Name: Een gemanipuleerde Split-TET2 enzym voor chemische-afleidbare DNA Hydroxymethylation en epigenetische Remodeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer de CiDER-methode voor chemisch-induceerbare DNA-hydroxymethylatie en epigenetische remodellering in zoogdiercellen. Deze techniek biedt tijdelijke controle over epigenetische toestanden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de financiële ondersteunt van het National Institutes of Health verlenen (R01GM112003 naar YZ), de Stichting Welch (BE-1913 naar YZ), de American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE aan YZ), de kankerpreventie en Research Institute of Texas (RR140053 naar YH, RP170660 naar YZ), de American Heart Association (16IRG27250155 naar YH), en het programma van de toekenning van het onderzoek in samenwerkingsverband van John S. Dunn Foundation.

1. cel cultuur, plasmide transfectie en chemische inductie
<ol>
	<li>Cultuur een aanhangend cellijn (bijvoorbeeld de menselijke embryonale nier HEK293T cel) in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 100 U/mL penicilline en streptomycine bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
	<li>Transfect cellen met de plasmide CiDER.
	<ol>
		<li>Ten minste 18 h voor transfectie, zaad 0.3 x 106 cellen in 2.5 mL van de passende DMEM per goed in een 6-well-plate en Incubeer bij 37 ° C's nachts te bereiken van 60-80% confluentie cellen.</li>
		<li>Vooraf warm het transfectiereagens aan kamertemperatuur vóór gebruik.</li>
		<li>Plaats 250 µL van serumvrij medium in een steriele buis. Opmerking: Dit bedrag is op maat gemaakt voor een 6-well plaat met 80% confluentie. Proportioneel Wijzig indien nodig de middellange bedragen volgens de grootte van de platen of cel nummers.</li>
		<li>Toevoegen van 2,5 µg van de plasmide codering CiDER18 of het katalytische domein van TET2 (TET2CD als positieve controle)12,13 in het medium serumvrij en zachtjes Meng door pipetteren.</li>
		<li>Voeg 7,5 µL van het transfectiereagens aan het verdunde mengsel van DNA en zachtjes Meng door pipetteren.</li>
		<li>Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur voor 20-30 min.</li>
		<li>Wijzig voorverwarmde media en breng het mengsel drop-wise in de putjes en zachtjes schudden de cel cultuur plaat om de transfectiereagens en DNA mengsel gelijkmatig te verdelen.</li>
		<li>Cellen en mengsel na een nacht bebroeden, en vervang het transfectiereagens met media met 2ml vers volledig DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chemische inductie
	<ol>
		<li>Verdunde 2 mM rapamycin voorraad (ontbonden in DMSO) tot een concentratie van 20 µM in passende compleet medium.</li>
		<li>Voeg 20 µL van verdunde rapamycin naar transfected cellen gehandhaafd in 2 mL medium om te bereiken een eindconcentratie van 200 nM. Opmerking: Na incubatie gedurende 48 h, cellen zijn klaar voor de kwantificering van 5hmC generatie of andere downstream toepassingen. Indien nodig, kan de efficiëntie van de inductie worden gecontroleerd door middel van cellen elke 3 h voor verdere 5hmC kwantificering zoals hieronder beschreven en afgebeeld in Figuur 1.</li>
		<li>Voor betere kwantificering van 5hmC inductie efficiëntie scheiden zaad wells als u wilt controleren cellen elke 3 uur.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. kwantificering van Rapamycin-geïnduceerde 5hmC productie door immunokleuring
<ol>
