Name: High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer kwantitatieve dot-blotanalyse (QDB) voor absolute eiwitbepaling in muizenweefsels. Deze eenvoudige, hoogdoorvoermethode biedt betrouwbare resultaten voor biomarker validatie in proteomics onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door Taishan geleerden Construction Engineering (gt), de Shandong uitstekende Young Scientist Award (ZR2016JL026 naar G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 en 81641108), Shandong provinciale natuurlijke Stichting voor Wetenschappen (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provinciale wetenschap en technologie Plan (J14LE01 en J15LK03), Yantai wetenschap en technologie plan(2015ZH083) en Binzhou medische universiteit wetenschappelijke onderzoeksfondsen (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), de Zweedse Onderzoeksraad verlenen 621-2011-4423 en 2015-4870. Dit werk is ook gesponsord door "Yantai dubbele honderd Talent Plan" en "Yantai Hi-Tech Zone blauwe oceaan Talent Plan".

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met Binzhou medische universiteit dier gebruik richtlijn en goedgekeurd door de board van de ethische evaluatie van Binzhou Medizinische Universität.
1. de monstervoorbereiding
<ol><li>50 mg muis weefsel rekening een 1,5 mL Tube. Toevoegen van 200 µL lysis-buffermengsel (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM nb2P2O7, 1% Triton X-100, 10% glycerol), aangevuld met protease en phosphatase inhibitors (100 mM NaF, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride 5 µg/mL pepstatin, 10 µg/mL leupeptin, 5 µg/mL aprotinin).</li>
	<li>Meng het weefsel met een homogenizer voor 1 min op ijs.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min bij er 8000 x g bij 4 ° C.</li>
	<li>De bovendrijvende substantie in nieuwe buizen (1,5 mL) verzamelen en nemen 1 µL voor eiwit concentratie assay met BCA kit. Opmerking: Alle de veelgebruikte lysis buffers voor westelijke vlekkenanalyse en Dot vlekkenanalyse kunnen worden gebruikt voor QDB analyse.</li>
</ol>2. de vaststelling van het specifieke karakter van het antilichaam
<ol><li>Voorbereiding van monster lysates (20 µg) in punt 1.4, IgG gratis BSA (20 µg), standaard eiwitten (600 pg), voor westelijke vlekkenanalyse. Opmerking: IgG gratis BSA wordt gebruikt als een negatieve controle en de standaard eiwit wordt gebruikt als positieve controle. De specificiteit van het antilichaam wordt aangetoond door het tonen van een band van de juiste grootte met behulp van de westelijke vlekkenanalyse.</li>
</ol>3. de definitie van het lineaire bereik van de analyse QDB
<ol><li>Los van de standaard eiwit met ddH2O. Dilute het eiwit tot een concentratie van 1.200 pg/µL.</li>
	<li>Het verdunnen van de geconcentreerde eiwit uit de bereide monsters in sectie 1.4 tot en met 4 µg/µL.</li>
	<li>Los van de BSA met ddH2O. Dilute het eiwit tot een concentratie van 1.200 pg/µL en 4 µg/µL.</li>
	<li>Een reeks van verdunning van standaard eiwitten en bereid monsters werden voorbereid met de begeleiding van tabel 1 en tabel 2.</li>
	<li>Mix 10 µL verdunning standaard eiwit of verdunning bereid monsters en 10 µL 2 x laden van de buffer (120mM Tris-HCl pH 6.8, 20% Glycerol, 4% SDS, 0,2% Bromphenol blauw, 200 mM DTT) samen.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg/µl)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µl)</td>
			<td>S3 (100pg/µl)</td>
			<td>S3 (300pg/µl)</td>
			<td>S5 (600pg/µl)</td>
			<td>S6 (1200pg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>standaard protein(1200pg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>1.39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12,5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG gratis BSA (4pg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45.83</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>totaal</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Verdunning regeling voor standaard eiwit curve.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg/µl)</td>
			<td>X2 (0.25µg / µl)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µl)</td>
			<td>X4 (1µg/µl)</td>
			<td>X5 (2µg/µl)</td>
			<td>X6 (4 µg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12,5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG gratis BSA(4µg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43.75</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>totaal</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Verdunning regeling voor bereide monsters
<ol start="6"><li>Verwarm het mengsel bij 85 ° C gedurende 5 min.</li>
