Name: Gestroomlijnde 3D cerebellaire differentiatie Protocol met optionele 2D wijziging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer een gestroomlijnd 3D differentiatieprotocol voor cerebellaire celtypen uit pluripotente stamcellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar mechanismen van kinderhersenaandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar Gerbren Jacobs en Jurjen Broeke voor hun deskundige technische bijstand, Prisca Leferink om bij te dragen aan de generatie en karakterisering van twee controle iPSC lijnen, en Lisa Gasparotto voor het aantonen van onze procedures.

<ol><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li>
<li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).</li>
<li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li>
<li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li>
<li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed%2C+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li>
<li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otx2%2C+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li>
<li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. <a target="_blank" href="https://elsevier.ca/product.jsp?isbn=9780323352147">Fetal and Neonatal Physiology</a>. , 5th ed, (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6%2C+Tbr2%2C+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Complexiteit en de kosten zijn relevante factoren voor stamcel onderzoekers wanneer kiezen of ontwikkelen van differentiatie protocollen. Dit is vooral waar als het is een open vraag voor hoeveel externe controle is vereist voor het genereren van de gewenste celtypes, of — vormen het anders — hoe bevoegde hPSCs zijn op het produceren van hun eigen ontwikkelings omgeving, als aan zichzelf overgelaten met voldoende voedingsstoffen. Invoering van extrinsieke factoren in vitro kan heel goed gewenste cel producten produceren, maar ze ook kunnen interfereren met de intrinsieke developmental capaciteiten cellen zou hebben tentoongesteld in vivo. Dergelijke overwegingen zijn belangrijk, met name als het doel gebruik van patiënt-afgeleide iPSCs voor ziekte modelleren is. Extensief gebruik van patronen en/of factoren die de groei kan ziekte fenotypen maskeren. De protocollen die in dit verslag beschreven volgen de trend van eerdere studies te verminderen van complexiteit, kosten en/of het gebruik van patronen van extrinsieke factoren8,9.
Op basis van resultaten gerapporteerd door Muguruma et al., en onze eigen recente studie, blijkt dat het mogelijk is te bereiken van differentiatie naar cerebellaire lot zonder gezamenlijke inspanningen te reproduceren in vivo voorwaarden, zoals eerdere studies hebben gedaan 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. het intrigerende deel is dat de twee studies verschillende sets van groeifactoren gebruikt, suggereren dat noch set noodzakelijk waren, hoewel beide FGF2 gebruikt. We liepen aanvullende tests, waar FGFs selectief uitgesloten van het protocol, en toonde aan dat cellen geschikt waren voor het genereren van dezelfde producten zonder extrinsieke FGFs-10. Verschillen tussen onze studies waren gekwalificeerd door het feit dat we verschillende hPSC lijnen en cultuur-methoden gebruikt Neurale differentiatie met RA geïnduceerde en onderdelen opgenomen ter ondersteuning van de overleving van de cel van de submodule en rijping (BDNF, GDNF SAG en KCL)11 -14. Daarnaast is het een minder complexe opstartmethode, ten opzichte van Muguruma et al., werkte. Hun protocol begon door het genereren van uniform EBs in 96WPs, die hen fysisch en chemisch geïsoleerd van elkaar. Het protocol hier had alle PSC's relatief druk samen in 6WPs tijdens EB vorming, waardoor ze vrij communiceren. Hoe dit kan hebben differentieel beïnvloed de fysische en chemische milieu van EBs en later organoids (met inbegrip van intrinsieke productie van signalering van verbindingen) is onbekend, en kan worden onderzocht. Ook, terwijl wij uitdrukking van tonen genen geassocieerd met — en zo suggestief van-cerebellaire oorsprong, gelegen binnen structuren morfologisch vergelijkbaar zijn met die gemeld door Muguruma et al., we kunnen niet uitsluiten generatie van neuronale-achtige structuren die zijn van niet-cerebellaire identiteit. Toekomstige studies, met behulp van een groot paneel van antistoffen zoals die gerapporteerd door Muguruma et al. (dat wil zeggen, ATOH1, CALB, etc.) wil dergelijke toewijzingen, en de vergelijking tussen producten van beide protocollen, meer overtuigend.