	<li>5hmC immunofluorescentie kleuring Opmerking: Voeg voldoende hoeveelheden van de oplossingen van fixatie, die bestaan uit 4% paraformaldehyde, 0,2% oppervlakteactieve stof (zoals Triton X-100) in PBS met 3 N HCl, ter dekking van alle cellen in de plaat. Bijvoorbeeld zou 500 µL van oplossing genoeg zijn voor een goed in een 6-well-plate. Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur.<ol>
		<li>Om dit te corrigeren cellen toevoegen 4% paraformaldehyde PBS aan rapamycin behandelde cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik cellen uiten mCherry-CiDER zonder rapamycin behandeling voor de controlegroep. Niet doorroeren. Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag passende bescherming.</li>
		<li>Gooi kleefpoeders oplossing. Incubeer vaste cellen met 0,2% oppervlakteactieve stof in PBS voor 30 min aan het permeabilize van de celmembraan.</li>
		<li>Gooi de permeabilization oplossing. Voeg 3 N HCl toe aan de permeabilized cellen en incubeer gedurende 15 min te denatureren van het DNA.</li>
		<li>Gooi HCl. Add 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) naar de cellen voor 10 min voor neutralisatie van pH.</li>
		<li>Gooi alle de oplossing. Wassen van cellen grondig met PBS voor 3 - 5 keer. PBS grondig verwijderen. Opmerking: Voeg voldoende hoeveelheden van PBS voor elke stap van het wassen. Bijvoorbeeld, is 1 mL PBS genoeg voor een 6-well-plate.</li>
		<li>Het blokkeren van cellen door de bestaande uit 1% BSA en 0,05 procent van de oppervlakteactieve stof (zoals tween-20) in PBS voor 1 h met zacht schudden blokkeerbuffer toe te voegen.</li>
		<li>Gooi de blokkerende oplossing. Het antilichaam van de verdunde 5hmC (1:200) toevoegen aan de cellen en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.</li>
		<li>De cellen met PBS drie keer voor 15 min te wassen.</li>
		<li>Toevoegen van een verdunde fluorophore (FITC)-geconjugeerd secundair antilichaam (1:200) aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur.</li>
		<li>Spoel de cellen met PBS driemaal uitgebreid Schakel residuele antilichamen.</li>
		<li>Voeg 250 ng/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om de kern voor 5 min. vlek verwijderen de kleurstofoplossing.</li>
		<li>Monteer de dia of glazen-bodem cultuur schotel met immunostained cellen voor confocal imaging. Een representatief resultaat werd getoond in figuur 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stroom cytometry Opmerking: Gebruik een 96-Wells-ronde bodemplaat voor kleuring volgt. 150 µL van reagentia is meestal voldoende voor elk putje.<ol>
		<li>Resuspendeer transfected en rapamycin-geïnduceerde cellen in FACS buffer (PBS met 1% BSA, 2 mM EDTA). Voor de controlegroep, CiDER-uiten cellen zonder rapamycin behandeling worden gebruikt.</li>
		<li>Lossen en permeabilize van de cellen, zoals beschreven in stap 2.1.</li>
		<li>2 N HCl toevoegen aan de cellen te denatureren van het DNA voor 10 min.</li>
		<li>HCl. neutraliseren negeren en blokkeren van de cellen, zoals beschreven in stap 2.1.</li>
		<li>Een antilichaam verdunde anti-5hmC (1:200) toevoegen aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.</li>
		<li>Spoel de cellen met FACS buffer driemaal. FACS buffer grondig verwijderen.</li>
		<li>Toevoegen van een verdunde fluorophore (FITC)-geconjugeerd secundair antilichaam (1:400) voor fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse, en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Spoel de cellen met FACS buffer driemaal.</li>
		<li>Er zijn monsters klaar voor FACS analyse. Een representatief resultaat werd getoond in Figuur 1 c-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. dot-blot Assay te kwantificeren 5hmC en 5-methylcytosine (5mC) bedraagt