</ol>4. het proces van QDB analyse
<ol><li>
Voorbeeldtoepassing
	<ol>
<li>Steun de QDB plaat om te voorkomen dat de onderkant van de plaat aan het oppervlak van de tabel te raken. Bijvoorbeeld, een lege Pipetteer tip vak te gebruiken als ondersteuning.</li>
		<li>Maximaal 2 µL van het monster naar het midden van het membraan aan de onderkant van de individuele eenheid van de plaat QDB laden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Drogen van de plaat
	<ol>
<li>Laat de geladen QDB plaat voor 1 h op kamer gematigd (RT) of als alternatief laat de geladen plaat bij 37 ° C gedurende 15 min. in een goed geventileerde ruimte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het blokkeren van de plaat
	<ol>
<li>Dompel de plaat QDB in de buffer van de overdracht (0.039 M Glycine, 0.048 M Tris, 0,37 procent SDS, 20% methylalcohol) en schud zachtjes de plaat voor 10 s.</li>
		<li>Spoel de QDB plaat zachtjes met TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,1% Tween 20) drie keer, en daarna wassen de plaat gedurende 5 min. in TBST onder voortdurend schudden.</li>
		<li>Blokkeren van de QDB plaat met een blokkeerbuffer (5% nonfat melk in TBST (100 µL per putje) voor 1 h onder voortdurend schudden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primair antilichaam-incubatie
	<ol>
<li>Verdun het primaire antilichaam in de blokkeerbuffer bij een gekozen concentratie (vanaf 1:500 tot 1:5 000) en voeg 100 µL aan elke individuele putje van een gewone 96 goed plaat. De plaat QDB invoegen de 96 goed plaat en Incubeer de gecombineerde platen hetzij gedurende 2 uur op RT of 's nachts bij 4 ° C onder voortdurend schudden.</li>
		<li>Als alternatief, plaats de QDB plaat in een doos, en vul in het vak met een blokkeerbuffer 2 tot 3 mm boven het membraan-gedeelte van de plaat als het dezelfde antilichaam wordt gebruikt voor de hele plaat. Het primaire antilichaam toevoegen in de gekozen concentratie, en de plaat ofwel gedurende 2 uur op RT of 's nachts bij 4 ° C door onder voortdurend schudden uit te broeden.</li>
		<li>Spoel de plaat zachtjes met TBST voor drie keer voordat het wordt gewassen met TBST voor driemaal, telkens gedurende 5 minuten onder voortdurend schudden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubatie van secundair antilichaam
	<ol>
<li>Het secundaire antilichaam in de blokkeerbuffer in de gekozen concentratie (van 1:1, 000 tot 1:50 000), en beide aliquoot 100 µL per putje in een 96 goed plaat of in een doos zoals beschreven in sectie 4.4.2 Verdun en vervolgens Incubeer de QDB plaat binnen ofwel de geladen 96 goed pla te of het vak voor 1 h bij RT onder voortdurend schudden.</li>
		<li>Spoel de QDB plaat zachtjes 3 keer met TBST, dan wassen van de plaat voor 3 keer, 5 minuten elk met TBST onder voortdurend schudden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificering
	<ol>
<li>Verbeterde Chemiluminescentie substraat (ECL) voor te bereiden door het volgen van de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Aliquot ECL substraat in een 96 goed plaat (100 µL per putje) en invoegen de QDB plaat binnen de 96 goed plaat gedurende 2 minuten onder voortdurend schudden.</li>
		<li>Verwijder de QDB plaat uit de 96 goed plaat en schud kort te verwijderen van de overtollige vloeistof. Plaats de plaat op een witte microtiterplaat bord.</li>
		<li>Schakel de microplate-lezer, en selecteer "plaat met cover" op de user interface alvorens de gecombineerde platen (QDB plaat + witte plaat adapter) binnen de microplate-lezer voor kwantificering te plaatsen. Opmerking: Zorg ervoor dat de witte, ondoorzichtige microtiterplaat plaat als een adapter gebruiken om eventuele storing van de plaat te voorkomen. Zorg ervoor om te kiezen "plaat met cover" om te voorkomen dat de machine tegen wanneer gecombineerd jammen platen (QDB plaat + 96 goed plaat adapter) worden geplaatst binnen de microplate-lezer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li>
<li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29.+Quantitative+assay+of+immunoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22G.+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li>
<li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen%2C+immunoglobulin+G%2C+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li>
<li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li>
<li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+array%3A+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li>
<li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot+blot+analysis+%28QDB%29%2C+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li>
</ol>

