Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen
22 augustus 2018
Een standaard Western blotting protocol is geoptimaliseerd voor het analyseren van slechts 500 hematopoietische stamcellen of voorlopercellen. Optimalisatie houdt zorgvuldige behandeling van het monster van de cel, beperking van de overdracht tussen buizen en direct het lysing van cellen in Laemmli monster buffer.
Het hoofddoel van dit western blotting-protocol is om western blots uit te voeren op kleine aantallen cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het hematopoëtische stamcelveld, zoals de aanwezigheid of abundantie van specifieke eiwitten of activering van signaalroutes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minder dan 20.000 cellen vereist, waardoor er minder dieren nodig zijn om zeldzame populaties primaire cellen te analyseren.
We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we op zoek waren naar manieren om het aantal muizen dat we nodig hadden voor hematopoëtische stamcelanalyses te verminderen. De procedure wordt gedemonstreerd door Xiongwei Cai, een postdoc uit mijn laboratorium. Gebruik een schommelende emmer rotor om 1,5 milliliter buisjes met gesorteerd hematopoëtisch stam- en progenitorcellen te centrifugeren bij 500 maal de zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Zodra de centrifugatie voorbij is, gooit u alle behalve 100 microliter supernatant weg, zonder de celpellet te verstoren. Als er minder dan 5.000 cellen zijn, en het volume van het gesorteerd monster minder dan 0,2 milliliter is, draagt u de cellen eerst over naar lage bindings-PCR-buisjes van 0,2 milliliter voor centrifugatie. Als er echter minder dan 5.000 cellen zijn, maar het volume van het gesorteerd monster meer dan 0,2 milliliter is, centrifugeert u de cellen dan bij 500 maal de zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Na centrifugatie, gooit u alle behalve 200 microliter supernatant weg. Plaats vervolgens de pellet en de resterende 200 microliter supernatant opnieuw. Breng vervolgens de celsuspensie over naar PCR-buisjes van 0,2 milliliter en centrifugeer opnieuw.
Plaats vervolgens de pellet opnieuw in 20 tot 30 microliter supernatant en gooit u de rest weg. Voeg indien nodig fosfaatgebufferd zout in 2% foetaal bovien serum of 2% bovien serum albumine toe aan de opnieuw gesuspendeerde cellen. Gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller om de cellulaire concentratie te bepalen met behulp van twee tot vijf microliter opnieuw gesuspendeerde cellen.
Gebruik vervolgens een 20 of 100 microliter pipettip om een volume van 500, 1.000 en 2.000 hematopoëtische stam- en progenitorcellen over te brengen naar nieuwe 1,5 milliliter buisjes. Gebruik een schommelende emmer rotor om de cellen te centrifugeren bij vier graden Celsius bij 500 maal de zwaartekracht gedurende vijf minuten. Volg vervolgens de instructies van de fabrikant om fosfatase en proteasoomremmer en DMSO op te lossen om een 100-voudige stockoplossing te bereiden.
Verdun vervolgens de viervoudige Laemmli-steekbuffer met equivalente volumes gedistilleerd water om een tweevoudige Laemmli-steekbuffer te maken. Voeg vervolgens geschikte hoeveelheden van de 100-voudige stockoplossing van fosfatase en proteasoomremmer toe om de uiteindelijke concentratie aan te passen tot tweevoudige remmers, en tweevoudige Laemmli-steekbuffer. Pas het volume van het resterende supernatant in de buis aan zodat het toevoegen van gelijke volumes van tweevoudig Laemmli-buffer samen met de fosfatase en proteasoomremmer een uiteindelijke concentratie van 500 cellen per microliter en eenvoudige Laemmli-buffer zal bereiken.
En schud vervolgens opnieuw op om het lysaat te vormen. Verwarm de monsterlysaten vóór het laden van de gel gedurende vijf minuten in een hitteblok op 95 graden Celsius. Gebruik standaard protocollen voor elektroforese een tot 40 microliter lysaat, equivalent aan 500 tot 20.000 cellen, door SDS-pagina bij 100 volt.
Na het behandelen van het polyvinylideenmembraan met methanol gedurende enkele seconden, spoelt u het membraan kort met gedistilleerd water. Breng vervolgens het eiwit van de gel over naar het membraan volgens de instructies van de fabrikant van het transferapparaat. Na overdracht, blokkeer het membraan met twee milliliter 2% bovien serum albumine en fosfaatgebufferd zout met 0,1% Tween gedurende een nacht bij vier graden Celsius volgens standaard protocollen.
