High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek
21 augustus 2018
Hier tonen we een gedetailleerd proces van kwantitatieve dot vlekkenanalyse (QDB) door de vaststelling van de absolute inhoud van een gerichte eiwit, aftopping actine eiwit, gelsolin-achtige (CAPG), in drie verschillende muis weefsels. We tonen een hoge doorvoer, handige, kwantitatieve immunoblot techniek voor biomerker validatie op het niveau van cellulaire en weefsel.
Deze methode kan ELISA op weefselniveau worden genoemd om zich te onderscheiden van de traditionele relatieve semi-kwantitatieve kwantificering van eiwitgehalte op cellulair en weefselniveau, wat momenteel de norm is in het onderzoekslaboratorium en in het klinisch diagnostisch veld. De belangrijkste voordelen van deze techniek kunnen in drie woorden worden beschreven: hoog-doorvoer, kwantitatief en absoluut. Als we nog een woord zouden toevoegen, zou dat eenvoudig zijn.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het proteomics-gebied, waarbij de verificatie van de biomarkers kan worden bereikt in hoog-doorvoerformaat. Deze methode heeft brede toepassingen in het onderzoeks- en klinische veld. De kwantificering van het eiwitgehalte op cellulair en weefselniveau is op dit moment nog primitief.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode geen probleem ondervinden bij het leren van deze techniek en deze is vrij eenvoudig en vereist minimale laboratoriumvaardigheden om uit te voeren. We zijn enthousiast om de betrouwbaarheid, eenvoud en nauwkeurigheid van de techniek te demonstreren met behulp van het diermodel. De monsters kunnen worden bereid met elke traditionele methode van monstervoorbereiding met behulp van eventuele lysisbuffers die gewoonlijk worden gebruikt in het onderzoekslaboratorium, met of zonder detergent zoals MP40 of Triton X. In ons geval gebruiken we Triton X lysisbuffer.
Plaats een plakje weefsel van vijf tot 100 milligram in een buisje van 1,5 milliliter. Voeg vervolgens 200 microliter lysisbuffer aan met protease- en fosfataseremmers. Homogeniseer vervolgens het weefsel gedurende één minuut op ijs met een homogenisator.
Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 8.000 keer g bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant in nieuwe buisjes en neem één microliter ervan voor het meten van het totale eiwitgehalte in het eiwitlysaat met behulp van een eiwitbepalingskit zoals een BCA-test. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en meet vervolgens de absorptie op 562 nanometer op een microplaatlezer.
In deze stap, gebruik een recombinant eiwit met bekende concentratie als standaard, verdun het eiwit tot een concentratie van 12.000 picogram per microliter als voorraadoplossing. Verdun ondertussen de bereide monsterlysaten tot vier microgram per microliter. Om betrouwbaardere resultaten te bereiken, raden we aan een mengsel van monsterlysaten te gebruiken om eventuele verschillen tussen individuele monsters te vermijden.
Verdun zowel het standaardeiwit als de bereide monsters stap voor stap voor een typische dosisstudie. BSA werd toegevoegd om ongeveer gelijke hoeveelheden van het eiwit te laden voor elk monster. Meng vervolgens 10 microliter van het stap voor stap verdunde standaardeiwit of monsterlysaat met 10 microliter van 2X-laadbuffer.
Verwarm vervolgens het mengsel gedurende vijf minuten bij 85 graden Celsius. Plaats in deze procedure een lege pipettipdoos onder de QDB-plaat om te voorkomen dat de bodem van de plaat het tafeloppervlak raakt. Laad maximaal twee microliter van het monster in het membraancentrum aan de onderkant van een individuele eenheid van de QDB-plaat.
Laat de bodem van de QDB-plaat nooit een oppervlak raken tijdens het laden en laad niet te veel voor een individueel putje. In onze ervaring, niet meer dan vier microliter per putje. Laat vervolgens de geladen QDB-plaat een uur op kamertemperatuur staan of laat deze 15 minuten op 37 graden Celsius staan in een goed geventileerde ruimte.
