Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

Het algemene doel van deze procedure is om de absolute niveaus van Plasma MicroRNA's te meten met behulp van Kwantitatieve Real-time Reverse Transcriptie PCR. Deze methode kan helpen bij het beoordelen van de hoeveelheid plasma microRNA's, zelfs als hun expressieniveau laag is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gemeten gegevens kunnen worden vergeleken met andere uit verschillende studies of laboratoria.

De implicaties van deze techniek breiden zich uit naar de monsters van andere soorten omdat er een standaardcurve kan worden gegenereerd door synthetisch RNA of het nucleotide te gebruiken. Deze methode kan inzicht geven in translationeel onderzoek om veelbelovende veiligheidsbiomarkers te onderzoeken. Ontdooi eerst de bevroren plasmamonsters verkregen uit de femorale ader van de Cynomolgus-aap op ijs.

Breng het Lysis-reagens in Chloorform op ijs voor koeling vóór RNA-extractie. Voeg vervolgens 1.000 microliter Lysis-reagens toe aan 200 microliter van het monster. En vortex gedurende één minuut om een goede menging te garanderen.

Voeg vervolgens vijf microliter van vijf nanomolar synthetisch Caenorhabditis elegans microRNA en 200 microliter chloroform toe aan het monster. Vortex het monster gedurende één minuut om goed te mengen. Plaats vervolgens het monster gedurende twee tot drie minuten op ijs.

Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 G bij vier graden Celsius. Breng vervolgens voorzichtig 650 microliter van de waterige fase over naar een nieuwe microbuis. Voeg vervolgens 975 microliter ethanol toe aan de waterige fase en pipet meerdere keren om volledige menging te garanderen.

Breng het monster over in de bijbehorende kolom en adapter en droog vervolgens gedurende drie minuten met behulp van vacuümmanifolds. Voeg vervolgens 200 microliter ethanol toe aan de kolom en droog gedurende één minuut in vacuüm. Voeg na het vacuüm drogen 800 microliter RWT-buffer toe aan de kolom en droog opnieuw in vacuüm gedurende twee minuten.

Voeg vervolgens 800 microliter RPE-buffer toe aan de kolom en droog gedurende twee minuten in vacuüm. Voeg de RPE-buffer twee keer toe, gevolgd door vacuüm drogen. Voeg vervolgens 300 microliter ethanol toe aan de kolom.

Na het toevoegen van ethanol, droog gedurende één minuut in vacuüm. Breng vervolgens de kolom over in een nieuwe microbuis en centrifugeer hetzelfde bij 12.000 G bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Breng na centrifugatie de kolom over in een nieuwe microbuis en voeg 50 microliter Nuclease-vrij water toe.

Laat de kolom drie minuten bij kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens bij 8.000 G bij kamertemperatuur gedurende één minuut. Bewaar tenslotte het eluaat bij minuus 80 graden Celsius tot gebruik. Om een synthetisch RNA Oligonucleotide Concentratie voor te bereiden die overeenkomt met de doel-microRNA, verdunt u de stockoplossing 10-voudig om een werkoplossing met de hoogste concentratie te bereiken om de standaardcurven uit te plotten.

Vervolgens, om een multiplex pool van reverse transcriptie primers te vormen, meng gelijke volumes van de 20-sterkte primers voor doel-microRNA's. Bereid vervolgens de reverse transcriptie reactiemix voor. Voeg vervolgens 10 microliter reverse transcriptie reactiemix toe aan vijf microliter RNA-monster.

Meng de twee door meerdere keren te pipetten. Bewaar vervolgens het mengsel gedurende vijf minuten op ijs. Nadat het monster in de Thermocycler is geplaatst, start u de cyclus.

Zodra het programma is voltooid, bewaar het omgekeerd getranscribeerd monster bij minuus 80 graden Celsius. Om de multiplex assay primer pool te vormen, voegt u gelijke volumes van vijf microliter assay-primers toe die overeenkomen met doel-microRNA's in de buis met Tris-EDTA buffer in het eindvolume van 1.000 microliters. Bereid vervolgens de pre-amplificatiereactiemix voor.

Zodra de reactiemix klaar is, brengt u 22,5 microliter pre-amplificatiereactiemix over in twee punt vijf microliter omgekeerd getransciberend monster. Pipet vervolgens om het monster en de pre-amplificatie mastermix grondig te mengen en incubeer op ijs gedurende vijf minuten en laat vervolgens de PCR-buisjes in de Thermocycler staan en start de run. Zodra het programma is voltooid, brengt u alle monsters over bij minuus 80 graden Celsius.

Na het ontdooien van de vooraf geamplificeerde of niet-vooraf geamplificeerde monsters, verdunt u deze vijfvoudig met steriel water. Om de standaardcurve te genereren, voert u 10-voudige seriële verdunning uit van de monsters afgeleid van synthetische RNA oligonucleotiden. Bereid vervolgens de kwantitatieve PCR-reactiemix voor in een buis op ijs.

Voeg vervolgens 18 microliter van de kwantitatieve PCR-reactiemix toe aan de Fast Optical 96-Well Reactieplaten. Voeg vervolgens twee microliter van de verdunde monsters toe aan de putjes. Sluit de plaat af met kleeffolie en centrifugeer het monster kort gedurende 15 seconden bij 500 G.

Start vervolgens het real-time Thermocycler-programma. Gebruik een SDS-softwareversie 2.4 die functioneert met de bijbehorende real-time thermische cyclus om het ruwe kopienummer van elk monster te berekenen. Bereken vervolgens het absolute kopienummer vanuit het ruwe kopienummer met behulp van Excel-software.

De amplificatie-efficiëntie van miR-122, miR-192 en miR-133a werd geanalyseerd door standaardcurves uit te plotten, wat de relatie tussen de log-concentratie versus de kwantificeringscyclus verklaart voor de niet-vooraf geamplificeerde monsters. De standaardcurven voor miR-122, miR-192 en miR-133a tonen een lineaire relatie tussen kwantificeringscycli en log-concentratie van de monsters. Vervolgens werd de amplificatie-efficiëntie van miR-1, miR-499a en miR-206 geanalyseerd door standaardcurven voor vooraf geamplificeerde monsters uit te plotten.

Om de amplificatie-efficiëntie te analyseren, werd de helling berekend met behulp van lineaire regressie. De helling in standaardcurve A toont de afwezigheid