Na het blokkeren van het membraan, incubeer het dan met verdunde antilichamen gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Was vervolgens het membraan drie keer met fosfaatgebufferd zout met 0,1% Tween 20 gedurende vijf minuten elk bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens het membraan met twee milliliter verbeterde chemiluminescentie buffer gedurende één minuut bij kamertemperatuur.
Detecteer de signalen met behulp van een beeldvormingssysteem. Om de bèta-actinesignalen te vergelijken, werden lysaten bereid uit urinehematopoietische stam- en progenitorcellen en onderworpen aan westelijke plotanalyse. Het is duidelijk uit de aminoblokkaart dat er een afname in bèta-actine signaal is van de lysaten bereid uit 2.000 tot 500 hematopoëtische progenitor- en stamcellen geladen in 1,5 millimeter putjes op een 12% SDS-pagina gel.
Verder, om de bèta-actinesignalen te vergelijken verkregen uit verschillende putgroottes gegoten op de gel. Lysaten werden geladen in 1,5 en drie millimeter putjes op de gel en vervolgens onderworpen aan westelijke plotanalyse. De blot toont aan dat het bèta-actine signaal verkregen uit het lysaat bereid uit 500 hematopoëtische progenitors geladen in een 1,5 millimeter put veel sterker is dan wanneer geladen in een drie millimeter put.
Vervolgens, om de signalen voor eukaryotisch initiatiefactor 4G, actine en fosforylering van ribosomaal eiwit S6 in reactie op cytokine stamcelfactor stimulatie te vergelijken, werden de verkregen lysaten geanalyseerd door amino blot. De blot toont de aanwezigheid van sterkere signaalintensiteiten voor alle drie de eiwitten in de hematopoëtische regenerators met cytokine stamcelfactor stimulatie. In vergelijking met de controle in vitro is het ook duidelijk dat er een toenemende signaalintensiteit is voor alle drie de eiwitten van verschillende hematopoëtische stamcellenvolumes.
Eenmaal onder de knie, kan dit technisch binnen 48 uur worden gedaan. Als het goed wordt benaderd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om nauwk
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd Western blotting-protocol dat is ontworpen voor het analyseren van slechts 500 hematopoëtische stam- of progenitorcellen. De methode legt de nadruk op een zorgvuldige behandeling van monsters en directe lyse in Laemmli-monsterbuffer.
Belangrijkste Onderdelen van het Onderzoek
Wetenschapsgebied
- Hematopoëtische stamcellen
- Western blotting-technieken
- Cellulaire eiwitanalyse
Achtergrond
- Western blotting is een veelgebruikte techniek voor eiwitanalyse.
- Het analyseren van kleine celpopulaties kan de behoefte aan diermodellen verminderen.
- Het optimaliseren van protocollen kan de efficiëntie van eiwitdetectie verbeteren.
- Deze methode pakt uitdagingen aan bij het bestuderen van zeldzame celpopulaties.
Doel van de studie
- Om een protocol voor Western blotting te ontwikkelen met een minimaal aantal cellen.
- Om de analyse van specifieke eiwitten in hematopoëtische stamcellen te vergemakkelijken.
- Om het aantal dieren dat nodig is voor onderzoek te verminderen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een swing-out rotor voor centrifugatie.
- Centrifugatie van gesorteerde hematopoëtische stam- en progenitorcellen.
- Directe lysis van cellen in Laemmli-monsterbuffer.
- Optimalisatie van de monsterverwerking om verlies te minimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt analyse van minder dan 20.000 cellen mogelijk.
- Het biedt een betrouwbare detectie van specifieke eiwitten.
- Het vermindert de noodzaak voor grotere dierpopulaties in experimenten.
- De effectiviteit is aangetoond bij het bestuderen van signaleringspaden.
Conclusies
- Dit geoptimaliseerde Western blotting-protocol is effectief voor kleine celpopulaties.
- Het draagt bij aan ethischer onderzoek door het gebruik van dieren te verminderen.
- De methode kan het begrip in het veld van hematopoëtische stamcellen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het analyseren van zeldzame hematopoëtische stamcellen (HSC's) vormt een belangrijke flessenhals bij de validatie van targets vanwege de beperkte beschikbaarheid van monsters, waardoor vaak grote diercohorten nodig zijn. Dit protocol maakt directe proteïneanalyse mogelijk vanaf slechts 500 HSC's, wat de biologische variabiliteit en het gebruik van dieren aanzienlijk vermindert terwijl de detectieprecisie behouden blijft. Door de drempelwaarde voor de cellulaire input te verlagen, ondersteunt dit protocol vroegtijdige mechanistische risicoreductie in discovery-workflows, waarbij de overvloed van targets en de activering van pathways moeten worden bevestigd in fysiologisch relevante populaties met een lage opbrengst.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in fenotypisch gedefinieerde HSC's met een minimale input, wat assessments van targetaanwezigheid en pathway-activatie ondersteunt.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van expansie-artefacten door vers gesorteerde primaire cellen te analyseren die direct zijn gelyseerd in samplebuffer.