<ol>
	<li>Isoleer genomic DNA van transfected en rapamycin-geïnduceerde cellen met behulp van een commerciële DNA-extractie kit. Voor de controlegroep, CiDER-transfected cellen zonder rapamycin behandeling worden gebruikt.</li>
	<li>Verwarm de vacuüm oven tot 80 ° C en inweekmiddel nitrocellulose membraan in tweemaal gedestilleerd H2O en daarna in 6 x saline-Natriumcitraat (SSC) buffer gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Laden 60 µL van gelijke hoeveelheden DNA (totale 2 µg in TE buffer) aan een 96-Wells PCR plaat. Voeg 30 µL van TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) de rest putjes.</li>
	<li>Maak twee-voudige seriële verdunningen verticaal op de 96-wells-plaat door de overdracht van 30 µL van oplossing op rij 1 aan de dezelfde kolompositie op rij 2. Meng opnieuw en breng 30 µL van oplossing aan de putjes in de volgende rij tot het bereiken van de grens.</li></ol>Verwijder de laatste 30 µL.
	<li>20 µL van 1 M NaOH en 10 mM EDTA toevoegen aan elk putje, afdichting van de plaat en verwarm het mengsel gedurende 10 minuten bij 95 ° C tot de DNA-duplex volledig te denatureren.</li>
	<li>Onmiddellijk de monsters op ijs afkoelen en voeg 50 µL ijskoude ammoniumacetaat op 2 M (pH 7.0) en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. Opmerking: Stappen 3.7-3.10 impliceert het gebruik van vacuüm.</li>
	<li>Bouw de opstelling van de vlek dot met vooraf doorweekt membraan en verwijder residuele buffer met behulp van de volledige vacuüm.</li>
	<li>Wassen het membraan door 200 µL van TE buffer toe te voegen aan elk putje van het toestel van de vlek dot. Vacuüm te verwijderen TE buffer inschakelen.</li>
	<li>Het gedenatureerde DNA (bereid in de vorige stappen 3.1-3,6) aan elk putje van het toestel van de vlek dot laden. Vacuüm oplossing verwijderen inschakelen.</li>
	<li>Wassen het membraan door 200 µL van 2 x SSC en verwijder residuele oplossingen volledig met behulp van vacuüm toe te voegen.</li>
	<li>Demonteren van het toestel van de vlek dot, neem het membraan en spoel het hele membraan met 20 mL 2 x SSC.</li>
	<li>Het membraan gedurende 20 minuten drogen.</li>
	<li>Bak het membraan bij 80 ° C onder vacuüm voor 2 h.</li>
	<li>De blokkerende oplossing (5% magere melk in TBST) toevoegen aan het membraan en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gooi de blokkerende oplossing. Voeg een verdunde 5hmC (1:5, 000) of 5mC (1:1, 000) antilichamen tegen het membraan en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.</li>
	<li>Het wassen van het membraan met TBST driemaal voor 10 min te verwijderen van residuele antilichamen. TBST grondig verwijderen.</li>
	<li>Toevoegen van een HRP-geconjugeerde secundair antilichaam (1:10, 000 voor anti-konijn HRP(5hmC) of 1:3,000 voor anti-muis HRP(5mC)) aan het membraan en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het wassen van het membraan met TBST drie keer, gedurende 10 min.</li>
	<li>Toevoegen van ECL westelijke bevlekken substraat naar de membraan voor visualisatie van 5hmC signalen met behulp van een chemiluminescentie-detector. Een representatief resultaat werd getoond in figuur 1E.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hier hebben we laten zien dat het gebruik van een gemanipuleerde split-TET2 enzym om de temporele controle van DNA-hydroxymethylation. Na de ontdekking van TET familie van 5-methycytosine-dioxygenase, te ontcijferen van de biologische functies van TET eiwitten en hun grote katalytische product 5hmC1,2,3, tal van studies hebben verricht 4,5,<sup cla...