Binnen het 3D-protocol, het is belangrijk om te beginnen met en handhaven van een voldoende aantal cellen in een cultuur om voldoende aantallen eindproducten voor analyse. Gezien de aanzienlijke die-off vroeg in het protocol, we raden aan te beginnen met meer dan 500 EBs per putje tijdens de eerste 3 dagen in cultuur (Figuur 1). Dit moet niet moeilijk te bereiken bepaald kolonie maten voor hPSCs in feeder-vrije cultuur, maar misschien niet zo gemakkelijk voor degenen die nog steeds met behulp van feeder-afhankelijke methoden. Gezien het grote aantal cellen, is het belangrijk om op te letten voor kleurverandering in het medium (met vermelding van pH-veranderingen), en accumulatie van dode cellen. Beide moeten worden gecorrigeerd om te voorkomen dat instorting van de cultuur. Er kan ook worden samendoen van cellen en aggregaten in massieve structuren. Hoewel het nog steeds leiden aggregaten die kunnen worden geanalyseerd tot kan, zal product hoeveelheid sterk worden verminderd, zodat ze breken in kleinere aggregaten met zachte verpulvering nuttig kan zijn. Vermijd echter verontrustende normale aggregaten, die zelf kunnen groeien tot grote maten (Figuur 4). Als aggregaten te schaars geworden, is het raadzaam om te putten combineren zodat aggregaten niet volledig geïsoleerd zijn. Product variabiliteit (in aantal, de grootte en morfologie) is een bekende kwestie in 3D-celkweek, met inbegrip van voor die beginnen met geïsoleerde, uniforme EB vorming stappen, suggereren dat een minder complexe opstarten procedure (zoals het hier beschreven protocol protocollen ) zou praktischer8,15. Terwijl deze heterogeniteit is iets wat onderzoekers nodig in gedachten te houden, met name tijdens de analyse, het gerapporteerde protocol gegenereerd producten consistent zijn met die gevonden in andere 3D protocollen8,9,15. Op basis van grootte en morfologie, vallen zij binnen het bereik van neurale rozet aan cerebrale organoid, zoals beschreven in een recente review door Kelava en het huis Lancaster15, met de meeste montage van de classificatie van sferoïde. Bijzonder opmerkelijk zijn, zijn de aanwezigheid van 3D structuren suggestief van neurale rozetten met lumen, (sub) ventriculaire zones en rhombic-lip als kenmerken (Figuur 5 en Figuur 6) zoals aangegeven door andere groepen8 , 15 , 16 , 17. Aangezien elk experiment ten minste één produceerde statistische met vermeende VZ/SVZs en cerebellaire-geassocieerde markeringen (ZIC1, KIRREL2), die zijn nuttig criteria voor het bepalen van het succes van een 3D differentiatie ons protocol, met RL-achtige functies bieden van extra ondersteuning. Uitbreiding van de lengte van cultuur afgelopen 35 dagen is niet getest, maar kan worden nagestreefd om te bepalen van de maximale omvang van groei, complexiteit en looptijd toegestaan door deze techniek.
Het 2D-protocol gebruikt dezelfde niet-aanhanger EB vorming en neurale inductie proces als het 3D-protocol en zo de reacties hierboven ook toe te passen. Zodra verguld, kan een andere set van overwegingen moet worden beschouwd. De EBs moet snel houden voor cellen te verspreiden naar buiten op het bord. Als er problemen met naleving, toevoeging van RI (indien niet reeds gebruikt), verminderd volume medium of experimentele veranderingen in de concentratie van de PLO/LAM kunnen worden toegepast. Het is belangrijk dat cellen groeien te dichte of sparse (bij voorkeur volwassen tussen 20-80% confluentie) in de putten; dagelijkse controle en tijdige passaging is belangrijk, om te voorkomen dat over-confluentie of zwevende cellen. In tegenstelling tot het 3D protocol mag er geen significante die-off tijdens cultuur, hoewel er mogelijk gebieden van zwakke groei, of een vertraging van de proliferatie tarieven. Passaging is van invloed op de toestand van de rijping van cellen (bijvoorbeeld het verwijderen van cel processen en ontwikkelde netwerken tussen cellen) en moet in gedachten worden gehouden bij het naderen van de punten waar cellen zullen worden verzameld en geanalyseerd op een bepaalde manier. Bijvoorbeeld op calcium is imaging het zeer belangrijk aan passage cellen tussen 2 tot 6 dagen vóór de analyse. Te dicht bij passaging kan analyse betekenen cellen hebben geen tijd gehad om verbinding en/of volwassen, en te ver kan resulteren in cellen overbevolking, imaging bemoeilijken. Hoewel variabiliteit tussen de experimenten kan bestaan, komen resultaten overeen met die vermeld in de aanvankelijke 2D cerebellaire protocollen1,2. ICC kleuring en gen expressie analyse bevestigen de aanwezigheid van cellen positief voor submodule cel marker ZIC1, terwijl het ook het identificeren van markeringen die zijn gekoppeld aan andere neurale en cerebellaire identiteiten (Figuur 7 en Figuur 8). Calcium imaging, waarbij de elektrische stimulatie van cellen geïncubeerd met fluor5 kleurstof, aangegeven functionele Neuronale activiteit (Figuur 9, aanvullende figuur 1en aanvullende figuur 2), hoewel het is niet bevestigd als deze submodule cellen waren. Het is betwistbaar dat doordat cellen meer tijd om te rijpen door de uitbreiding van de lengte van cultuur afgelopen 35 dagen, het bedrag van functionele Neuronale activiteit moet stijgen. Dit potentieel kan in de toekomst worden onderzocht.