- Voorspellende waarde: Faciliteert functionele validatie van signaleringsknooppunten (bijv. S6-fosforylering, eIF4G) onder cytokine-gestimuleerde omstandigheden, waardoor het vertrouwen in targetmodulatie toeneemt.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde lysaten die compatibel zijn met SDS-PAGE en immunoblotting, waardoor reproduceerbare proteïndetectie over verschillende celinputs mogelijk is.
- Kwantitatieve output: Maakt normalisatie naar celaantal (500–15.000 cellen) mogelijk, wat dosis-respons- en stimulatievergelijkingen in beperkte monsters ondersteunt.
- Platformadaptiviteit: Maakt gebruik van standaard reagentia en apparatuur, wat de overdracht tussen laboratoria zonder gespecialiseerde infrastructuur vergemakkelijkt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt biomarker-achtige read-outs (bijv. β-actin, phospho-S6) in ziekterelevante hematopoëtische modellen, waardoor ex vivo bevindingen worden gekoppeld aan in vivo signalering.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt het mogelijk om signaalpaden in primaire cellen te onderzoeken, waardoor fout-positieven uit getransformeerde cellijnen worden verminderd en de beoordeling van de targetspecificiteit wordt verbeterd.
- Preklinische afstemming: Gegevens van kleine aantallen HSC's kunnen target-engagement-studies informeren voordat deze worden opgeschaald naar grotere preklinische modellen.
Integratie van pipeline & workflow
De methode past binnen de overgang van vroege ontdekking naar preklinisch onderzoek, in het bijzonder wanneer doelwitvalidatie afhankelijk is van primaire cel-signaleringsmetingen die niet gemodelleerd kunnen worden in bulk- of uitgebreide populaties.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten in zeldzame stamcel-/progenitorcompartimenten door directe lysis en immunoblotting mogelijk te maken zonder artefacten door kweek.
- Screening: Maakt reproduceerbare assays op basis van Western blot mogelijk voor de fosforyleringsstatus of eiwitexpressie in gesorteerde HSC's, geschikt voor validatie met een lage doorvoersnelheid.
- Analytics: Levert kwantitatieve, normaliseerbare resultaten (bijv. signaalintensiteit per 500 cellen) die vergelijking tussen stimuleringscondities of genotypen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ex vivo signaleringsgebeurtenissen met de hematopoëtische functie, wat de evaluatie van targets op basis van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Het protocol maakt gebruik van standaard Western blot-workflows, waardoor het een herbruikbare methode is voor teams in de immunologie, oncologie en regeneratieve geneeskunde die zeldzame hematopoëtische populaties bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door analyse van native, laag-abundante hematopoëtische cellen mogelijk te maken zonder expansiebias.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding voor Western blotting met lage input, waardoor de reproduceerbaarheid tussen verschillende locaties verbetert en technische variabiliteit wordt verminderd.
- Strategische waarde: Vermindert de risico's bij targetselectie door modulatie van signaalpaden in primaire cellen te bevestigen, wat het risico op falen in een laat stadium door een verkeerd gekozen target verlaagt.
- Impact op portfolio: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van mechanistische gegevens uit fysiologisch relevante cellen, wat de kapitaalefficiëntie bij de prioritering van targets verbetert.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in hematopoëtische cel sortering, nauwkeurig tellen en milde lysis om monsterverlies te voorkomen.
- Toegang tot centrifuges met swing-out rotoren, PCR-buisjes en standaard Western blot apparatuur (gelbakken, transfersystemen, imagers) is noodzakelijk.
- Standaardhandlingsprotocollen zijn vereist om een consistente verwijdering van het supernatant en resuspensievolumes tussen gebruikers te waarborgen.
- Variabiliteit in celviabiliteit en opbrengst moet in rekening worden gebracht bij aanpassing aan andere primaire hematopoëtische of niet-hematopoëtische zeldzame celtypen.
- Praktische beperking: Signaaldetectie is afhankelijk van de antilichaamsensitiviteit en de abundantie van het target; eiwitten met een zeer lage expressie kunnen signaalversterking of pooling vereisen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Sample Preparation
4:20
Electrophoresis, Transfer, and Block
5:30
Antibody Labeling and Detection
6:09
Results: Use of Optimized Western Blotting Technique to Analyze Small Numbers of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
7:56
Conclusion
