Name: Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Leer absolute kwantificering van plasma microRNA bij Cynomolgus apen met kwantitatieve RT-qPCR. Deze methode detecteert lage expressieniveaus en maakt vergelijking tussen studies mogelijk voor biomarkeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek heeft specifieke subsidies niet ontvangen financieringsinstanties in de openbare, commerciële of not-for-profit sector.

Alle experimenten werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Daiichi Sankyo Co., Ltd.
1. de monstervoorbereiding
<ol><li>Het verzamelen van bloed (ten minste 0,5 mL) van de femorale ader van cynomolgus apen in EDTA 2K-bevattende buizen. Opmerking: Citraat en heparine zijn niet aanvaardbaar omdat deze anticoagulantia latere PCR14,15 remmen.</li>
	<li>Leg de verzamelde monsters onmiddellijk op ijs en proces voor plasma isolatie binnen 2 uur van collectie.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Breng de bovendrijvende substantie in een 2 mL microtube, gevolgd door centrifugatie bij 16.000 x g bij 4 ° C voor 5 min om cel puin en residuele bloedplaatjes te verwijderen. Opmerking: Kwantificering van miRNAs kan aanzienlijk beïnvloed worden door bloedplaatjes besmetting16.</li>
	<li>Plaats 200 µL aliquots van het supernatans dat in vers 2 mL-slangen en bewaren bij-80 ° C tot gebruik. Opmerking: Een vast volume van elk monster wordt gebruikt voor RNA extractie; Daarom moet het volume van het afgepipetteerde deel exacte.</li>
</ol>2. RNA extractie
<ol><li>Ontdooi bevroren monsters op ijs (uit stap 1.5).<ol>
<li>Houd monster koud op ijs tijdens de RNA extractie. Chill lysis reagens en chloroform op ijs vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 5 volumes (1000 µL) van lysis reagens, met monofasische oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat, aan het monster (200 µL), en meng krachtig door vortexing voor 1 min.</li>
	<li>Voeg 5 µL van 5 nM synthetische Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).</li>
	<li>Voeg 1 deel (200 µL) chloroform, en meng krachtig door de vortexing voor 1 min.</li>
	<li>Houd op ijs gedurende 2 tot 3 minuten, en vervolgens het centrifugeren van de monsters bij 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Overbrengen in de waterfase zorgvuldig een nieuwe microtube. Opmerking: Niet overdragen van de organische fase (rood) of de interfase (wit). Het volume van de waterfase verzameld moet uniform zijn om te voorkomen dat de behandeling van inconsistentie, wat in meer technische variatie resulteert. De gebruikelijke hoeveelheid van de waterfase overgedragen in dit protocol was 650 µL.</li>
	<li>Voeg 1,5 volumes (975 µL) van ethanol, en meng goed door pipetteren omhoog en omlaag.</li>
	<li>Breng het monster in een overeenkomstige kolom en adapter, gevolgd door vacuüm drogen gedurende 3 minuten met behulp van vacuüm variëteiten. Herhaal deze stap voor het verwerken van de resterende oplossing als het monstervolume meer dan 700 µL is. Opmerking: Kolom gebaseerde RNA isolatie is compatibel met vacuüm en centrifugeren methode.</li>
	<li>Voeg 200 µL van ethanol naar de kolom, gevolgd door vacuüm drogen voor 1 min.</li>
	<li>Voeg 800 µL van RWT Buffer naar de kolom, gevolgd door vacuüm drogen gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Voeg 800 µL van RPE Buffer naar de kolom, gevolgd door vacuüm drogen gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Herhaal stap 2.11.</li>
	<li>300 µL van ethanol toevoegen aan de kolom, gevolgd door vacuüm drogen voor 1 min.</li>
	<li>Plaats van de kolom naar een nieuwe microtube en centrifugeer bij 12.000 x g bij kamertemperatuur (15-25 ° C) voor 1 min.</li>