Methylation van DNA, meestal verwijst naar de toevoeging van een methylgroep naar de koolstof 5 positie van cytosine te vormen 5-methylcytosine (5mC), wordt gekatalyseerd door DNA methyl-transferasen (DNMTs). 5mC fungeert als een grote epigenetische mark in de zoogdieren genoom die vaak signalen voor transcriptionele onderdrukking, x-chromosoom inactivering en transposon silencing1. De omkering van methylation van DNA wordt gemedieerd door de tien-elven translocatie (TET) eiwit-familie. TET enzymen behoren tot de ijzer (II) en de afhankelijke dioxygenases 2-oxoglutarate, die de opeenvolgende oxidatie van 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxycytosine (5caC) katalyseren. 5mC TET-gemedieerde oxidatie legt een extra beveiligingslaag epigenetische controle over het genoom van zoogdieren. De ontdekking van TET heeft gevonkt intense belangstelling in de epigenetische veld te onthullen van de biologische functies van TET eiwitten en hun grote katalytische product 5hmC. 5hmC is niet alleen een intermediair tijdens TET-gemedieerde actieve DNA demethylatie2,3,4, maar ook fungeert als een stabiele epigenetische mark5,6,7,8 . Hoewel de DNA-hydroxymethylation is sterk gecorreleerd met genexpressie en afwijkende veranderingen in DNA hydroxymethylation worden geassocieerd met sommige menselijke aandoeningen9,10,11, de causale relaties tussen de epigenetische veranderingen op DNA en de fenotypes blijven vaak uitdagend om te worden vastgesteld, die deels kan worden toegeschreven aan het ontbreken van betrouwbare hulpmiddel om nauwkeurig wijzigingen toevoegen of verwijderen DNA in het genoom bij gedefinieerd temporele en ruimtelijke resolutie.
Wij rapporteren hier het gebruik van een chemische stof-afleidbare epigenome remodelleren gereedschap (appelwijn) te overwinnen de hindernis tegenover studies van causale relaties tussen DNA-hydroxymethylation en gene transcriptie. Het ontwerp is gebaseerd op de veronderstelling dat het katalytische domein van TET2 (TET2CD) kan worden gesplitst in twee inactief fragmenten als uitgedrukt in zoogdiercellen en de enzymatische functie kan worden hersteld door een chemisch afleidbare dimerisatie benadering ( Figuur 1A). Systeem in te stellen een split-TET2CD, wij zes locaties geselecteerd in TET2CD, samengesteld uit een Cys-rijke regio en een double-stranded β-helix (DSBH) vouwen, op basis van een gerapporteerde kristalstructuur van TET2-DNA-complex dat een lage complexiteit regio12ontbreekt. Een synthetische gen codering rapamycin-afleidbare dimerisatie module FK506 bindend-proteïne 12 (FKBP12) en FKBP rapamycin bindend domein (FRB) van de zoogdieren streefcijfer van rapamycin14,15, samen met een zelf verbrijzelen peptide T2A polypeptide reeks16,17, werd individueel ingevoegd in de geselecteerde split sites binnen TET2CD. De selectie van TET2 als onze engineering doel is gebaseerd op de volgende overwegingen. Eerste, somatische mutaties in TET2 met gelijktijdige afname DNA hydroxymethylation worden vaak waargenomen bij menselijke aandoeningen waaronder myeloïde aandoeningen en kanker10, die nuttige informatie op gevoelige plaatsen te vermijden voor inbrengen. Ten tweede, een groot gedeelte van het katalytische domein van TET2, met name de lage complexiteit regio, is overbodig voor de enzymatische functie12, waardoor ons om een geminimaliseerde split-TET2 voor afleidbare epigenetische aanpassingen ambacht. Na het screenen van meer dan 15 constructies, was een constructie die hoogste rapamycin-afleidbare herstel van de enzymatische activiteit tentoongesteld in de zoogdieren systeem gekozen en CiDER18uitgeroepen. We beschrijven hierin het gebruik van mCherry-gelabeld CiDER tot afleidbare DNA hydroxymethylation en epigenetische remodelleren met rapamycin, en presenteren van drie methoden voor het valideren van CiDER-gemedieerde 5hmC productie in een model cellulaire systeem HEK293T.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfectiereagens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% Oplossing</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumine, Rund</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antilichaam (pAb)</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Konijn IgG (H+L) Kruis-Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenylindolde (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuümoven, 0.6 Cu.Ft. (17 L)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparaat</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-methylcytosine (5mC) Antilichaam, clone 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis IgG, HRP-gekoppeld Antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-konijn IgG, HRP-gekoppeld Antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL-oplossing</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

