Question 1

Hoe creëert een ultracentrifuge een sterker gravitatieveld dan de zwaartekracht van de aarde?

Accepted Answer

Een ultracentrifuge bevat een rotor die met zeer nauwkeurig gecontroleerde snelheden draait, waardoor een sterk gravitatieveld wordt gesimuleerd. Zelfs een kleine rotor bij een relatief lage rotatiesnelheid kan een kracht genereren die duizenden malen sterker is dan het gravitatieveld van de aarde. Dit versterkte veld vergroot de dichtheidsverschillen tussen de deeltjes en het oplosmiddel, waardoor de scheiding wordt versneld.

Question 2

Wat is het verschil tussen stapsgewijze gradiënten en continue gradiënten?

Accepted Answer

Bij stapgradiënten worden vloeistoffen met een afnemende dichtheid zorgvuldig in lagen op elkaar aangebracht, waardoor er duidelijke grenzen ontstaan. Bij continue gradiënten worden vloeistoffen in variërende verhoudingen gemengd, zodat de dichtheid geleidelijk afneemt vanaf de bodem naar boven. Beide typen houden vloeistoffen tijdens centrifugatie in afzonderlijke lagen, geordend naar dichtheid.

Question 3

Waarom is isopyknische dichtheidsgradiëntcentrifugatie de meest gebruikte scheidingsprocedure?

Accepted Answer

Isopyknische dichtheidsgradiëntcentrifugatie is de eenvoudigste en meest gebruikte procedure voor het scheiden van cellulaire organellen met behulp van een stapsgewijze gradiënt. Organellen sedimenteren op basis van hun dichtheid, waarbij dichtere structuren verder naar beneden zakken. Deze eenvoudige aanpak isoleert effectief mitochondriën, kernen en andere cellulaire structuren zonder destructieve kracht.

Question 4

Hoe moeten sucrose-oplossingen worden bereid voor het creëren van een dichtheidsgradiënt?

Accepted Answer

Sucrose wordt in toenemende hoeveelheden toegevoegd, zodat elke oplossing geconcentreerder en dichter is dan de voorgaande. De dichtheden van de oplossingen moeten tussen de waarden van de te scheiden componenten liggen, waarbij de laatste oplossing dichter moet zijn dan de dichtste component. De exacte dichtheden zijn afhankelijk van de specifieke organellen of moleculen die uit het organisme worden geïsoleerd.

Question 5

Waarom wordt voor nucleïnezuren zonale centrifugatie gebruikt in plaats van isopyknische centrifugatie?

Accepted Answer

Omdat nucleïnezuren dichter zijn dan sucrose, kunnen ze met isopyknische centrifugatie niet op een niet-destructieve manier van organellen worden gescheiden. Rate-zonale centrifugatie maakt gebruik van een continue gradiënt en scheidt componenten op basis van sedimentatiesnelheden, die afhankelijk zijn van zowel de dichtheid als de conformatie. Deze techniek behoudt de integriteit van de nucleïnezuren terwijl de scheiding wordt gerealiseerd.

Question 6

Welk gradiëntmedium wordt gebruikt om nucleïnezuurstrengen op basis van dichtheid te scheiden?

Accepted Answer

Cesiumchloride-gradiënten, die gewoonlijk variëren van 1,65 tot 1,75 g/ml, worden gebruikt om strengen nucleïnezuren te scheiden. Sucrose kan niet worden gebruikt omdat het een lagere dichtheid heeft dan nucleïnezuren. Cesiumchloride biedt voldoende dichtheid en een lage viscositeit, waardoor scheiding van DNA-strengen mogelijk is op basis van het guanine-cytosine-gehalte tegenover het adenine-thymine-gehalte.

Question 7

Hoe worden gefractioneerde cellulaire componenten verzameld na ultracentrifugatie?

Accepted Answer

Na centrifugatie vormen de cellulaire componenten afzonderlijke banden tussen de oplossingslagen. Fracties kunnen worden verzameld met een spuit of door de bodem van de buis met een gesteriliseerde naald te doorprikken en de uitstroom in steriele buizen op te vangen. Geïsoleerde componenten kunnen vervolgens bij -80 graden Celsius worden bewaard voor verdere analyse of experimenten met gebruik van chromatografische methoden voor biomolecuulpurificatie.

Dichtheidsgradiënt ultracentrifugeren - Beoordelingsquiz