Name: Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Leer een geoptimaliseerd Western blotting protocol voor hematopoëtische stamcellen met slechts 500 cellen. Deze methode vermindert dierengebruik en maakt betrouwbare eiwitdetectie in zeldzame celpopulaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

National Institutes of Health verlenen R01 CA149976 (N.A.S) dit werk ondersteund.

Alle procedures moeten worden uitgevoerd overeenkomstig de institutionele dierlijke gebruik en zorg richtsnoeren. De procedure werd ontwikkeld voor de analyse van lymfkliertest hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSCs en HPs), maar kan worden aangepast voor de analyse van andere cel populaties.
1. Stroom Cytometry Isolatievan lymfkliertest HSCs en HPs
<ol><li>Oogst lymfkliertest beenmergcellen zoals beschreven in de literatuur6. Opmerking: In de gegevens in Figuur 1 en Figuur 2, beenmerg werd geoogst van C57BL/6J muizen.</li>
	<li>Uitvoert afkomst uitputting van beenmergcellen met behulp van een muis lineage uitputting kit, na instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Incubeer de cellen met antistoffen tegen de cel oppervlakte markers van belang als beschreven7. In de experimenten weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2, worden antilichamen tegen Sca-1, Kit, Flt3 en geslacht (Lin) markeringen Mac1 Gr1, CD3e, B220 en Ter119 gebruikt.</li>
	<li>Sorteren van 2.000-20,000 Lin- Sca1+Kit+ Flt3- cellen (HSCs) of Lin-Sca1-Kit+ cellen (HPs) 1,5 mL Eppendorf buizen met 0,1 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% foetale runderen serum (FBS). Opmerking: Voor de gegevensset die wordt getoond in Figuur 1 en Figuur 2, cellen wordt gesorteerd met behulp van een Flow Cytometer met een mondstuk 70 µM. Het maximale collectie volume is 1,4 mL.</li>
</ol>2. de monstervoorbereiding
Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang. Het monster zorgvuldig worden verwerkt. Bij het verwijderen van de bovendrijvende substantie, Wees zeer voorzichtig niet te verstoren, de cel-pellet.
<ol><li>Centrifuge de 1,5 mL tubes met gesorteerde cellen in een swingende emmer rotor bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min. verwijderen alle maar ongeveer 100 µL van het supernatans dat uit de cel pellet heel voorzichtig met behulp van een pipet en een 20 µL Pipetteer tip. De pellet niet storen.<ol>
<li>Als het monster minder dan 5000 cellen bevat, en het totale volume van de gesorteerde steekproef lager dan 0,2 mL is, overbrengen in de cellen eerst laag bindende 0,2 mL PCR buizen voor centrifugeren.</li>
		<li>Als monster minder dan 5000 cellen bevat en volume meer dan 0,2 mL is, draaien de cellen naar beneden met een centrifuge bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min, en verwijdert alle maar 200 µL van het supernatans. Resuspendeer de Ingehuld cellen in de resterende 200 µL van supernatans, vervolgens de cellen overbrengen in de 0,2 mL PCR buizen en spin naar beneden weer. Verwijder alle maar 20-30 µL van de pellet na de tweede spin en resuspendeer de cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in de bovenstaande links in de buis. Zo nodig typt u extra PBS in 2% FBS/PBS (u kunt ook 2% bovien serumalbumine (BSA) / PBS, of PBS alleen) tot een verwachte concentratie 5 x104 tot 5 x 105 cellen/mL. Opmerking: Gebruik de cel telt verzameld door cytometry te schatten van het volume dat wordt gebruikt om op te schorten van cellen.</li>
	<li>Gebruik 2-5 µL van het opnieuw gesuspendeerde cellen om te bepalen van de concentratie van een nauwkeurige cel met behulp van een geautomatiseerde cel teller (na instructies van de fabrikant) of een hemocytometer-9.</li>
	<li>Breng een hoeveelheid opnieuw zwevende cellen met het gewenste aantal cellen nieuwe 1,5 mL buizen. Voor het experiment in Figuur 1, werden 2000, 1000, 500 HSCs of HPs overgedragen. Het gewenste aantal cellen afhankelijk van de sterkte van het signaal verkregen door westelijke vlek en empirisch wordt bepaald. Met behulp van een 20 µL of 100 µL Eppendorf Pipetteer tip overdraagt.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen in een swingende rotor van de emmer bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min.</li>
