Oppervlakte modificatie van de alvleesklier eilandjes met een Heparinized StarPEG Nanocoating
23 juni 2018
Dit protocol is gericht op een oppervlak engineering van alvleesklier eilandjes met behulp van een heparine-opgenomen starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemie tussen de fracties N- hydroxysuccinimide van de nanocoating en de amine groepen islet celmembraan.
Deze methode kan helpen bij het oplossen van grote uitdagingen bij pancreaseilandtransplantatie, zoals immuno-afstoting, revascularisatie van de eilandjes na de transplantatie en overleving. De belangrijkste voordelen van deze techniek is dat deze eenvoudig te adopteren aanpak de oppervlakte-engineering van levende cellen mogelijk maakt door het herschikken van het cellulaire landschap van pancreaseiland het zal de functie van de transplantaat, overleving en uiteindelijk de therapeutische werkzaamheid van eilandtransplantatie verbeteren. De implicaties van deze techniek reiken tot cel-gebaseerde therapieën omdat het therapeutische resultaat van cel-gebaseerde therapieën ook beperkt is door lage celadhesie en slechte overleving.
Demonstratie van deze procedure is Jingyi Yang, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Eerst, weeg 6,9 gram Heparine af en los het op in 2 milliliter ijskoud gedeïoniseerd water in een Eppendorfbuisje. Los 0,23 gram NHS op in 0,5 milliliter ijskoud gedeïoniseerd water in een Eppendorfbuisje.
Los vervolgens 0,77 gram EDC op in 0,5 milliliter ijskoud gedeïoniseerd water in een 50 milliliter conische buis. Meng de NHS en EDC oplossingen in een 50 milliliter conische buis. Laat de gemengde oplossing gedurende 30 minuten op kamertemperatuur staan, centrifugeer het vervolgens gedurende 10 minuten bij 12.000 RPM om het overtollige EDC en NHS te verwijderen.
Voeg vervolgens 30 milliliter koude ethanol toe aan de oplossing en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 RPM. Voeg nu 1 milliliter van 10% starPEG MI-hulpstof toe aan een 50 milliliter conische buis. Voeg vervolgens 0,67 milliliter van 10% Heparine NHS-oplossing toe aan dezelfde 50 milliliter conische buis.
Plaats de gemengde oplossing in een incubator bij 25 graden Celsius gedurende 20 minuten om een viskeuze heldere oplossing te verkrijgen. Haal 200 eerder geëxtraheerde muizeneilandjes onder een dissectiemicroscoop en breng ze over naar een 1,5 milliliter buis. Voeg 500 microliter PBS toe aan de eilandjes en centrifugeer gedurende één minuut bij 1.200 RPM bij vier graden Celsius.
Verwijder het supernatant, voeg 250 microliter van de Heparine PEG-oplossing toe en plaats het mengsel gedurende 10 minuten op ijs. Pipetteer op en neer om de eilandjes goed te mengen met de Heparine PEG-oplossing. Centrifugeer vervolgens het mengsel gedurende één minuut bij 1.200 RPM.
Verwijder vervolgens het supernatant en voeg 500 microliter PBS toe. Pipetteer op en neer om goed te mengen. Na centrifugatie gedurende één minuut bij 1.200 RPM, verwijder het supernatant en bewaar de eilandjes voor verder gebruik.
Voeg vervolgens een tot twee milliliter RPM I 1640, aangevuld met 10% FBS, toe aan de gecoate eilandjes. En breng deze eilandjes over naar een niet-geladen steriele bacteriële kweekschaal. Observeer tenslotte de morfologie en fluorescente signalen van de FAM-Heparine-PEG-gecoate eilandjes onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
Karakteristiek Heparine-pieken, corresponderend met de HYDROXAL-groepen, werden waargenomen in het Heparine-PEG nanocoating FTIR-spectrum. De afname van de amplitude van deze pieken vertegenwoordigt conjugatie tussen de star-PEG MI-hulpstof amidegroepen en de Heparine carbonylgroep. De piek die overeenkomt met de amide carbonylrekkingsvibratie werd ook verminderd, wat wijst op voldoende reactie tussen de Heparine carboxylaatgroepen met het succynimidaal suxsonate en de star-PEG MI-hulpstof amine.
Scanning elektronenmicroscopie gegevens tonen de sterk onderling verbonden poreuze structuur van de Heparine-PEG nanocoating, wat suggereert dat het geschikt zou kunnen zijn voor celoverleving tijdens in vivo-aflevering. Een dunne laag nanocoating, getoond door groene fluorescentie, werd gelijkmatig afgezet over het oppervlak van de gecoate eilandjes, zonder duidelijke veranderingen in eilandvolume of -grootte te veroorzaken. Heparine-PEG-gecoate muizeneilandjes vertoonden robuuste eilandviabiliteit in cultuur.
Aanzienlijk meer gevorderde vasculaire vorming was duidelijk zichtbaar bij eilandendotheelcellen die werden gecocultiveerd met Heparine-PEG-gecoate eilandjes, aangegeven door langwerpige microvaten-achtige structuren en netwerkachtige vasculaire structuren. Een laag niveau van insulinesecretie werd waargenomen in alle behandelingsgroepen wanneer de eilandjes werden geperfundeerd met een fysiologische zout-oplossing, aangevuld met een sub-stimulerend niveau van glucose. Wanneer de eilandjes werden gestimuleerd met een superfysiologisch niveau van glucose, werd een toename in insulinesecretie waargenomen.