De auteurs Yunyun Zhang, Wenfeng Zhang en Jiandi Zhang zijn werknemers van Zestern Biotechniques die QDB platen gebruikt in dit artikel produceert. Wenfeng Zhang en Yunyun Zhang verklaren belangenconflict en Jiandi Zhang octrooiaanvragen heeft ingediend. De anderen beweren geen concurrerende belangen.

Onder alle huidige beschikbaar immunoassay technieken van eiwit analyse behalve ELISA is QDB analyse de enige methode om absolute inhoud van een specifieke proteïne op cellulair en weefsel niveaus in een hoge doorvoer-indeling. Hoewel met stabiele isotoop-label standaard, massaspectrometrie staat om absolute kwantificering van een paar eiwitten, is deze methode niet nog ontworpen voor hoge doorvoer prestaties. In dit onderzoek aangetoond we het proces van QDB analyse om absolute bepaling van CAPG eiwit gehalte in muis weefsel, met inbegrip van de prostaat, nier en milt. CAPG niveaus bleken te zijn tussen de 200 tot 360 pg/g in muis nier weefsels, 460 tot en met 650 pg/g in de milt van de muis en 330 tot 390 pg/g in muis prostaat weefsels.
Vergeleken met ELISA, vereist QDB analyse minimale inspanningen worden ontwikkeld in een regelmatige lab. Ten eerste, de QDB plaat is een op basis van een membraan van het nitrocellulose te elimineren van de coating stap in ELISA. Ten tweede, QDB analyse vereist slechts één in plaats van twee specifieke antilichamen in een sandwich-ELISA. Ten derde, de hoge bindingscapaciteit van membraan van het nitrocellulose ten opzichte van het oppervlak van de plaat ELISA staat ook het membraan te weerstaan de stappen van de strenge wassen meestal gebruikt bij de analyse van de immunoblot te verminderen de interferentie van de achtergrond. Deze functie is handig bij het analyseren van ingewikkelde lysates bereid uit cellen en weefsels. In tegenstelling, als gevolg van de relatief lage bindingscapaciteit van ELISA-plaatjes wordt de vermindering van de achtergrond bij het analyseren van complexe cellulaire en weefsel lysates een echte uitdaging in het ontwikkelings proces.
QDB analyse kan gemakkelijk worden vastgesteld in een lab met de toegang van een specifiek antilichaam. Het is echter belangrijk te vermelden dat de specificiteit van het antilichaam een relatief begrip is is, beperkt door factoren met inbegrip van de soorten, de weefseltypes (HLA) en celtypes. Zoals blijkt uit Figuur 1A, CAPG antilichaam is specifiek bij het analyseren van lysate van muis nier en milt, prostaat en nog aspecifieke wordt bij het analyseren van de lever van de muis. In feite, vonden we regelmatig één antilichaam aan zijn specifiek voor één weefseltype, maar niet altijd specifiek om andere weefseltype van dezelfde soorten. Voorafgaande westelijke vlekkenanalyse is dus noodzakelijk zijn om het specifieke karakter van de QDB analyse. In feite, de relatieve specificiteit van het antilichaam mogelijk de oorzaak van valse resultaten vaak geassocieerd met ELISA analyse, zoals ongeacht hoeveel moeite het productiebedrijf mag hebben besteed het om ervoor te zorgen de specificiteit van de test, kunnen niet zij alle mogelijke uitlaat soorten monsters de gebruikers kunt analyseren met behulp van hun ELISA-producten.
Zoals met alle immunoassay, is een potentieel probleem met de analysemethode QDB het gebrek aan samenhang van de kwaliteit van het commerciële antilichaam. Zelfs als de zichtbare kwaliteit van een antilichaam uit hetzelfde bedrijf (dezelfde catalogus nummer, etc.) wordt gebruikt, kunnen er grote verschillen ten opzichte van één aankoop naar de andere als gevolg van-charges-variabiliteit. Daarom, tenzij het volste vertrouwen in de kwaliteit van het antilichaam beschikbaar wordt bereikt, opnieuw het karakteriseren van het antilichaam bij elke aankoop is belangrijk.
Kortom bieden wij hier een gedetailleerde protocol en een voorbeeld bij het gebruik van de methode van de analyse van de QDB om absolute kwantitatieve bepaling van een specifieke proteïne op het niveau van het weefsel. We laten zien dat de analysemethode QDB is een handig hulpmiddel voor iedereen die geïnteresseerd is in hoge-doorvoer, kwantitatieve immunoblot analyse. Deze techniek haar vermogen om absolute bepaling van het gehalte van een specifiek eiwit op een cellulaire en weefsel niveau ook onderscheiden van traditionele immunoblot technieken. Deze functie zorgt voor de combinatie en de vergelijking van de resultaten van meerdere analyses, een stap die nodig zijn met name in grotere bevolkingsonderzoeken en de realisatie van relevante vereniging studies op het niveau van eiwit in de nabije toekomst.