	<li>Voor het genereren van 100 x stamoplossingen, ontbinden proteasoom en phosphatase inhibitors in DMSO volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>2 x Laemmli monster buffer voor te bereiden door de 4 x Laemmli monster buffer geleverd door de fabrikant met een equivalente hoeveelheid gedestilleerd water verdunnen. Het toevoegen van een passend bedrag van de 100 x voorraad van proteasoom en fosfatase remmers te verkrijgen van een eindconcentratie van 2 x remmers in 2 x Laemmli monster buffer. Nota: De 2 x Laemmli monster buffer kan op voorhand worden gemaakt, maar het proteasoom en phosphatase inhibitors moeten worden toegevoegd onmiddellijk voordat het toevoegen van de 2 x Laemmli monster buffer (plus remmers) naar de cel pellet om lyse de cellen, zoals beschreven in de volgende stap.</li>
	<li>Zorgvuldig verwijderen van een deel van het supernatans van de cel pellet, en naar het supernatant resterende in de buis met de cel pellet, voeg een gelijk volume 2 x Laemmli monster buffer plus proteasoom en phosphatase inhibitors om een eindconcentratie van 500 cellen/µL in 1 x Laemmli monster buffer. Opmerking: bijvoorbeeld, als u transfer 2.000 cellen in een totaal volume van 20 µL van een buis in stap 2.5, na centrifugeren van de cellen (stap 2.6), moet u 18 µL van het supernatans verwijderen uit de pellet, en naar de 2 µL van het supernatans dat is overgebleven Voeg een gelijk volume (2 µL) 2 x Laemmli monster buffer om een eindconcentratie van 500 cellen/µL in 1 x Laemmli monster buffer.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet voor het genereren van de lysate zo spoedig mogelijk. Op dit punt, de monsters kunnen onmiddellijk worden electrophoresed door SDS-pagina gelen, of kan worden module in vloeistof N2 bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>3. elektroforese
<ol><li>Verwarm de lysates in een blok van warmte bij 95 ° C of in kokend water gedurende 5 minuten.</li>
	<li>1-40 µL van het (met van 500 tot 20.000 cel equivalenten) lysates electrophorese door SDS-pagina gelen op 100V met behulp van standaard protocollen10. Opmerking: Het volume van lysate geladen in de gel wordt bepaald door het aantal cellen die nodig zijn voor het genereren van het wenselijk signaal en zal afhangen van de overvloed van de proteïne van belang, en de kwaliteit van het antilichaam. De gegevens in Figuur 1 werden verkregen met 2.000, 1000 en 500 cel equivalenten van lysate. De breedte van de put moet worden in het bereik van 3 mm tot 1,5 mm. 1,5 mm tanden kunnen worden gesneden uit een commercieel beschikbare kam met brede tanden met behulp van schaar.</li>
</ol>4. overdracht en blokkeren
Opmerking: Voer een westelijke vlek na standaardprotocollen11. De stappen worden hier kort beschreven:
<ol><li>Voorbehandeling een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan met methanol voor 10 s, dan wassen het membraan kort met gedestilleerd water.</li>
	<li>Het eiwit van de SDS-pagina gel overbrengen naar de membraan volgens de instructies in de handleiding geleverd door de fabrikant van het apparaat van de overdracht.</li>
	<li>Na overdracht, het blokkeren van het membraan met 2 mL bovien serumalbumine (BSA) van 5% in PBST (PBS met 0,1% Tween) overnachting bij 4 ° C na standaardprotocollen11.</li>
</ol>5. antilichaam Labeling
<ol><li>Incubeer het membraan met antilichamen op een shaker's nachts bij 4 ° C met behulp van antilichaam verdunningen aanbevolen door de leverancier. Opmerking: In de tabel van materialen, antistoffen, die we hebben gevalideerd voor HPs, HSCs en de bijbehorende antilichaam verdunningen, worden weergegeven. Het antilichaam labelen met behulp van standaardprocedures8uitvoeren</li>
</ol>6. detectie
<ol><li>Wassen het membraan 3 keer, 5 min. voor elke wassen in PBST bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Laat het membraan met 2 mL Verbeterde Chemiluminescentie buffer voor 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken. Detecteren van de signalen met behulp van een imaging systeem na de fabrikant instructies of autoradiografie film en film processor.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflict te verklaren.