	<li>De kolom overbrengen naar een nieuwe microtube, en voeg 50 µL nuclease-gratis water.</li>
	<li>Staan bij kamertemperatuur (15-25 ° C) voor de 3 min en centrifugeer bij 8.000 × g bij kamertemperatuur (15-25 ° C) gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Opnieuw toepassen als het eluaat naar de kolom.</li>
	<li>Herhaal stap 2.16 en eluaat bij-80 ° C bewaren tot gebruik.</li>
</ol>3. cDNA synthese
<ol><li>Ontdooi bevroren monsters (uit stap 2.18).</li>
	<li>
Bereiden bekende concentratie van synthetische oligonucleotides van RNA die met doel miRNAs corresponderen.
	<ol>
<li>Synthetische RNA oligonucleotide gebruiken voor het genereren van een standaard curve in qPCR. Stockoplossing van 1 x 108 kopie/µL concentratie is geprepareerd voor opslag.</li>
		<li>Verdun de stockoplossing 10-fold voor 1 x 107 kopie/µL (niet vooraf versterkte monsters) of 1 x 105 kopie/µL (vooraf versterkte monsters) werkende oplossing als de hoogste concentratie voor de bouw van de standaard curve. In het algemeen, is een voorgestelde bereik voor de standaard curve concentraties 1 x 10,7 tot en met 1 x 102 kopie/µL (niet vooraf versterkte monsters) of 1 x 10,5 tot en met 1 x 100 kopie/µL (vooraf versterkte monsters).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid multiplex RT primer zwembad door het mengen van gelijke hoeveelheid 20 x RT inleidingen voor doel miRNAs. Nota: Zoals afgebeeld in Figuur 2, een zwembad met maximaal 4 doel miRNAs kan worden gemaakt door het mengen van de 20 x RT inleidingen van elk van de miRNAs in het zwembad. Cel-miR-238 (externe controle) moet worden opgenomen als een van de target miRNAs in elke buis. In geval van minder dan 4 doel miRNAs, toevoegen gelijke hoeveelheden van 1/10 TE buffer in plaats van 20 x RT primer.</li>
	<li>RT reactie mix bereiden: 3 µL RT primer bundelen (uit stap 3.3), 0,15 µL van 100 mM dNTPs met dTTP, 1 µL van reverse-transcriptase (50 U/µL), 1.5 µL 10 x RT buffer, 0,19 µL van RNase remmer (20 U/µL) en 4.16 µL van nuclease-vrij water.</li>
	<li>Mix 10 µL van RT reactie meng met 5 µL van RNA monster (uit stap 3.1) of oligonucleotides (uit stap 3.2) door pipetteren, en broeden op het ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Uitvoeren van omgekeerde transcriptie op een thermische cycler apparaat: 16 ° C gedurende 30 min, 42 ° C gedurende 30 minuten, gevolgd door een laatste reverse-transcriptase inactivatie stap bij 85 ° C gedurende 5 min. winkel omgekeerde getranscribeerde monsters bij-80 ° C tot gebruik.</li>
</ol>4. preamplification (optioneel)
Opmerking: De miRNAs die Cq waarden boven 35 of meer in de daaropvolgende qPCR tonen worden vooraf versterkte.
<ol><li>Ontdooi bevroren monsters (uit stap 3.6).</li>
	<li>Maken 10-fold seriële verdunningen van RT product uit synthetische oligonucleotides voor RNA; 1 x 10,5 tot en met 1 x 100 kopie/µL voor het genereren van standaard curve.</li>
	<li>Voorbereiden op multiplex assay primer zwembad door het mengen van gelijke hoeveelheden (5 µL) van 20 x assay inleidingen doel miRNAs met de eindconcentratie van elke assay primer 200-fold wordt verdund door TE buffer in een eindvolume van 1.000 µL. Opmerking: De assay inleidingen wiens doel miRNAs in latere qPCR zonder voorafgaande versterking, en die voor de cel-miR-238 (externe controle) worden opgespoord kan worden zijn niet opgenomen in de primer zwembad.</li>
	<li>Bereiden van pre amplificatie reactie mix: 12,5 µL van 2 x 6,25 ÂµL van nuclease-gratis water, kant-en-klare preamplification reagens en 3,75 µL van assay primer pool (uit stap 4.3).</li>