Naast met de spannende ontwikkelingen in de genomische onderzoek in de afgelopen jaren, getuige biomedisch onderzoeksveld ook van de aanzienlijke vooruitgang in Proteoom onderzoek. Met de toenemende accumulatie van biologische gegevens zowel genomic en proteomic niveaus, met behulp van bioinformatic hulpmiddelen voor het analyseren van deze gegevens is geworden de focus van het biomedisch onderzoek in de waarneembare toekomst. Bijgevolg, het succes van bioinformatical onderzoek verhoogt vraag naar meer en betere kwaliteit van de gegevens van de biologische en biomedische onderzoeksgemeenschap, een taak kan alleen worden bereikt door de vooruitgang van de techniek aan de genomic en proteomic niveaus.
De Spectrometrie van de massa (MS) en analyse van de immunoblot momenteel twee heersende technieken van eiwit analyse. MS heeft het proteoom onderzoek in de afgelopen jaren om de analyse van duizenden individuele eiwitten gelijktijdig gedomineerd. De immunoblot gebaseerde technieken, met inbegrip van de westelijke vlek en stip blot, aan de andere kant, ook een belangrijke rol hebben gespeeld in het eiwit onderzoek zelfs sinds haar uitvinding1,2,3,4, 5. Enzym-verbonden immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 en omgekeerde fase eiwit microarray (RPPM)8,9 kan worden beschouwd als de indeling van de hoge doorvoer van immunoblot analyse. Echter meet al deze immunoassay methoden, met uitzondering van ELISA, het niveau van de relatieve expressie van een specifieke proteïne. De relativiteit van deze methoden wordt een reëel probleem voor bevolkingsvraagstukken, zoals de analyse moet worden gedaan op hetzelfde moment, alle inspanningen om de grootte van de groep door meerdere analyses voorkomen. Bovendien zijn de resultaten afgeleid van deze studies slechts semi-kwantitatieve, complicerende dus alle inspanningen van de bio-informatica in de data-analyse. Ondertussen, hoewel ELISA leent zich uitstekend voor hoge doorvoer absolute analyse van EiwitSteekproeven, deze techniek lijkt om uitdagingen in complexe omgevingen zoals cellen of weefsels vanwege zijn lage bindingscapaciteit en multiplexing van10.
We hebben ontwikkelde een immunoblot methode geschikt voor bevolkingsonderzoeken met de belangrijkste kenmerken van het zijn handige, hoge doorvoer, kwantitatieve, en geschikt voor absolute bepaling van het gehalte aan andere melkeiwitten, en noemde deze techniek kwantitatieve dot Smet analyse (QDB)11. In deze studie, we presenteren een gedetailleerd protocol voor QDB analyse en demonstreren de methode door bepaling van het absolute eiwitgehalte van een specifieke proteïne, CAPG, in drie verschillende muis weefsel, met inbegrip van de prostaat, nier en milt. Wij denken dat dit gedetailleerde protocol goed de haalbaarheid en het gemak van deze methode illustreert, en als leidraad over hoe om te voorkomen dat de potentiële valkuilen in de praktijk van deze methode.