Westelijke bevlekken is een gemeenschappelijke techniek voor het opsporen van specifieke proteïnen en de activering van signaalroutes in weefsels of cellen. Door de invoering van kleine aanpassingen aan een veelgebruikte procedure, konden we 15 verschillende eiwitten (Tabel of Materials) routinematig detecteren in 15.000 HSCs, en in sommige gevallen in zo weinig als 500 HSCs. The most kritische stappen in dit protocol zijn: 1) nauwkeurig de cellen tellen, 2) het aantal overdrachten tussen buizen minimali...

Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn zichzelf vernieuwende cellen die aanleiding tot alle bloed geslachten geven kunnen. Ze zijn relatief zeldzaam cellen in het beenmerg, waardoor biochemische analysen moeilijk. Benaderingen die geschikt zijn voor het analyseren van zeldzame cellen, zoals de stroom cytometry, zijn uiterst nuttig voor het kwantificeren van de relatieve hoeveelheden van cel oppervlakte markeringen en intracellulaire eiwitten. Echter, de analyse van intracellulaire eiwitten vereist het gebruik van cel permeabilization procedures antilichaam-toegang inschakelen, en niet alle cel oppervlakte epitopes overleven deze procedures1,2. Bovendien antilichamen die onderscheid tussen verschillende isoforms of decolleté eiwitproducten maken zijn vaak niet beschikbaar voor stroom cytometry en daarom onderzoekers nog steeds rekenen op Western blots voor bepaalde soorten analyses.
Westelijke vlekkenanalyse van cel lysates is een routineprocedure in de meeste laboratoria. Cellen onder inheemse voorwaarden die de epitopes van cel-oppervlakte molecules bewaren kunnen worden gezuiverd, en cel lysates kan vervolgens worden voorbereid en geanalyseerd. De analyse van eiwitten in zeldzame primaire cel populaties door Western blot kunt echter verplicht stellen grote aantallen dieren om voldoende cellen euthanizing. Door kleine aanpassingen aan de verschillende stappen, was een conventionele westelijke bevlekkende protocol kundig voor speurder eiwitten in relatief kleine aantallen HSCs (500-15.000, afhankelijk van de proteïne van belang). De aanpassingen omvatten nauwkeurig tellen de cellen, zorgvuldig hanteren de cel pellet, vermindering van de overdracht van cellen tussen buizen tot een minimum beperken van het verlies van de cel, en een bepaald aantal cellen met een geconcentreerde laden lysing buffer met proteasoom en phosphatase inhibitors. Vele gepubliceerde rapporten omvatten Western blots verkregen met 20.000 of meer HSCs3,4,5,6,7; deze eenvoudige procedure zal het verminderen van het aantal cellen en proefdieren nodig voor de productie van gelijkwaardige gegevens door tussen 4 en 40-voudige. Het protocol is ontworpen voor het normaliseren van resultaten op basis van de per cel, in plaats van aan een interne controle. Hierdoor kan de detectie van algemene verlagingen eiwitniveaus die worden over het hoofd gezien kunnen als gegevens worden genormaliseerd naar een interne controle. Het belang van normalisatie op basis van de per cel werd beschreven voor de analyse van gen expressie gegevens8, en hetzelfde principe geldt voor het kwantificeren van de eiwitten door westelijke vlek. Dit geoptimaliseerd protocol moet zinvol zijn voor iedereen die voor het analyseren van kleine aantallen cellen.

<table><tbody><tr><td>sodium dodecylsulfaat (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% Acrylamidel Bis-oplossing</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>mini-protean 3 kam</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Overdrachtssysteem</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td>overdracht</td></tr><tr><td>PowerPac HC-voeding</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>elektroforese</td></tr><tr><td>Beeldvormingssysteem</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>signaaldetectie</td></tr><tr><td>4x Laemmli-monsterbuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS-elektroforesebuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>elektroforese</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF-overdrachtskit, voor 40 blots</td><td>Bio-Rad</td><td>1704272</td><td>overdracht</td></tr><tr><td>Protease-remmercocktail</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Fosfatase-remmercocktail</td><td>Gold Biotechnology</td><td>GB-450-1</td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>Cell signaling</td><td>2469</td><td>WB-antilichaam, gevalideerd in 1000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): Fig2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>Cell signaling</td><td>4858</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 1000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): Fig2</td></tr><tr><td>actine(HRP-geconjugeerd)</td><td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 500 cellen antilichaamconcentratie: 1:5000 referentie(figuur): Fig1, Fig2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>Cell Signaling</td><td>2317</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>WB-antilichaam, gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>2855</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Cell Signaling</td><td>4877</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Cell Signaling</td><td>9188</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>2983</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>5536</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>actine</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:3000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>lijnuitputtingskit (muis)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>zuivering van hematopoëtische stamcellen en voorlopercellen</td></tr><tr><td>LS-kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>zuivering van hematopoëtische stamcellen en voorlopercellen</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>fosforyleringsstimulatie</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit-antilichaam</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>celsortering</td></tr><tr><td>anti-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>celsortering</td></tr><tr><td>anti-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>celsortering</td></tr><tr><td>anti-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>celsortering</td></tr><tr><td>anti-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>celsortering</td></tr><tr><td>anti-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>celsortering</td></tr><tr><td>Spacer-platen met geïnte