	<li>Mix-22,5 µL van pre amplificatie reactie meng met 2.5 µL van omgekeerde getranscribeerde monster (uit stap 4.1) of oligonucleotides (uit stap 4.2) door pipetteren, en broeden op het ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Reactie op een thermische cycler apparaat uitvoeren: 95 ° C gedurende 10 minuten; gevolgd door 12 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 4 minuten vooraf versterkte monsters bij-80 ° C tot gebruik bewaren.</li>
</ol>5. kwantitatieve PCR in real time (qPCR)
<ol><li>Ontdooi bevroren monsters (vanaf stap 3.6 of stap 4.6).</li>
	<li>De monsters 5-voudig verdunnen met steriel water.</li>
	<li>Maak 10-fold seriële verdunningen van de RT-product dat is afgeleid van synthetische oligonucleotides voor RNA; 1 x 10,7 tot en met 1 x 102 kopie/µL (niet vooraf versterkte monsters) of 1 x 10,5 tot en met 1 x 100 kopie/µL (vooraf versterkte monsters) voor het genereren van standaard curven.</li>
	<li>QPCR reactie mix voorbereiden: 10 µL van 2 x kant-en-klare amplificatie reagens, 1 µL van 20 x assay reagens, met vooruit-/ achteruitspoelen PCR primers en sonde overeenkomt met het doel de miRNA, en 7 ÂµL van nuclease-gratis water.</li>
	<li>18 µL van de qPCR reactie mix overbrengen naar de reactie van snelle optische 96-wells-platen, en voeg 2 µL van de verdunde monsters (vanaf stap 5.2 of stap 5.3) in de putjes. Opmerking: Monsters en -normen voor qPCR zijn ingesteld in de duplicaten.</li>
	<li>Afdichting van de plaat met zelfklevende film en kort centrifugeren.</li>
	<li>Reactie op een real-time thermische cycler uitgevoerd: 95 ° C gedurende 20 s, gevolgd door 45 cycles van 95 ° C voor 1 s en 60 ° C gedurende 20 s.</li>
</ol>6. de gegevensanalyse
<ol><li>Berekenen van de ruwe exemplaaraantal van elk monster met behulp van data-analysesoftware die met bijbehorende real-time thermische cycler werkt. Opmerking: Drempel lijn ligt handmatig "1.0" in alle platen in de studie, om te bevestigen de reproduceerbaarheid ten opzichte van hun vales Cq. Niveau van de licht-donkerscheiding is ingesteld op Cq > 40 cycli.</li>
	<li>Het gemiddelde berekenen van de ruwe exemplaaraantal van elk monster van duplicaten.</li>
	<li>De correctiefactor berekenen door een aantal van de kopie van cel-miR-238 in elk monster te delen door het gemiddelde van exemplaaraantal van cel-miR-238 van alle monsters in een overeenkomstige buis. Opmerking: Zoals afgebeeld in Figuur 2, elke buis bevat tot 4 doel miRNAs met inbegrip van cel-miR-238 (externe controle). Daarom wordt correctiefactor berekend voor elke buis met behulp van de overeenkomstige waarde van de cel-miR-238.</li>
	<li>Bereken de gecorrigeerde exemplaaraantal door het verdelen van de gemiddelde ruwe exemplaaraantal van elk monster (uit stap 6.2) door de correctiefactor (uit stap 6.3) voor elk monster.</li>
	<li>De absolute exemplaaraantal berekenen door het aantal aangepaste onbewerkte kopie van elk monster (uit stap 6.4) vermenigvuldigen door de de verdunningsfactor voor elk monster. Opmerking: De verdunningsfactor is "5" in dit protocol, die wordt afgeleid uit stap 5.2.</li>
	<li>Berekenen van de efficiëntie van PCR versterking van de helling van het perceel van de Cq-waarden voor elke seriële verdunning tegen log cDNA concentratie. Opmerking: Formule voor het berekenen van de efficiëntie; E = (10(-1/helling) -1) x 100%.</li>
	<li>Berekenen van de technische variatie met behulp van de Cq-waarden van cel-miR-238 van alle monsters met behulp van de formule E = (2 x amplificatie werkzaamheid)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Opmerking: Stappen 6.5 en 6.7 worden gebruikt voor de kwaliteitsbeoordeling van de procedure.</li>
</ol>