Eenmaal onder de knie, kan het coaten in een minuut worden gedaan als het goed wordt uitgevoerd om de eilandjeviabiliteit te behouden.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor oppervlakte-engineering van pancreaseilandjes met behulp van een nanocoating van starPEG waarin heparine is geïncorporeerd. Deze techniek is erop gericht de resultaten van eilandjestransplantaties te verbeteren door de functie en overleving van het transplantaat te verhogen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celgebaseerde therapieën
- Transplantatiebiologie
- Oppervlakte-engineering
Achtergrond
- Transplantatie van pancreaseilandjes staat voor uitdagingen zoals immuunafstoting en een geringe overleving van de eilandjes.
- Het verbeteren van het cellulaire landschap van de eilandjes kan de therapeutische effectiviteit verhogen.
- Een nanocoating van Heparine-PEG biedt een potentiële oplossing voor deze uitdagingen.
- Deze methode is eenvoudig toe te passen en kan snel worden uitgevoerd.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een coatingtechniek die de overleving en functie van pancreaseilandjes verbetert.
- Het aanpakken van problemen met betrekking tot de lage celretentie bij celgebaseerde therapieën.
- Het aantonen van de effectiviteit van de heparine-PEG nanocoating bij het verbeteren van de resultaten van eilandjestransplantaties.
Gebruikte methoden
- Bereiding van heparine- en NHS-oplossingen.
- Mengen van NHS- en EDC-oplossingen voor nanocoating.
- Coaten van muis-eilandjes met de heparine-PEG-oplossing.
- Observatie van de morfologie en viabiliteit van de eilandjes onder een fluorescentiemicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Heparine-PEG-gecoate eilandjes vertoonden een verbeterde levensvatbaarheid in kweek.
- Er werd een verbeterde vaatvorming waargenomen in co-gekweekte endotheliale cellen van de eilandjes.
- De insulinesecretie in de gecoate eilandjes reageerde op glucosestimulatie.
- De coating veranderde het volume of de grootte van de eilandjes niet significant.
Conclusies
- De heparine-PEG nanocoating is een veelbelovende methode voor het verbeteren van eilandtransplantatie.
- Deze techniek zou de effectiviteit van celgebaseerde therapieën kunnen verhogen.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere celtypen die oppervlakte-engineering vereisen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Oppervlaktemodificatie van pancreaseilandjes met een gehepariniseerde starPEG-nanocoating neemt kritieke barrières in celgebaseerde therapieën weg, waaronder immuunafstoting en een slechte overleving van het transplantaat. Dit platform maakt functionele modificatie van levende celoppervlakken mogelijk, wat bijdraagt aan verbeterde transplantatieresultaten en translationele continuïteit. De aanpak biedt een schaalbare, milde en aanpasbare oplossing voor het verhogen van de celviabiliteit en therapeutische effectiviteit in preklinisch onderzoek en R&D in de ontdekkingsfase.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om immuunmodulerende strategieën voor celgebaseerde therapiedoelen te onderzoeken.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de levensvatbaarheid en functie van eilandjes na het coaten te behouden.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen in celoverleving en transplantatie voor portfoliotriage.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gestandaardiseerde, oppervlakte-gemodificeerde eilandjes voor voor downstream functionele assays.
- Waarborgt reproduceerbaarheid en kwantitatieve beoordeling van de levensvatbaarheid van eilandjes en de insulinesecretie.
- Maakt betrouwbare evaluatie van immuunbescherming en vascularisatie in screeningsworkflows mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modellen voor eilandtransplantatie en studies naar de immuunrespons.
- Ondersteunt de continuïteit van in vitro engineering naar in vivo transplantatievalidatie.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor celretentie en overleving in preklinische modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze nanocoatingmethode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor hypothesetests in een vroeg stadium worden ondersteund en een robuuste preklinische validatie van celgebaseerde therapieën mogelijk wordt gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Bevordert hypothesetoetsing voor mechanismen van immuunontwijking en graftoverleving.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantificeerbare resultaten voor de levensvatbaarheid en functie van eilandjes.
- Analytiek: Biedt meetbare read-outs zoals insulinesecretie en vascularisatiemetrieken.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro engineering en in vivo transplantatiestudies voor de afstemming van biomarkers.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Biedt een modulair platform dat aanpasbaar is aan diverse celtypen en functionele mediatoren.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van celoverleving en immuunbescherming.
- Operationele waarde: Standaardiseert het engineering van celoppervlakken met een minimale impact op de celviabiliteit.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk voor celtherapiekandidaten en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van celgebaseerde therapeutische programma's.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celisolatie, oppervlaktechemie en nanocoatingtechnieken.
- Toegang tot fluorescentiemicroscopie en analytische instrumentatie is nodig voor validatie.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid bij de preparatie en coating van eilandjes.
- Aanpasbaar aan verschillende celtypen en functionele mediatoren, zoals ondersteund door het platformontwerp.
- Praktische beperkingen omvatten het behouden van de celviabiliteit en het waarborgen van een uniforme coatingdekking.
