kan met een brede pipet in reactiebufferbuizen worden gepipetteerd.

Bewaar de buisjes op minimaal 40 graden Celsius of hoger om te voorkomen dat de PVA stolt. Een milliliter PVA-oplossing is goed voor ongeveer vier cytospins, of twee weefselbereidingen. Voor de andere componenten van de reactiebuffer, wordt het gele nitroblue tetrazoliumboorchloride, ook wel nitroBT genoemd, opgelost in een mengsel van ethanol en dimethylformamide, terwijl het in een glazen buisje in de Bunsenbrander wordt verwarmd.

De oplossing mag niet koken, anders zal het volume te veel afnemen. Dus laat de buis niet te lang in de vlam staan en schud regelmatig. Houd het na het oplossen op ijs en ga snel door naar de volgende stap, omdat de opgeloste nitroBT snel bederft.

NitroBT is een geel poeder dat op de bodem van het glazen buisje met ethanol en DMF zal liggen als het niet opgelost wordt gehouden. U kunt elke paar keer controleren of de nitroBT is opgelost. De oplossing zal dan geel transparant zijn.

Wanneer het opgelost is, kan de nitroBT worden gepipetteerd in de buisjes met de PVA-oplossing. Roer voorzichtig met een dunne lepel of een dunne spatel om de nitroBT en de buffer te mengen. Doe dit voor alle componenten van de reactiebuffer stap voor stap die in tabel een van de volledige tekst staan vermeld.

Probeer niet te veel luchtbellen te maken tijdens het roeren van de reactiecomponenten in de PVA-oplossing. De truc is om continu te roeren zonder de lepel of spatel uit de oplossing te halen. De elektronendrager, methoxy fenaziniummethylsulfaat, moet worden beschermd tegen licht en als laatste in de reactiebuffer worden opgelost.

De rode kleur van de MPMS is handig om te controleren of alle componenten correct zijn opgelost. Terwijl u de reactiebuffer bereidt en de componenten erin roert, verwarm de schuiven gedurende 50 minuten in een incubator met warm water. Houd een laag waterniveau in de incubatiekamer.

Met het deksel gesloten, blijft de reactieomgeving vochtig. Met het deksel open, zal het water de schuiven op een warme temperatuur houden. Breng de reactiebuffer aan op de cel- of weefselbereidingen met behulp van een glazen pipet.

Maak je geen zorgen over kleine luchtbellen, want deze zullen naar de oppervlakte stromen en zullen de reactie in de cellen of weefsels niet verstoren. Houd het deksel van de incubatiekamer gesloten tijdens de incubatietijd. Dit zorgt ervoor dat de reactie plaatsvindt in een vochtige omgeving om te voorkomen dat de PVA-buffer opdroogt.

De meeste dehydrogenasereacties in metabolische mappingexperimenten vinden plaats bij 37 graden Celsius. Incubeer de schuiven in de reactiebuffer gedurende een vooraf gespecificeerde tijd, die in tabel een van het volledige tekstartikel te vinden is. Men kan gemakkelijk zien of de reactie werkte, omdat de cellen of het weefsel donkerblauw of paars worden, als gevolg van de dehydrogenaseactiviteit.

Die uiteindelijk omzet in kleurloze onoplosbare nitroBT naar de donkerblauwe formazolo, die neerslaat op de plaats van dehydrogenaseactiviteit. De enzymatische reactie wordt gestopt in drie stappen. Ten eerste, moet het overtollige incubatiemedium op een weefsel worden afgetapt.

Ten tweede, moet het incubatiemedium van de microscoopschuiven worden afgewassen met mechanisch wassen in een fosfaatbuffer met een PH van 5,3 bij 60 graden Celsius. Ten derde, moeten de microscoopschuiven 20 minuten in verse fosfaatbuffer met een PH van 5,3 bij 60 graden Celsius worden gelaten. Ten vierde, kan de fosfaatbuffer worden afgespoeld met kraan- en vervolgens gedestilleerd water.

Men kan gemakkelijk zien dat de reactiebuffer afloopt. De lage PH van de stopbuffer helpt bij het stoppen van de dehydrogenasereactie in de cellen. Plaats de schuiven een of twee keer in vers stopbuffer, afhankelijk van hoeveel schuiven u tegelijk verwerkt.

Spoel de schuiven ook met kraanwater af en eindig met gedestilleerd water. Nu kunnen de schuiven worden gedroogd op een schuivenwarmer en worden afgesloten. Droog voorzichtig de achterkant van de schuif af door deze af te vegen en plaats deze op een schuivenwarmer die is voorverwarmd tot 50 tot 60 graden Celsius.

Wanneer de schuiven droog zijn, kunnen een glycerineglyceroplossing en dekglasjes worden gebruikt om de schuiven te sluiten en te bewaren. Bewaar de schuiven in de koelkast tot u verdergaat met beeldverwerving. Dit is een kleurenfotomicrograaf van een representatief weefselsnede op een glasplaatje dat is verwerkt in het experiment dat in deze video wordt getoond.

Dit is een glioblastoma-sectie en lep