Naast de lijnen van het onderzoek hierboven voorgestelde, zou het van belang om te bepalen van verschillen in product identiteiten (kwantiteit en kwaliteit) tussen de 2D- en 3D-protocollen. Het belang van Extrinsieke FGFs werd niet getest in het 2D protocol, en het zou zinvol zijn om te weten of gebrek aan 3D-structuur na beplating, en dus de bijbehorende signaalroutes, zou zorg 2D culturen meer of minder afhankelijk van die vroeg patronen verbindingen. Meer uitgeklede protocollen (bijvoorbeeldgeen RA, BDNF, SAG) zijn even plausibel lijnen voor verder onderzoek. Tot slot, toekomstige studies kunnen profiteren van nieuwe onderzoekstools beter karakteriseren (en beoordelen van de efficiëntie van de generatie van) mens-specifieke cerebellaire neuronale subtypen.
Met de bepaalde kanttekeningen in het achterhoofd, beide gemeld protocollen voor cerebellaire differentiaties, met producten die geschikt zijn voor verschillende doeleinden kunnen worden gebruikt. Ze kunnen dienen als praktische uitgangspunten voor onderzoekers uitvoering van de pilotstudies, testen van de levensvatbaarheid van de cellijnen voor dergelijke differentiaties, of als een basismodel voor andere soorten gerichte Neurale differentiatie.

In vitro protocollen voor differentiatie van de hPSCs richting cerebellaire lineages aanvankelijk geopereerd aan het beginsel van het nabootsen van in vivo Cerebellaire ontwikkeling1,2,3,4. Als zodanig, is zij verplicht een opeenvolging van factoren leidt op bepaalde tijdstippen te rijden pro-cerebellaire patronen en rijping. De belangrijkste daarvan waren van de WNT, bone morfogenetische eiwitten (BMP's) en groeifactoren fibroblast (FGFs) met bekende rollen in medio hindbrain ontwikkeling en vorming van de organisator van de isthmic5,6,7. Natuurlijk, elke extra stap en factor betekent een toename van de arbeidsintensieve manipulaties en meer kosten voor de onderzoeker, en dus ontwikkeling eenvoudiger protocollen kan bereiken van gelijkwaardige resultaten is van belang. Deze praktische kwestie sluit mooi aan bij de hypothetische vraag, of cellen deze strakke, externe controle over hun ontwikkeling in vitro vereisen.
Een protocol gepubliceerd in 2015 gericht voor cerebellaire differentiatie, de noodzaak van het gebruik van een uitgebreid aantal groeifactoren met behulp van slechts FGF2, FGF19 en stromale cel-afgeleide factor 1 (SDF1) voor doeleinden8patronen. Deze studie ook verschilde van voorafgaande cerebellaire protocollen, met behulp van een systeem van zwevende 3D cultuur. Naast het produceren van cellen positief voor cerebellaire markeringen, bleken de hersenen "organoids" gegenereerd door hun techniek om relevante morfologie, beschikbaar in traditionele 2D enkelgelaagde culturen, zoals rhombic lip-achtige structuren tentoon te stellen. Hoewel minder complex en duur ten opzichte van groeifactoren, andere functies zoals totstandkoming van uniform embryoid organen (EBs) en cultuur in 96-wells-platen (96WPs), het procedureel ingewikkelder gemaakt tijdens de eerste stappen. Een ander 3D protocol gepubliceerd hetzelfde jaar, succesvolle differentiatie naar neurale lineages met behulp van gemeenschappelijke en goedkope cel cultuur technieken9gemeld. Hoewel deze groep corticale in plaats van cerebellaire differentiatie onderzocht, kan toepassing van hun concept voor cerebellaire differentiatie niet worden gedisconteerd.
