Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Het algemene doel van deze 16S rRNA-amplicon-sequentie met hoge doorvoer is om de wereldwijde microbioomsamenstelling te karakteriseren, beginnend met fecale monsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de wereldwijde microbiële samenstelling die verband houdt met vele interessegebieden zoals metabolisme, spijsvertering en darm- en systemische ontsteking. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een telling geeft van aërobe en anaërobe microbiële gemeenschappen die aanwezig zijn in het fecale monster, inclusief die bacteriën die moeilijk te kweken zijn.

Deze methode kan tegelijkertijd grote aantallen fecale monsters verwerken dankzij de snelle colon-vrije verwerkingspomplijn en resulteerde in robuuste en reproduceerbare 16S rRNA-amplicon-sequentie. Voor dit protocol moeten bevroren fecesmonsters worden gebruikt die ongeveer de grootte hebben van een potloodslijper. De monsters moeten worden bewaard in tubes van twee milliliter met de afgesneden punt van het verzamelstaafje.

Voeg negatieve controles toe die bestaan uit staafjes zonder feces en interne duplicaatcontroles en neem monsterduplicaat van het originele stoelmonster om als interne controle te dienen. Begin met het ontdooien van de extractie- en verdunningsoplossingen bij kamertemperatuur samen met de fecesmonsters en controlemonsters. Voeg na het ontdooien 250 microliter extractieoplossing toe aan elke monsterbuis en meng de feces in oplossing met behulp van een vortex.

Introduceer op dit punt negatieve controles met alleen buffer. Verhit vervolgens de monsters gedurende 10 minuten in een kokend waterbad. Voeg na de incubatie in kokend water 250 microliter verdunningsoplossing toe aan elk monster en meng de monsters door middel van een vortex.

Bewaar vervolgens de monsterbuizen bij vier graden Celsius totdat PCR kan worden uitgevoerd. Stel de PCR's in op een pre-PCR werkstation dat is gereinigd van mogelijke DNA-verontreinigingen zoals templates en Amplicons. Label de primers volgens hun barcode en verdun ze in dubbel gedestilleerd water tot een concentratie van 50 micromolar.

Bewaar de voorraden verdunde primer bij min 20 graden Celsius en ontdooi ze volledig voor gebruik. Bereid voor elk monster een 96-wellplaat voor voor 32 reacties in drievoudig. Na opwarming tot kamertemperatuur, verdun aliquots van de voorwaartse primer en de 32 achterwaartse primers tot vijf micromolar voor de PCR.

Bereid vervolgens genoeg basis-PCR-mix voor 100 reacties. Combineer 100 microliter van vijf micromolar voorwaartse primer met één milliliter 2X PCR-mastermix en 400 microliter dubbel gedestilleerd water. Vorm dit mengsel met een vortex en laad vervolgens 15 microliter van dit mengsel in elk van de 96 putjes.

Laad vervolgens sets van drie putjes met elk één microliter van vijf micromolar achterwaartse primer. Laad dus alle 32 verschillende achterwaartse indexen in de plaat. Voeg vervolgens aan elke plaatput vier microliter van het geëxtraheerde DNA-monster toe.

Dit gebeurt op een schone werkbank. Voer nu de PCR uit met een initiële denatureringstijd van drie minuten, gevolgd door 35 cycli met één minuut denatureren en knielen bij 55 graden Celsius en één minuut extensie. Eindig met een laatste extensie van tien minuten.

Nadat de reactie is voltooid, werkt u in een post-PCR toegewijde werkbank. Combineer daar elke set van drievoudige PCR-producten in één buis voor 60 microliter per monster. Voer vervolgens vier microliter van elk monster uit op een ethidiumbromide gekleurde 1% agarosegel.

De positieve Amplicons zullen verschijnen tussen 375 en 425 basenparen. De negatieve controles worden getoond en worden samen met de studie positieve Amplicons verwerkt. Kwantificeer de DNA-concentraties van de positieve reactieproducten volgens de instructies van de fabrikant.

Combineer vervolgens 500 nanogram DNA van elk van de producten in één buis. Vorm dit mengsel met een vortex en draai vervolgens 200 microliter op een 1% gel zoals eerder. Trek nu de banden uit de gel tussen 375 en 425 basenparen.

Bereid vervolgens de bibliotheek voor voor sequencing. Meet de concentratie met behulp van een zeer gevoelige double-stranded DNA detectiekit volgens de instructies van de fabrikant, gevolgd door het gebruik van een zeer gevoelige scheidings- en analysekit. Verdun vervolgens de bibliotheek tot zeven picomolar en combineer deze vier op één met een controlebibliotheek.

Nu de monster klaar is voor sequencing, breng het over naar de sequencingmachine. De beschreven methode voor bibliotheekvoorbereiding van stoelmonsters werd gebruikt om het microbioom te analyseren van gehospitaliseerde patiënten met vermoedelijke infectieuze diarree. Parallel werden stoelmonsters ook onderworpen aan traditionele cultivering in een microbiologielab.

Stoelmonsters van gezonde volwassenen werden gesequenced voor vergelijking. Er werden verschillende negatieve controlemonsters opgenomen, PCR zonder template, PCR op schone en steriele staafjes in extractie- en verdunningsoplossing en PCR op gemengde extractie- en verdunningsoplossingen. Elk hiervan had minder dan 118 totaal aantal reads, waarvan de meeste Mycoplasma taxa waren.

Standaardmonsters hadden gemiddeld meer dan 10.000 reads zonder identificatie van Mycoplasma na kwaliteitscontrole. De consistentie en variabiliteit van de monsters werd gemeten met behulp van 16 stoelmonsters bereid met twee verschillende gebarcodete primers om dus twee verschillende bibliotheken van elk monster te construeren. De helft van de monsters was positief voor Campylobacter, salmonella of Shigella in de traditionele cultiveringstechniek.

Met behulp van de 16S-sequencingresultaten toont een gebiedsplot op het fylogeniveau consistentie tussen bibliotheken gemaakt van dezelfde monsters, onafhankelijk van de traditionele cultiveringsresultaten. Uit dit zwembad van 16 gepaarde monsters toonde een hoofdcoördinatenanalyse aan dat de monsterparen nauw met elkaar overeenkomen en dat de positieve cultuurmonsters een significant verschillende PC1-waarde hadden van de negatieve cultuurmonsters. Verdere analyse van de monsters onthulde dat hoge niveaus van Proteobacteria alleen werden gevonden bij de gehospitaliseerde patiënten.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u tegelijkertijd een groot aantal fecale monsters kunt verwerken met behulp van