een gemanipuleerde split-tet2 enzym voor chemische-afleidbare dna hydroxymethylation en epigenetische remodeling

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Methylation van DNA is een stabiele en erfelijke epigenetische wijziging in het genoom van zoogdieren en is betrokken bij de regulering van de genexpressie om cellulaire functies. De omkering van methylation van DNA en DNA demethylatie, is bemiddeld door de tien-elf translocatie (TET) eiwit familie van dioxygenases. Hoewel het is wijd gemeld dat aberrant methylation van DNA en demethylatie geassocieerd met ontwikkelingsstoornissen gebreken en kanker zijn, hoe deze epigenetische veranderingen dragen rechtstreeks bij aan de latere wijziging in gen expressie of ziekte progressie blijft onduidelijk, grotendeels als gevolg van het gebrek aan betrouwbare instrumenten nauwkeurig toevoegen of verwijderen van DNA wijzigingen in het genoom bij gedefinieerde temporele en ruimtelijke resolutie. Om te overwinnen deze hindernis, ontwierpen we een split-TET2 enzym om de temporele controle van oxidatie van de 5-methylcytosine (5mC) en de daaropvolgende remodeling van epigenetische Staten in zoogdiercellen door simpelweg toevoegen van chemicaliën. Hier beschrijven we methoden voor de invoering van een chemische stof-afleidbare epigenome remodelleert tool (appelwijn), gebaseerd op een gemanipuleerde split-TET2 enzym, in zoogdiercellen en kwantificeren van de chemische afleidbare productie van 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) met immunokleuring, stroom cytometry of een dot-blot test. Deze chemische-afleidbare epigenome remodelleert tool vindt brede gebruik in het ondervragen van cellulaire systemen zonder te veranderen van de genetische code, evenals in het sonderen van de epigenotype−phenotype betrekkingen in verschillende biologische systemen.

Chemische afleidbare conversie van de 5mC-aan-5hmC kan worden gevalideerd door immunokleuring op het niveau van de eencellige, stroom cytometry analyse op transfected (mCherry-positief)-cel populaties, of een meer kwantitatieve bepaling van de dot-blot zoals geïllustreerd in Figuur 1. Het katalytische domein van TET2, of TET2CD, werden gebruikt in de studie als positieve controle. Zie referenties 18-20 voor nadere details betreffende de toewijzing van genoom-...

Gedetailleerde protocollen voor de invoering van een gemanipuleerde split-TET2 enzym (appelwijn) in zoogdiercellen voor chemische afleidbare DNA-hydroxymethylation en epigenetische remodeling worden gepresenteerd.