Om de plaat te blokkeren, dompel de QDB-plaat in de overdrachtsbuffer en schud deze zachtjes gedurende 10 seconden. Spoel de QDB-plaat vervolgens drie keer voorzichtig af met TBST en was de plaat vervolgens vijf minuten in TBST onder constant schudden. Blokkeer vervolgens de QDB-plaat met blokkeerbuffer gedurende één uur onder constant schudden.
Verdun nu het primaire antilichaam in de blokkeerbuffer in een gekozen concentratie en voeg 100 microliter ervan toe aan elke individuele put van een gewone 96-putjesplaat. Plaats de QDB-plaat in de 96-putjesplaat en incubeer de gecombineerde platen gedurende twee uur op kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius onder constant schudden. Spoel vervolgens de plaat drie keer voorzichtig af met TBST voordat deze drie keer gedurende vijf minuten onder constant schudden met TBST wordt gewassen.
Verdun vervolgens het secundaire antilichaam in de blokkeerbuffer in de gekozen concentratie en verdeel 100 microliter in elk putje van een 96-putjesplaat. Incubeer vervolgens de QDB-plaat binnen de geladen 96-putjesplaat gedurende één uur op kamertemperatuur onder constant schudden. Spoel de QDB-plaat voorzichtig drie keer af met TBST en was vervolgens de plaat drie keer vijf minuten met TBST onder constant schudden.
Voor kwantificering, bereid ECL-substraat voor en verdeel het in een 96-putjesplaat bij 100 microliter per putje. Plaats vervolgens de QDB-plaat in de 96-putjesplaat gedurende twee minuten onder constant schudden. Verwijder vervolgens de QDB-plaat uit de 96-putjesplaat en schud kort om het overtollige vocht te verwijderen.
Plaats vervolgens de plaat op een witte microtiterplaat. Schakel vervolgens de microplaatlezer in en selecteer plaat met deksel op de gebruikersinterface voordat u de gecombineerde platen in de microplaatlezer plaatst voor kwantificering. Zorg ervoor dat u de plaat met deksel kiest om fouten te voorkomen.
Deze figuur toont de specificiteit van konijn anti-CAPG-antilichaam met behulp van muisweefsellysaten bereid uit milt, hart, spier, nier, lever en prostaat met behulp van western blot-analyse. De lineaire bereik van QDB-analyse van konijn anti-CAPG-antilichaam met behulp van lysaten bereid uit prostaat, nier, milt en behulp van gezuiverd recombinant CAPG-eiwitstandaard werd gedefinieerd. De resultaten waren een gemiddelde van drievoudig.
En hier getoond is de absolute bepaling van CAPG-niveaus in lysaten bereid
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor kwantitatieve dot blot-analyse (QDB) om het absolute gehalte van het capping actin protein, gelsolin-like (CAPG), in diverse muisweefsels te bepalen. De techniek kenmerkt zich door een hoge doorvoer, eenvoud en kwantitatieve nauwkeurigheid, waardoor deze geschikt is voor de validatie van biomarkers.
Belangrijke Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Proteomics
Achtergrond
- Traditionele methoden voor eiwitkwantificering zijn vaak semi-kwantitatief.
- High-throughput technieken zijn nodig voor effectieve biomarker-validatie.
- QDB biedt een betrouwbaar alternatief voor absolute eiwitmeting.
- Eenvoudige protocollen maken het toegankelijk voor onderzoekers met minimale laboratoriumvaardigheden.
Doel van de studie
- Om een high-throughput methode voor absolute eiwitkwantificering te demonstreren.
- Om de techniek te valideren met behulp van CAPG als biomarker in weefsels van muizen.
- Om een direct protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Monsterpreparatie met behulp van traditionele lysisbuffers.
- Homogenisatie en centrifugatie van weefselmonsters.
- Gebruik van een recombinant eiwitstandaard voor kwantificering.
- Sequentiële verdunning en het laden van monsters op QDB-platen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van CAPG-niveaus in muisweefsels.
- Aangetoonde lineaire range van de QDB-analyse met diverse weefselslysaten.
- Resultaten toonden betrouwbaarheid en nauwkeurigheid over meerdere monsters.