<ol><li>Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+as+a+novel+class+of+biomarkers%3A+a+comprehensive+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature.</a> Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).</li>
<li>Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Noncoding+RNAs+as+Biomarkers+of+Cardiovascular+Disease+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury.</a> Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).</li>
<li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407(2009).</li>
<li>Nassirpour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tubular+injury+microRNA+biomarkers+in+urine%3A+comparison+of+next-generation+sequencing+and+qPCR-based+profiling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms.</a> BMC Genomics. 15, 485(2014).</li>
<li>Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+do+successful+gene+expression+analysis+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">How to do successful gene expression analysis using real-time PCR.</a> Methods. 50 (4), 227-230 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+the+need+for+qPCR+publication+guidelines%3F--The+case+for+MIQE%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE.</a> Methods. 50 (4), 217-226 (2010).</li>
<li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+%28qRT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods. 50 (4), 298-301 (2010).</li>
<li>Thompson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Measurement+of+Cardiac+Injury-Induced+microRNAs+in+Biofluids+across+Multiple+Test+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites.</a> Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).</li>
<li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Analysis+of+Circulating+microRNA+Specific+to+the+Liver%2C+Heart%2C+and+Skeletal+Muscle+of+Cynomolgus+Monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys.</a> Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).</li>
<li>Matsuzaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+novel+serum+biomarkers%2C+miR-1%2C+miR-133a%2C+and+miR-206+for+Limb-girdle+muscular+dystrophy%2C+Facioscapulohumeral+muscular+dystrophy%2C+and+Becker+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Prev.+Med%22%5BJournal%5D)">Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy.</a> Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).</li>
<li>Starkey Lewis, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+potential+markers+of+human+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury.</a> Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%2C+potential+biomarkers+for+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).</li>
<li>Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+Circulating+MicroRNAs+in+Exosomes%2FExtracellular+Vesicles+from+Serum+or+Plasma+by+qRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).</li>
<li>Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+heparin+inhibition+in+circulating+MicroRNAs+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification.</a> Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).</li>
<li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+processing+conditions+substantially+influence+circulating+microRNA+biomarker+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels.</a> PLoS One. 8 (6), e64795(2013).</li>
<li>Serafin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+set+of+endogenous+reference+genes+for+miRNA+expression+studies+in+Parkinson%27s+disease+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples.</a> BMC Res. Notes. 7, 715(2014).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+external+reference+controls%2Fprobes+that+enable+quality+assurance+between+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms.</a> Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).</li>
<li>Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+microRNAs%3A+potential+biomarkers+in+need+of+standardized+reporting%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting.</a> Front Genet. 4, 56(2013).</li>
<li>Malentacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDIA-RNA%3A+second+external+quality+assessment+for+the+pre-analytical+phase+of+blood+samples+used+for+RNA+based+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses.</a> PLoS One. 9 (11), e112293(2014).</li>
<li>Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+circulating+miRNAs+in+plasma%3A+effect+of+preanalytical+and+analytical+parameters+on+their+isolation+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability.</a> J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).</li>
<li>Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+microRNA+profiles+in+rat+models+of+hepatocellular+injury%2C+cholestasis%2C+and+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis.</a> PLoS One. 7 (2), e30250(2012).</li>
<li>Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Hemolysis+on+Cell-Free+microRNA+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers.</a> Front Genet. 4, 94(2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+stem-loop+RT-qPCR+miRNA+expression+profiling+using+minute+amounts+of+input+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (21), e143(2008).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).</li>
<li>Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark.+Res%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomark. Res. 3, 12(2015).</li>
<li>Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+circulating+miRNAs+by+droplet+digital+PCR%3A+comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-based+chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol.+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries.</a> Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).</li>
</ol>