<table><tbody><tr><td>Microplate reader</td><td>Tecan</td><td>Tecan Infinite 200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>QDB plate</td><td>Yantai Zestern Co.Ltd</td><td></td><td>Plates zijn beschikbaar op aanvraag voor verificatiedoeleinden, per e-mail of via www.zestern.net.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td><td>jackson</td><td>&nbsp;711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Enhanced chemiluminesence substraat</td><td>Thermo</td><td>32134</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-CAPG&nbsp;</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-T52</td><td></td></tr><tr><td>CAPG-eiwit</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-HNAE</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td><td>10461220</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20120802</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>BNN1913</td><td></td></tr><tr><td>Na2P2O7</td><td>Haituo Chinese medicine test</td><td>20160914</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>fenylmethylsulfonylfluoride</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin</td><td>Sigma</td><td>Z290033</td><td></td></tr><tr><td>leupeptine</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>aprotinine</td><td>Sigma</td><td>A3428</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T6455</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Bromfenolblauw</td><td>Sigma</td><td>B-0126</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput, absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve dot analyse (qdb) van de vlek

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Bij gebrek aan een handige, belemmert kwantitatieve, hoge doorvoer immunoblot methode voor absolute bepaling van het gehalte van een specifiek eiwit op cellulair en weefsel niveau aanzienlijk de vooruitgang in Proteoom onderzoek. Resultaten afgeleid van de momenteel beschikbare immunoblot technieken zijn ook relatief, elke poging tot onafhankelijke studies combineren met een grootschalige analyse van EiwitSteekproeven voorkomen. In deze studie tonen wij het proces van kwantitatieve dot vlekkenanalyse (QDB) om absolute kwantificering in een hoge doorvoer-indeling. Met behulp van een standaard verkrijgbare eiwit, zijn wij in staat om te bepalen van de absolute hoeveelheid van de aftopping van actine eiwit, gelsolin-achtige (CAPG) in EiwitSteekproeven bereid uit drie verschillende muis weefsels (nieren, milt en prostaat) samen met een gedetailleerde uitleg van de experimentele gegevens. Wij stellen de QDB analyse als een handige, kwantitatieve, hoge doorvoer immunoblot methode van absolute kwantificering van individuele eiwitten op het niveau van cellulaire en weefsel. Deze methode zal aanzienlijk steun biomerker validatie en verificatie van het traject in verschillende gebieden van biologische en biomedische onderzoek.