Een gemanipuleerde Split-TET2 enzym voor chemische-afleidbare DNA Hydroxymethylation en epigenetische Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Het algemene doel van deze reeks experimenten is om een gemodificeerd split-TET2-enzym, CiDER genaamd, te introduceren in zoogdiercellen voor inductieve DNA-modificatie zoals hydroxymethylering en epigenetisch hermodellering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het epigenetisch veld, zoals De belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemodificeerd split-TET2-enzym een tijdelijke controle mogelijk maakt van 5-methylcytosine-oxidatie en de daaropvolgende hermodellering van epigenetische toestanden in zoogdiercellen met chemische additieven. Om deze procedure te beginnen, kweek een adherante cellijn in DMEM aangevuld met 10%hitte-geïnactiveerd FBS, evenals 100 eenheden per milliliter penicilline en streptomycine.Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5%CO2. Transfecteer de cellen met het CiDER-plasmide zoals beschreven in het tekstprotocol. Bewaar de cellen vervolgens een nacht bij 37 graden Celsius.De volgende dag, vervang het transfectie-reagens bevattende medium door vers compleet DMEM. Om de cellen chemisch te induceren, voeg 20 microliters verdunde Rapamycine toe aan de getransfecteerde cellen die in twee milliliters medium worden gehouden om een ​​eindconcentratie van 200 nanomolair te bereiken. Om flowcytometrie uit te voeren, resuspendeer de getransfecteerde en met Rapamycine geïnduceerde cellen in FACS-buffer.Voor de controlegroep, gebruik CiDER-expresserende cellen zonder Rapamycine-behandeling. Fixeer en permeabiliseer de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens twee normale zoutzuur toe aan de cellen om het DNA gedurende 10 minuten te denatureren.Na het neutraliseren en blokkeren van de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol, voegt u het verdunde anti-5hmC-antilichaam toe aan de cellen. Bewaar de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius. Na incubatie, spoel de cellen driemaal met FACS-buffer.Verwijder de FACS-buffer grondig. Voeg een verdund fluorfoer-geconjugeerd secundair antilichaam toe voor FACS-analyse en bewaar gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de cellen driemaal met FACS-buffer.Na de wassing zijn de monsters klaar voor FACS-analyse. Isoleerd genomisch DNA uit getransfecteerde en met Rapamycine geïnduceerde cellen met behulp van een commercieel DNA-extractiekit. Gebruik voor de controlegroep CiDER-getransfecteerde cellen zonder Rapamycine-behandeling.Verwarm de vacuümoven tot 80 graden Celsius. Week het nitrocellulosemembraan voor in gedestilleerd water en vervolgens in 6X SSC-buffer gedurende 10 minuten. Laad vervolgens 60 microliters van gelijke hoeveelheden DNA naar een 96-wells PCR-plaat.Voeg 30 microliters TE-buffer toe aan de resterende wells. Maak tweevoudige seriële verdunningen verticaal op de 96-wells plaat door 30 microliters oplossing in rij één over te brengen naar dezelfde kolompositie in rij twee. Meng opnieuw en breng 30 microliters oplossing over naar de wells in de volgende rij tot de grens is bereikt.Verwijder vervolgens de laatste 30 microliters uit de well. Voeg vervolgens 20 microliters van één molair natriumhydroxide en 10 millimolair EDTA toe aan elke well. Sluit de plaat en verwarm het mengsel gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius om het DNA-duplex volledig te denatureren.Koel de monsters onmiddellijk af op ijs. Voeg 50 microliters ijskoud twee molair ammoniumacetaat toe aan elke well en bewaar op ijs gedurende 10 minuten. Gelijktijdig bouwt u het dot-blot-apparaat samen met het voorgeweekte membraan.Verwijder de resterende buffer met volledige vacuüm. Was het membraan door 200 microliters TE-buffer toe te voegen aan elke well van het dot-blot-apparaat. Zet de vacuüm aan om de TE-buffer te verwijderen.Laad vervolgens het gedenatureerde DNA naar elke well van het dot-blot-apparaat. Zet de vacuüm aan om de oplossing te verwijderen. Was het membraan door 200 microliters 2X SSC toe te voegen en verwijder resterende oplossingen volledig met behulp van een vacuüm.Ontmantel het dot-blot-apparaat. Neem vervolgens het membraan eruit en spoel het hele membraan met 20 milliliter 2X SSC. Laat het membraan 20 minuten aan de lucht drogen.Om het membraan verder te drogen, bak het gedurende twee uur onder vacuüm bij 80 graden. Voeg de blokkeringsoplossing toe aan het membraan en bewaar gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na het weggegooien van de blokkeringsoplossing, voegt u de verdunde 5-hmC- of 5-mC-antilichamen toe aan het membraan en bewaart u gedurende een nacht bij vier graden Celsius.Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten met TBST om resterende antilichamen te verwijderen. Na het grondig verwijderen van de TBST, voegt u een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam toe aan het membraan. Bewaar het membraan gedurende één uur bij kamertemperatuur.Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten met TBST. Voeg ten slotte ECL westerse blot-substraat toe aan het membraan voor visualisatie van 5-hmC-signalen met behulp van een chemiluminescentie detector. Een representatief kwantificeringsresultaat van CiDER-gemedieerde 5-hmC-productie door flowcytometrie wordt hier getoond.Alleen cellen die CiDER uitdrukken onder Rapamycine-behandelde omstandigheden, tonen een significante toename van 5-hmC-niveaus. Een representatief resultaat van de globale verandering van 5-hmC-niveau in de gehele celpopulatie door dot-blot-assay wordt hier getoond. De ladingscontrole wordt gevisualiseerd door ethyleenblauwkleuring van totale hoeveelheden input DNA.De resultaten tonen aan dat Rapamycine-behandeling een robuuste productie van 5-hmC induceert in CiDER-expresserende HEK293