een western blotting protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn zeldzame cellen, met de muis het beenmerg met slechts 25.000 ~ fenotypische lange termijn repopulatie HSCs. Een westelijke bevlekkende protocol werd geoptimaliseerd en geschikt voor de analyse van kleine aantallen HSCs (500-15.000 cellen). Fenotypische HSCs werden gezuiverd, nauwkeurig geteld en direct lysed in Laemmli monster buffer. Lysates met gelijke aantallen cellen werden geanalyseerd door elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-pagina), en de vlek was bereide en verwerkte na standaard Westelijke Bevlekkende Protocollen. Met behulp van dit protocol, 2.000-5.000 HSCs kan routinematig worden geanalyseerd, en in sommige gevallen kunnen gegevens worden verkregen uit zo weinig als 500 cellen, in vergelijking met de cellen van de 20.000 tot 40.000 gemeld in de meeste publicaties. Dit protocol gelden over het algemeen andere hematopoietische cellen en maakt de routinematige analyse van kleine aantallen cellen met behulp van standaard laboratorium procedures.

Representatieve resultaten uit 500-2000 zuivere HSCs en HPs worden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. Het signaal van de β-actine in Figuur 1 uit zo weinig als 500 HSCs kan worden herkend en HPs gezuiverd uit het beenmerg van een muis. Merk op dat het laden van de lysates in 1,5 mm wells geproduceerd een veel sterker signaal van 500 HPs dan laden in 3.0 mm wells. Figuur 2</stro...

Een standaard Western blotting protocol is geoptimaliseerd voor het analyseren van slechts 500 hematopoietische stamcellen of voorlopercellen. Optimalisatie houdt zorgvuldige behandeling van het monster van de cel, beperking van de overdracht tussen buizen en direct het lysing van cellen in Laemmli monster buffer.

Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Het hoofddoel van dit western blotting-protocol is om western blots uit te voeren op kleine aantallen cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het hematopoëtische stamcelveld, zoals de aanwezigheid of abundantie van specifieke eiwitten of activering van signaalroutes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minder dan 20.000 cellen vereist, waardoor er minder dieren nodig zijn om zeldzame populaties primaire cellen te analyseren.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we op zoek waren naar manieren om het aantal muizen dat we nodig hadden voor hematopoëtische stamcelanalyses te verminderen. De procedure wordt gedemonstreerd door Xiongwei Cai, een postdoc uit mijn laboratorium. Gebruik een schommelende emmer rotor om 1,5 milliliter buisjes met gesorteerd hematopoëtisch stam- en progenitorcellen te centrifugeren bij 500 maal de zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Zodra de centrifugatie voorbij is, gooit u alle behalve 100 microliter supernatant weg, zonder de celpellet te verstoren. Als er minder dan 5.000 cellen zijn, en het volume van het gesorteerd monster minder dan 0,2 milliliter i

a-western-blotting-protocol-for-small-numbers-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

Hier presenteren we een protocol om monsters met een laag aantal cellen voor te bereiden op transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse.

Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.

Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

Dit protocol maakt het mogelijk om quiescente menselijke hematopoëtische stamcellen in vitro te behouden door het micromilieu van het beenmerg na te bootsen met behulp van overvloedige vetzuren, cholesterol, lagere concentraties cytokinen en hypoxie.

Een kweekmethode om rustgevende menselijke hematopoëtische stamcellen te behouden

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

We presenteren een stapsgewijs protocol voor de isolatie van lange termijn hematopoëtische stamcellen (LT-HSCs) en korte termijn HSC's (ST-HSCs) met behulp van het Hoxb5 reporter systeem.

Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Hier hebben we in vivo osteo-organoïden ontwikkeld die worden getriggerd door botmorfogenetische eiwit-2-geladen gelatineschars om therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen te oogsten voor de reconstructie van een beschadigd hematopoëtisch en immuunsysteem. Over het algemeen kan deze aanpak een veelbelovende celbron zijn voor celtherapieën.

In vivo osteo-organoïde benadering voor het oogsten van therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen

Leer een geoptimaliseerd Western blotting protocol voor hematopoëtische stamcellen met slechts 500 cellen. Deze methode vermindert dierengebruik en maakt betrouwbare eiwitdetectie in zeldzame celpopulaties mogelijk.

Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Meer video's verkennen