De vaststelling van de absolute hoeveelheid van een eiwit met inbegrip van de CAPG eiwitten in muis weefsel vereist zowel een specifiek antilichaam en een gezuiverde eiwit als standaard. Het lineaire bereik van de analyses van het eiwit standaard én de lysates moet ook worden vastgesteld voordat een grootschalige analyse. Het lineaire bereik van het antilichaam is sterk afhankelijk van het antilichaam per se, en het bereik van de aangewezen verdunning van een specifiek antilichaam moeten door elke afzonderlijke gebruiker worden geverifieerd.
Wij vastbesloten eerst de specificiteit van het antilichaam van de CAPG in muis nier, milt- en prostaatkanker weefsels met behulp van westelijke vlekkenanalyse met de negatieve controle (IgG gratis BSA) en de positieve controle (verkrijgbare CAPG eiwit)(Figuur 1). Het antilichaam van de anti-CAPG was specifiek tegen lysates van muis milt, hart, spieren en prostaat (één band gedetecteerd). Niet-specifieke banden werden waargenomen in lysates van nieren en lever. Echter, in nier lysate, de niet-specifieke banden waren aanzienlijk zwakker dan de specifieke band, die suggereert dat het antilichaam is geschikt voor nier weefsel analyse. Vervolgens werden de lineaire bereik van het standaard eiwit en de hoeveelheid lysates voor analyses vastgesteld door twee naast elkaar dosis krommen. Een commercieel verkrijgbare CAPG eiwit was serieel verdund zoals aangegeven in tabel 1 op basis van onze ervaringen uit het verleden, en de lysates weefsel van de muis nieren, milt en prostaat waren ook verdund gebaseerd op het bedrag van totale eiwitten in de lysates bepaald door een BCA kit voor de bepaling van de totale proteïne. Twee dosis studies werden uitgevoerd naast elkaar en samen weergegeven in Figuur 1B. De juiste hoeveelheid lysates van muis nieren, de milt en de prostaat werden gekozen op basis van de signalen van de QDB gemeten door de lezer microplate in willekeurige eenheid. De oorspronkelijke lezing voor dit experiment is weergegeven in tabel 3.
In de laatste stap, de serieel verdunde CAPG eiwit standaard en de lysates van muis nier, waren op de plaat QDB milt en prostaat geladen. In dit geval, kozen we te laden 0,3 µg/monster voor lysates van muis nier en milt en 1 µg/monster voor lysates muis prostates analusis, zoals op deze niveaus, de QDB lezing was op zijn minst 20-fold op de achtergrond terwijl goed binnen het lineaire bereik van de analyse gebaseerd op de curve van de dosis van zowel de lysates en het eiwit standaard. De plaat werd onderworpen aan het beschreven QDB protocol voordat de plaat werd gekwantificeerd rechtstreeks door de microplate-lezer. Met behulp van het serieel verdunde, gezuiverde CAPG-eiwit, kan er een dosis-responscurve, de vergelijking en R2 door enkelvoudige regressie-analyse met behulp van beschikbare software (bijvoorbeeld Microsoft office excel). De QDB signalen van lysates van muis nieren, milt en prostates werden bekeerd tot het absolute bedrag van CAPG eiwitten in deze lysates met behulp van de gevestigde vergelijking, en de resultaten werden gecorrigeerd door de totale proteïne bedrag, in dit geval 0,3 µg voor lysates uit muis milt en nieren, en 1 µg voor lysates van muis prostates, voor de uiteindelijke concentratie van CAPG eiwitten in deze weefsels als pg/µg. De resultaten worden weergegeven in Figuur 1C met de oorspronkelijke lezing weergegeven in tabel 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> Figuur 1 . Representatief resultaat van een QDB analyse om te bepalen van de absolute niveaus van het CAPG in drie muis weefsels (nier-, milt- en prostaatkanker). A. behandeling van de specificiteit van konijn anti-CAPG antistof met behulp van de muis weefsel lysates bereid uit de milt, hart, spieren, nieren, lever en prostaat met behulp van westerse analyse van de vlek met de negatieve controle (IgG gratis BSA) en de positieve controle (commercieel beschikbaar CAPG eiwit). B. vaststelling van de lineaire bereik van QDB analyses van konijn anti-CAPG antistof met behulp van lysates bereid uit de prostaat, nieren, milt, en met behulp van gezuiverd recombinant CAPG eiwit standaard. De resultaten waren een gemiddelde van triplicates. C. Absolute gehaltebepaling CAPG in lysates bereid uit prostates muis nieren en milt. Elke staaf vertegenwoordigt een weefsel van een individuele muis. De resultaten waren de gemiddelde van drievoud. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> Tabel 3: Gevolg van microplate lezer van de studies van de dosis met behulp van zowel serieel verdund, gebundelde lysates van muis milt, nieren, en prostates en gezuiverde recombinante CAPG eiwit.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
Tabel 4: Resultaat van microplate lezer van de QDB analyse van het absolute CAPG in muis nieren (8), de milt (4) en de prostates (5) het gebruik van een recombinant eiwit CAPG als standaard.

Hier tonen we een gedetailleerd proces van kwantitatieve dot vlekkenanalyse (QDB) door de vaststelling van de absolute inhoud van een gerichte eiwit, aftopping actine eiwit, gelsolin-achtige (CAPG), in drie verschillende muis weefsels. We tonen een hoge doorvoer, handige, kwantitatieve immunoblot techniek voor biomerker validatie op het niveau van cellulaire en weefsel.

