Identificatie van OTX1 en OTX2 als twee mogelijk moleculaire merkers voor Sinonasal carcinomen en olfactorische Neuroblastomas

Het algemene doel van dit experiment is om nuttige moleculaire markers voor sinonasal carcinomen en reukneuroblastomen op een eenvoudige en efficiënte manier te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van reukneuroblastoom en sinonasal carcinoom, zoals de identificatie van moleculaire markers om tumorsubtype te discrimineren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we in minder dan zes uur, of binnen een dag voor het ziekenhuisrapport, resultaat kunnen behalen.

Het aantonen van de procedure van RNA extractie en real-time PCR zal Dr.Giorgia Millefanti, een promovendus van mijn lab. En het aantonen van de procedure van immunohistochemie zal Giovanni Micheloni zijn, ook een promovendus van mijn lab. Om te beginnen met de procedure, verzamelen en verdelen alle menselijke FFPE monsters in verschillende subgroepen, volgens de WHO-classificatie van hoofd-en nektumoren.

Verwarm de monsters dia's in een oven op 60 graden Celsius gedurende 30 minuten. Rehydrateer vervolgens de drie micrometer dikke FFPE-secties door ze kort te wassen in xyleen gedurende 10 minuten. Was vervolgens de glijbanen in 100%95%85% en 75% alcohol serieel gedurende vijf minuten per wasbeurt.

Spoel de glijbanen gedurende vijf minuten in gedestilleerd water. Vervolgens, blokkeer de endogene activiteit door het plaatsen van de dia's in 3%waterige waterstofperoxide gedurende 12 minuten. Daarna voert u antigeenophaling uit door de dia's te behandelen met een citraatbuffer van 10 millimolar en microwaving gedurende 10 minuten.

Na 10 minuten, was de secties in tbs buffer. Voeg vervolgens 0,2% van Triton X toe en broed ze 's nachts uit bij vier graden Celsius, met Goat Anti-Human OTX2-antilichaam, verdund met een verhouding van 1 tot 100. De volgende dag, voeg biotinylated konijn anti-geit secundaire antilichaam, verdund op 1 tot 200, en incubeer de secties gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Behandel de monsters vervolgens met het ABC-peroxidasecomplex. Ontwikkel daarna de immunoreaction met diaminobenzene tetrahydrochloride en vlek de kernen met Harris hematoxylin. Vervolgens, dehydrateren de secties in een halve maan alcohol schaal, en verduidelijken in een clearing stof van turpine oorsprong.

Monteer vervolgens de secties op een dia met montagemedium. Na RNA-extractie en omgekeerde transcriptie voert u kwantitatieve real-time PCR-analyse uit met sondegebaseerde technologie en een thermische cycler. Bereid de PCR-reactiemix voor met behulp van 12,5 microliter sondegebaseerde mastermix, 1,25 microliter van elke OTX1-, OTX2- en ACTB-sondes, 50 nanogram cdna en nuclease-vrij water tot 25 microliter van het totale volume.

Voer alle reacties in drievoud met behulp van ACTB-gen als de endogene controle om genexpressie niveaus te normaliseren. Vervolgens centrifuge de plaat op 1109 keer zwaartekracht gedurende drie minuten. Bewaar vervolgens de plaat beschermd tegen licht op vier graden Celsius, tot het experiment.

Als u realtime PCR wilt uitvoeren, plaatst u de monsters in de machine. Stel vervolgens het thermische cyclerprofiel met een eerste hete startcyclus in op 50 graden Celsius gedurende twee minuten en 95 graden Celsius gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli op 95 graden Celsius gedurende 15 seconden en een laatste cyclus bij 60 graden Celsius gedurende een minuut. Voor genexpressie niveau analyse, normaliseren van de genexpressie niveaus door middel van de vergelijkende cyclus drempel methode met behulp van ACTB gen als de endogene controle.

Evalueer de genexpressieniveaus met behulp van de methode voor vergelijkende cyclusdrempel en plot de resultaten. Voer vervolgens statistische analyses uit met behulp van de t-test van studenten, rekening houdend met statistisch significante resultaten met p

Nucleaire expressie voor OTX1 werd gevonden in alle niet-darmtype adenocarcinoom monsters, terwijl weinig of afwezige immunoreactiviteit werd benadrukt in het darmtype adenocarcinomen. Intense immunoreactiviteit was aanwezig in alle reukneuroblastomen. Onder alle slecht gedifferentieerde neuro-endocriene carcinomen varieerde otx-expressie in intensiteit en percentage positieve cellen.

Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om elke stap van de RNA-extractie uit te voeren in steriele omstandigheden met behulp van ook steriele apparatuur. Parallel aan deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals röntgenanalyse, endoscopisch onderzoek van neusholte, CT-scan, magnetische resonantiebeeldvorming en biopsie, om de resultaten van onze techniek te bevestigen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van oncologie om deze ziekte in celmodellen te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe moleculaire markers te identificeren om tumor subtypes te discrimineren met behulp van de immunohistochemie en real-time PCR. Vergeet niet dat het werken met deze reagentia, instrumentatie en monsters zeer gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals DPI altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.