an-engineered-split-tet2-enzyme-for-chemical-inducible-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit kan gebruikt worden om te analyseren en te kwantificeren 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een spe cifieke locus. De kit onderscheidt vijf-mC van 5-HMC door de toevoeging van glucose aan de hydroxylgroep van 5-HMC via een enzymatische reactie gebruik te maken van β-glucosyltransferase (T4-BGT). Bij het 5-HMC vindt plaats in het kader van CCGG, deze wijziging zet een splitsbare MspI site om een ​​niet-splitsbare site.

Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel

Beschreven is een twee stappen proces labeling met β-glucosyltransferase (β-GT) een azide-glucose dragen aan 5-HMC, gevolgd door een klik chemie biotine linker gemakkelijk en dichtheid onafhankelijk verrijking brengen. Deze efficiënte en specifieke etiketteringsvoorschriften methode maakt het mogelijk verrijking van 5-HMC met extreem lage achtergrond en high-throughput epigenomisch mapping vinden plaats via next-generation sequencing.

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

DNA en eiwitten sequentie-specifiek gemerkt met affiniteit of fluorescente reporter groepen met DNA of eiwit methyltransferases en synthetische analogen cofactor. Afhankelijk van de cofactor specificiteit van de enzymen, aziridine of dubbel geactiveerde cofactor analogen worden gebruikt voor één of twee stappen labeling.

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

Hier presenteren we een protocol voor een efficiënte Macrostap zuivering van de actieve niet-gelabelde mens tien-elf translocatie-2 (TET2) 5-methylcytosine-dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie- en haar kwantitatieve analyse met behulp van een vloeibare chromatografie-tandem-massa spectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde aanpak.

Efficiënte reiniging en LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling voor tien-elf translocatie-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Hier presenteren we een protocol voor de in vitro selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR's) met een hoge, langdurige, stabiele, on-target uitschakelingsefficiëntie en een lage genoombrede, off-target activiteit. Deze workflow maakt het mogelijk om een initieel, complex repertoire van kandidaat-ETR's terug te brengen tot een shortlist, geschikt voor verdere evaluatie in therapeutisch relevante settings.

In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

Hier presenteren we een protocol om DNA-modificaties in bacteriofagen te verminderen met behulp van het NgTET-enzym, waardoor efficiënte en littekenloze CRISPR-Cas-mutagenese mogelijk wordt. Deze methode vergemakkelijkt de genetische manipulatie van fagen voor toepassingen in de biotechnologie en faagtherapie.

Nauwkeurige faagmutagenese met NgTET-geassisteerde CRISPR-Cas-systemen

Dit protocol beschrijft een niet-integratief, episomaal CRISPR/dCas9-gebaseerd systeem voor gerichte epigenetische bewerking in K562-cellen, waarbij dCas9-DNMT3A- en dCas9-HDAC1-effectoren worden gecombineerd met specifieke sgRNA's om locusspecifieke DNA-methylering met precisie te induceren en off-target-effecten te verminderen.

Epigenetische manipulatie van K562-cellen: dual-vector episomale strategie voor stabiele gerichte DNA-methylering met behulp van dCas9-DNMT3A en -HDAC1 fusie-eiwitten

Leer de CiDER-methode voor chemisch-induceerbare DNA-hydroxymethylatie en epigenetische remodellering in zoogdiercellen. Deze techniek biedt tijdelijke controle over epigenetische toestanden.

Een gemanipuleerde Split-TET2 enzym voor chemische-afleidbare DNA Hydroxymethylation en epigenetische Remodeling

Meer video's verkennen