High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Deze methode kan ELISA op weefselniveau worden genoemd om zich te onderscheiden van de traditionele relatieve semi-kwantitatieve kwantificering van eiwitgehalte op cellulair en weefselniveau, wat momenteel de norm is in het onderzoekslaboratorium en in het klinisch diagnostisch veld. De belangrijkste voordelen van deze techniek kunnen in drie woorden worden beschreven: hoog-doorvoer, kwantitatief en absoluut. Als we nog een woord zouden toevoegen, zou dat eenvoudig zijn.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het proteomics-gebied, waarbij de verificatie van de biomarkers kan worden bereikt in hoog-doorvoerformaat. Deze methode heeft brede toepassingen in het onderzoeks- en klinische veld. De kwantificering van het eiwitgehalte op cellulair en weefselniveau is op dit moment nog primitief.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode geen probleem ondervinden bij het leren van deze techniek en deze is vrij eenvoudig en vereist minimale laboratoriumvaardigheden om uit te voeren. We zijn enthousiast om de betrouwbaarheid, eenvoud en nauwkeurigheid van de techniek te demonstreren met behulp van het diermodel. De monsters kunnen worden bereid met elke traditionele methode van monstervoorbereiding met behulp van eventuele lysisbuffers die gewoonlijk worden gebruikt in het onderzoekslaboratorium, met of zonder detergent zoals MP40 of Triton X. In ons geval gebruiken we Triton X lysisbuffer.Plaats een plakje weefsel van vijf tot 100 milligram in een buisje van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 200 microliter lysisbuffer aan met protease- en fosfataseremmers. Homogeniseer vervolgens het weefsel gedurende één minuut op ijs met een homogenisator.Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 8.000 keer g bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant in nieuwe buisjes en neem één microliter ervan voor het meten van het totale eiwitgehalte in het eiwitlysaat met behulp van een eiwitbepalingskit zoals een BCA-test. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en meet vervolgens de absorptie op 562 nanometer op een microplaatlezer.In deze stap, gebruik een recombinant eiwit met bekende concentratie als standaard, verdun het eiwit tot een concentratie van 12.000 picogram per microliter als voorraadoplossing. Verdun ondertussen de bereide monsterlysaten tot vier microgram per microliter. Om betrouwbaardere resultaten te bereiken, raden we aan een mengsel van monsterlysaten te gebruiken om eventuele verschillen tussen individuele monsters te vermijden.Verdun zowel het standaardeiwit als de bereide monsters stap voor stap voor een typische dosisstudie. BSA werd toegevoegd om ongeveer gelijke hoeveelheden van het eiwit te laden voor elk monster. Meng vervolgens 10 microliter van het stap voor stap verdunde standaardeiwit of monsterlysaat met 10 microliter van 2X-laadbuffer.Verwarm vervolgens het mengsel gedurende vijf minuten bij 85 graden Celsius. Plaats in deze procedure een lege pipettipdoos onder de QDB-plaat om te voorkomen dat de bodem van de plaat het tafeloppervlak raakt. Laad maximaal twee microliter van het monster in het membraancentrum aan de onderkant van een individuele eenheid van de QDB-plaat.Laat de bodem van de QDB-plaat nooit een oppervlak raken tijdens het laden en laad niet te veel voor een individueel putje. In onze ervaring, niet meer dan vier microliter per putje. Laat vervolgens de geladen QDB-plaat een uur op kamertemperatuur staan of laat deze 15 minuten op 37 graden Celsius staan in een goed geventileerde ruimte.Om de plaat te blokkeren, dompel de QDB-plaat in de overdrachtsbuffer en schud deze zachtjes gedurende 10 seconden. Spoel de QDB-plaat vervolgens drie keer voorzichtig af met TBST en was de plaat vervolgens vijf minuten in TBST onder constant schudden. Blokkeer vervolgens de QDB-plaat met blokkeerbuffer gedurende één uur onder constant schudden.Verdun nu het primaire antilichaam in de blokkeerbuffer in een gekozen concentratie en voeg 100 microliter ervan toe aan elke individuele put van een gewone 96-putjesplaat. Plaats de QDB-plaat in de 96-putjesplaat en incubeer de gecombineerde platen gedurende twee uur op kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius onder constant schudden. Spoel vervolgens de plaat drie keer voorzichtig af met TBST voordat deze drie keer gedurende vijf minuten onder constant schudden met TBST wordt gewassen.Verdun vervolgens het secundaire antilichaam in de blokkeerbuffer in de gekozen concentratie en verdeel 100 microliter in elk putje van een 96-putjesplaat. Incubeer vervolgens de QDB-plaat binnen de geladen 96-putjesplaat gedurende één uur op kamertemperatuur onder constant schudden. Spoel de QDB-plaat voorzichtig drie keer af met TBST en was vervolgens de plaat drie keer vijf minuten met TBST onder constant schudden.Voor kwantificering, bereid ECL-substraat voor en verdeel het in een 96-putjesplaat bij 100 microliter per putje. Plaats vervolgens de QDB-plaat in de 96-putjesplaat gedurende twee minuten onder constant schudden. Verwijder vervolgens de QDB-plaat uit de 96-putjesplaat en schud kort om het overtollige vocht te verwijderen.Plaats vervolgens de plaat op een witte microtiterplaat. Schakel vervolgens de microplaatlezer in en selecteer plaat met deksel op de gebruikersinterface voordat u de gecombineerde platen in de microplaatlezer plaatst voor kwantificering. Zorg ervoor dat u de plaat met deksel kiest om fouten te voorkomen.Deze figuur toont de specificiteit van konijn anti-CAPG-antilichaam met behulp van muisweefsellysaten bereid uit milt, hart, spier, nier, lever en prostaat met behulp van western blot-analyse. De lineaire bereik van QDB-analyse van konijn anti-CAPG-antilichaam met behulp van lysaten bereid uit prostaat, nier, milt en behulp van gezuiverd recombinant CAPG-eiwitstandaard werd gedefinieerd. De resultaten waren een gemiddelde van drievoudig.En hier getoond is de absolute bepaling van CAPG-niveaus in lysaten bereid