De auteur heeft geen conflict van belang om te vermelden.

Onze uitgebreide beoordeling verstrekt een strengere statistische analyse van de omvang van het dynamisch bereik, die duidelijk aangegeven dat de omvang van variatie tussen de afzonderlijke monsters uiterst verschillende onder de miRNAs getest was. Hoewel deze variaties mogelijk toe te schrijven aan hun kleine hoeveelheden in lichaamsvloeistoffen, opgemerkt moet worden dat deze gegevens niet alleen biologische variaties, maar ook technische variaties weerspiegelen. Allermeest naar de technische variatie kan worden beoord...

Een toenemend aantal studies zijn het verkennen van microRNAs (miRNAs) als biomarkers voor de diagnose en prognose van kanker, of controle en opsporen van andere ziekten in nonclinical en klinische studies1,2,3 . Kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) is één van de meest voorkomende methoden gebruikt ter beoordeling van de individuele doelstelling miRNAs, omdat deze techniek gevoeliger is dan microarray4 en RNA sequencing platformen5 gebaseerde. In het algemeen, wordt miRNA expressie gemeten ten opzichte van een referentie-exemplaar met behulp van de ΔCq methode6. Deze aanpak is geschikt voor het onderzoek van fysiologische veranderingen in gen expressie streefniveau. Relatieve kwantificering van de circulerende miRNAs heeft echter hulpprogramma beperkte vanwege hun kleine hoeveelheden. Daarnaast, maakt technische variatie het moeilijk te vergelijken van de resultaten van verschillende studies, omdat verschillende laboratoria de RT-qPCR experimentele protocollen anders aanpassen, wat leidt tot een inconsistente of zelfs tegenstrijdige van resultaten verschillende studies7.
Met het oog op de hierboven genoemde bezorgdheid, wellicht absolute kwantificering meer geschikt voor de beoordeling van de kleine hoeveelheden miRNAs in lichaamsvloeistoffen. De absolute kwantificering methode gebruikt een standaard curve gegenereerd op basis van bekende concentraties van synthetische oligonucleotides van RNA die identiek in volgorde aan de bijbehorende doelstelling miRNA8 zijn. De gezondheid en het milieu Sciences Institute (HESI) technisch comité op Genomics onlangs uitgevoerde uitgebreide studies te vergelijken van de resultaten van absolute metingen van plasma miRNAs, op meerdere test sites. De resultaten toonden aan dat met behulp van een standaardprotocol voor de absolute kwantificatie van miRNAs vergelijkbare resultaten opgeleverd in de test op meerdere sites9. De RT-qPCR assay methode beschreven in de huidige studie is vrijwel identiek aan het standaard protocol van de HESI, waaronder multiplexed analyse van meerdere miRNA doelen en pre versterking op de steun van de opsporing van lage expressie miRNAs.
In deze studie, een vast volume (200 µL) van de EDTA-plasma bereid uit het bloed verkregen van de femorale ader van bewuste cynomolgus apen (n = 50) gebruikte10was. Het volgende protocol beschrijft de methode voor de bereiding van de monsters van de plasma, winning van miRNA en RT-qPCR, met inbegrip van pre versterking. Wat nog belangrijker is, is aanvullende technische informatie over het protocol opgenomen, zodat de hoeveelheid doel miRNAs in de monsters kan worden gevalideerd in combinatie met een goed opgeleide proces. Eerst was de standaard curve van elke miRNA gevalideerd voor haar individuele registratiebereik, voorafgaand aan de kwantificering in biologische monsters. Ten tweede, de kwaliteit van de huidige methodiek werd uitvoerig geëvalueerd door middel van Cq waarden van een externe regelfunctie (cel-miR-238). Daarom levert dit platform meer informatieve en betrouwbare gegevens voor het vergelijken van de resultaten van verschillende studies of laboratoria.
De profielen van de 8 miRNAs in dit verslag zijn opgenomen als representatieve resultaten van de hier beschreven methode voor de bepaling. Deze miRNAs hebben voorgesteld als potentiële veiligheid biomarkers met weefsel schade aan de lever (miR-122 en miR-192), hart (miR-1, miR-208bis miR-208b en miR-499a), en skeletspieren (miR-133a en miR-206) in knaagdieren en de mens3geassocieerde, 11,12,13.