- De techniek kan binnen enkele uren worden voltooid wanneer deze correct wordt uitgevoerd.
Conclusies
- QDB is een waardevolle tool voor absolute eiwitkwantificering.
- De methode is eenvoudig en kan snel worden onder de knie gekregen door nieuwe gebruikers.
- Het kent brede toepassingen in zowel onderzoeks- als klinische omgevingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve dot blot-analyse (QDB) vult een kritisch gat in de proteomics door absolute, high-throughput proteïnekwantificering op weefselniveau mogelijk te maken, wat essentieel is voor biomarker-validatie en pathway-verificatie. De methode levert betrouwbare, reproduceerbare gegevens die vergelijkingen tussen studies en grootschalige analyses ondersteunen, waardoor mechanistische ambiguïteit bij target-validatie wordt verminderd. De eenvoud en de minimale vaardigheidseisen vergemakkelijken de organisatiebrede adoptie in discovery- en translationele workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt absolute kwantificering van doelwitproteïnen zoals CAPG mogelijk, wat bijdraagt aan de toetsing van therapeutische hypothesen en biologische risicoreductie.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van eenvoudige lysisbuffers en standaard laboratoriumapparatuur, waardoor minimale training nodig is voor een consistente uitvoering.
- Voorspellende waarde: Genereert gegevens over het lineaire bereik op basis van recombinante standaarden, wat het vertrouwen in beoordelingen van target engagement en pathway-modulatie vergroot.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, absolute eiwitmetingen die betrouwbare screening van verbindingen en dosis-responsanalyse mogelijk maken.
- Operationele waarde: Compatibel met 96-well plate-formaten en microplate-readers, wat de schaalbaarheid van high-throughput screening ondersteunt.
- Hergebruikpotentieel: Vestigt een gestandaardiseerd, overdraagbaar assayplatform voor longitudinale eiwitmonitoring over verschillende monstersets.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische stadia door eiwitgegevens op weefselniveau te leveren die relevant zijn voor ziektemodellen.
- Risicobeperking: Ondersteunt biomarker-validatie met absolute waarden, waardoor het vertrouwen in de relatie tussen target en ziekte wordt vergroot.
- Continuïteit: Maakt consistente eiwittracking mogelijk vanaf de vroege ontdekking tot aan de preklinische validatie met behulp van dezelfde kwantitatieve methode.
Integratie van Pipeline & Workflow
QDB past binnen het continuüm van ontdekking door absolute eiwitkwantificering te bieden die doelwitvalidatie informeert, assay-ready screening mogelijk maakt en translationele continuïteit ondersteunt via reproduceerbare, kwantitatieve resultaten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests en de verduidelijking van pathways via absolute meting van target-proteïneniveaus in ziekterelateerde weefsels.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve read-outs die compatibel zijn met high-throughput compound-evaluatie en hit-bevestiging.
- Analytics: Genereert absolute concentratiegegevens (bijv. pg/µL) die directe vergelijking tussen monsters, condities en studies mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van biomarkers door proteïnegegevens op weefselniveau te leveren die correleren met fenotypische of klinische eindpunten.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare, platformonafhankelijke capaciteit voor proteïnekwantificatie over projecten en therapeutische gebieden heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door semi-kwantitatieve variabiliteit te elimineren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor blokkeren, wassen en detectiestappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door absolute proteinedata te leveren voor targetprioritering en portfoliotriage.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgangsbeslissingen mogelijk op basis van geverifieerde targetexpressieniveaus in relevante weefsels.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunoblotting, antilichaamvalidatie en het hanteren van eiwitstandaarden.
- Afhankelijk van toegang tot microplaatlezers, incubatoren en standaard lysisbuffers (bijv. Triton X).
- Vereist standaardisatie tussen teams van antilichaamverdunningen, loadvolumes en incubatietijden.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen is afhankelijk van de weefselspecifieke lyse-efficiëntie en de toegankelijkheid van antigenen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van gevalideerde antilichamen en optimalisatie van blokkerings- en wasstappen om achtergrondruis te minimaliseren.