high-throughput-absolute-determination-content-selected-protein-at

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

This video demonstrates a quantitative dot blot, or QDB, technique for the absolute quantification of proteins of interest in a tissue sample. The proteins in the sample are immobilized on the nitrocellulose membrane inside the wells of a QDB plate. Utilizing target protein-specific antibodies labeled with a peroxidase enzyme, a chemiluminescent substrate is oxidized to produce light, which is measured to determine the protein concentration of the sample.

Quantitative Dot Blot to Estimate Target Proteins in a Tissue Lysate

The video demonstrates a total protein normalization-based western blotting technique for quantifying the target protein expression in a sample. By utilizing the total protein staining of the sample, a ratiometric analysis is performed to determine the relative expression level of the target protein.

Quantitative Western Blotting to Estimate Protein Expression Levels

De vooruitgang van westerse blotting met behulp van fluorescentie heeft de detectie van subtiele veranderingen in eiwitexpressie mogelijk gemaakt, waardoor kwantitatieve analyses mogelijk zijn. Hier beschrijven we een robuuste methodologie voor de detectie van een reeks eiwitten in verschillende soorten en weefselsoorten. Er wordt ook een strategie geboden om veelvoorkomende technische problemen te overwinnen.

A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Hier presenteren we adresseerbare druppel microarrays (ADMs), een druppel array gebaseerde methode kunnen bepalen van absolute eiwit overvloed in afzonderlijke cellen. We laten de mogelijkheid van ADMs te karakteriseren de heterogeniteit in de expressie van de tumor suppressor eiwit p53 in een menselijke kanker cellijn zien.

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Capillaire elektrisch gericht is een antilichaam gebaseerde, ultrasensitive, hoge doorvoer techniek, waardoor gedetailleerde karakterisering van eiwitten en hun isoforms van extreem kleine biologische monsters. Het volgende beschrijft een protocol voor de detectie en kwantificering van specifieke proteïnen en hun isoforms in een geautomatiseerd en gerobotiseerd wijze.

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

We beschrijven een recent ontwikkeld immunoassayplatform gebaseerd op de principes van celvrije synthetische biologie en de dot-blot-techniek voor aanpasbare detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera.

Celvrije dot blot als een praktisch en aanpasbaar immunoassayplatform voor de detectie van antilichaamrespons in menselijke en dierlijke sera

Leer kwantitatieve dot-blotanalyse (QDB) voor absolute eiwitbepaling in muizenweefsels. Deze eenvoudige, hoogdoorvoermethode biedt betrouwbare resultaten voor biomarker validatie in proteomics onderzoek.

High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek (Video) | JoVE Journal

High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek

Meer video's verkennen