<table><tbody><tr><td>BD Microtainer tube (K2EDTA)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>365974</td><td>Voor bloedafname</td></tr><tr><td>Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030124359</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&nbsp; 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&nbsp; 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Synthetisch oligonucleotide</td><td>Hokkaido System Science</td><td>-</td><td>Individueel miRNA (0.2 &mu;mol, HPLC-kwaliteit)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA Buffer&nbsp; (pH 8.0)</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td>TE buffer</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>Inhoud in miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>Inhoud in miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent</td><td>QIAGEN</td><td>-</td><td>Inhoud in miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>219600</td><td>ID:MSY0000293, 5 nmol</td></tr><tr><td>SC Adapters</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>S0120</td><td>Voor RNA-extractie</td></tr><tr><td>VacEZor 36 Complete System</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>M3610</td><td>Voor RNA-extractie</td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4351405</td><td>Fast 96-Well Block</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>9700</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000248</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 002245</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 002246</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 002222</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000491</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000510</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000511</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 002290</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 001352</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix (2&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>035-02616</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr></tbody></table>

absolute kwantificering van plasma microrna niveaus bij cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie pcr

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is een van de meest voorkomende methoden voor de beoordeling van de individuele doelstelling miRNAs. MiRNAs over het algemeen gemeten ten opzichte van een referentie-exemplaar. Deze aanpak is geschikt voor de behandeling van fysiologische veranderingen in gen expressie streefniveau. Absolute kwantificering met behulp van betere statistische analyse is echter een uitgebreide beoordeling van gen expressie niveau de voorkeur verdient. Absolute kwantificering is nog steeds niet gemeen gebruiken. Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, met behulp van RT-qPCR met of zonder voorafgaande versterking.
Een vast volume (200 µL) van de EDTA-plasma bereid was uit het bloed verkregen van de femorale ader van bewuste cynomolgus apen (n = 50). Totaal RNA is geëxtraheerd met behulp van commercieel verkrijgbare systeem. Plasma miRNAs werden gekwantificeerd door de sonde gebaseerde RT-qPCR testen waarin miRNA-specifieke vooruit-/ achteruitspoelen PCR primers en sonde. Standaard curven voor absolute kwantificering werden gegenereerd met behulp van commercieel verkrijgbare synthetische oligonucleotides van RNA. Een synthetische cel-miR-238 werd gebruikt als een externe regelfunctie voor normalisatie en kwaliteit beoordeling. De miRNAs die kwantificering cyclus (Cq) waarden boven 35 toonde waren vooraf versterkte voorafgaand aan de qPCR stap.
Onder de 8 miRNAs onderzocht, waren miR-122, miR-133a en miR-192 detecteerbare zonder voorafgaande versterking, terwijl miR-1, miR-206 en miR-499a pre amplificatie vanwege hun lage expressie niveaus vereiste. MiR-208bis en miR-208b waren niet aantoonbaar zelfs na pre versterking. Monster verwerking efficiëntie werd beoordeeld door de Cq-waarden van de puntige cel-miR-238. Bij deze methode assay technische variatie werd geschat op minder dan 3-voudig en de ondergrens van kwantificering (Ondergrens) was 102 kopie/µL, voor de meeste van de onderzochte miRNAs.
Dit protocol biedt een betere schatting van de hoeveelheid plasma miRNAs, en kwaliteitsbeoordeling van de overeenkomstige gegevens van verschillende studies. Gelet op dat het geringe aantal miRNAs in lichaamsvloeistoffen, pre versterking is nuttig ter verbetering van de opsporing van slecht uitgedrukt miRNAs.

Workflow van miRNA assay door RT-qPCR en kwaliteit assessment Figuur 1 toont de workflow van miRNA assay van bloedmonsters die met behulp van qPCR10. De kwaliteit van de experimenten kan worden geverifieerd door het opnemen van cel-miR-238 als een externe controle. Dit zal onthullen technische variaties in RNA extractie en de daaropvolgende RT-qPCR verwerkt. In deze studie was de gemiddelde ± SD van de Cq-w...

Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Het algemene doel van deze procedure is om de absolute niveaus van Plasma MicroRNA's te meten met behulp van Kwantitatieve Real-time Reverse Transcriptie PCR. Deze methode kan helpen bij het beoordelen van de hoeveelheid plasma microRNA's, zelfs als hun expressieniveau laag is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gemeten gegevens kunnen worden vergeleken met andere uit verschillende studies of laboratoria.De implicaties van deze techniek breiden zich uit naar de monsters van andere soorten omdat er een standaardcurve kan worden gegenereerd door synthetisch RNA of het nucleotide te gebruiken. Deze methode kan inzicht geven in translationeel onderzoek om veelbelovende veiligheidsbiomarkers te onderzoeken. Ontdooi eerst de bevroren plasmamonsters verkregen uit de femorale ader van de Cynomolgus-aap op ijs.Breng het Lysis-reagens in Chloorform op ijs voor koeling vóór RNA-extractie. Voeg vervolgens 1.000 microliter Lysis-reagens toe aan 200 microliter van het monster. En vortex gedurende één minuut om een goede menging te garanderen.Voeg vervolgens vijf microliter van vijf nanomolar synthetisch Caenorhabditis elegans microRNA en 200 microliter chloroform toe aan het

absolute-quantification-plasma-microrna-levels-cynomolgus-monkeys

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA's in de microglia.

Detectie van microRNA&#39;s in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Hier presenteren we een protocol voor de detectie van microRNA expressie in het peritoneale membraan van de ratten met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie-polymerase kettingreactie. Deze methode is geschikt voor het bestuderen van het microRNA-expressieprofiel in het peritoneale membraan in verschillende pathologische omstandigheden.

Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.

Digitale PCR voor het kwantificeren van de circulerende MicroRNAs in acuut myocardinfarct en hart-en vaatziekten

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

We beschrijven een methode voor het evalueren van de microRNA-expressie in de nieren van muizen met eenzijdige ureterale obstructie (UUO) door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie. Dit protocol is geschikt voor het bestuderen van niermicroRNA expressieprofielen bij muizen met UUO en in de context van andere pathologische aandoeningen.

Kwantitatieve real-time PCR-evaluatie van microRNA-expressies in muisnier met eenzijdige ureterale obstructie

Leer absolute kwantificering van plasma microRNA bij Cynomolgus apen met kwantitatieve RT-qPCR. Deze methode detecteert lage expressieniveaus en maakt vergelijking tussen studies mogelijk voor biomarkeronderzoek.

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR (Video) | JoVE Journal

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

Meer video's verkennen