Wij onlangs een 3D cerebellaire differentiatie-protocol met behulp van een beperkt aantal patronen factoren gemeld (namelijk FGF2, 4 en 8), evenals een vereenvoudigde setup doordat cellen in 6-Wells-platen (6WPs) in om te minimaliseren van middellange eisen10. Om te helpen bij de productie van de submodule cellen, werd egaliseren agonist (SAG) gebruikt tijdens de rijping van de definitieve stap. SAG is een minder dure chemische alternatief voor sonic hedgehog (SHH), die werden gebruikt in eerder cerebellaire protocollen, vanwege haar rol bij de bevordering van de groei van de submodule cel precursoren (GCP) in vivo1,2, 11,12,13. Differentiatie producten waren consistent met die van andere 3D-protocollen, waaronder de aanwezigheid van cerebellaire-geassocieerde markers in morfologisch relevante structuren8,9. Deze resultaten versterken het eerdere bericht dat mimicry gedetailleerde van het in vivo milieu niet noodzakelijk kan zijn voor complexe 3D in vitro differentiatie protocollen.
Naast het 3D protocol, dit verslag beschrijft een 2D protocol, ontworpen met de dezelfde snelle setup, basismaterialen, en het verminderde aantal van groeifactoren. Het is geschikt voor het produceren van cellen van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), positief voor markeringen gekoppeld vroeg neurale, cerebellaire, en submodule cel identiteiten. Daarnaast duidt calcium imaging op de aanwezigheid van functionele menselijke neuronen. De mogelijkheid om te kiezen tussen protocollen, voegt een niveau van flexibiliteit voor onderzoekers, voor diegenen die geïnteresseerd zijn in hetzij: (1) genereren specifieke cel typen, de ontwikkeling van de menselijke hersenen van (2) modellering en bijbehorende structuren, (3) analyse in enkelgelaagde geoptimaliseerd instellingen (b.v., patch-clamp opnames), of (4) cel interacties in gemengde neurale culturen. Hun eenvoudige en goedkope aard maakt ze toegankelijk voor onderzoekers die zijn toegevoegd aan het veld hPSC, of nodig basis hPSC procedures waaruit verdere differentiatie om opties te verkennen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>glutamine versterkte DMEM/F12</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>neuraal basismedium</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>ook bekend als Poly-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 medium en supplement</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC medium en supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>hPSC-geschikte adherente coating (PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>0.2 um filter</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>folie voor kweekplaten</td></tr><tr><td>cryotubes</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>trypsine-gebaseerd dissociatie-agens</td></tr><tr><td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic Acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophic Factor 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened Agonist (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Axiovert 40C microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>helderveld beeldvorming microscoop</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>helderveld beeldvorming - beeldverwerving</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>centrifuge voor celkweek</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natriumoplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologische pipetten</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serologische pipetten</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>6-wells kweekplaten</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>12-wells kweekplaten</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESCs</td><td>WiCELL</td><td></td><td>lijn H01</td></tr></tbody></table>

gestroomlijnde 3d cerebellaire differentiatie protocol met optionele 2d wijziging

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Vermindering van de complexiteit en de kosten van differentiatie protocollen is belangrijk voor onderzoekers. Deze belangstelling past met bezorgdheid over de mogelijke onbedoelde effecten dat patronen van extrinsieke factoren in menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) modellen van ontwikkeling van de hersenen of pathofysiologie introduceren kunnen, zoals ziekte fenotype maskeren. Hier presenteren we twee cerebellaire differentiatie protocollen voor hPSCs, ontworpen met eenvoudiger opstartmethode, minder patronen factoren, en minder materiële eisen dan eerdere protocollen. Onlangs, ontwikkelden we cultuur procedures, die vrij-zwevende 3-dimensionale (3D) producten consistent zijn met andere hersenen "organoid" protocollen, waaronder morphologies relevant zijn voor de modellering van de ontwikkeling van de hersenen zoals sub/ventriculaire zone- en rhombic genereren lip-achtige structuren. De tweede maakt gebruik van een aanhangend, 2D enkelgelaagde procedure volledige differentiatie, die is geschikt voor het genereren van functionele cerebellaire neuronen, zoals producten positief voor cerebellaire-geassocieerde markeringen zijn, en neuron-achtige calcium instroom vertonen getoond. Samen bieden deze protocollen wetenschappers een keuze van opties die geschikt is voor verschillende onderzoeksdoeleinden, evenals een basismodel voor het testen van andere soorten gestroomlijnde Neurale differentiatie.

Visueel overzicht van verminderde groei Factor 2D- en 3D-cerebellaire differentiatie protocollen Figuur 1 toont de algemene tijdlijn voor de 2D- en 3D-cerebellaire differentiatie protocollen, identificeren van extrinsieke factoren en tijd van plating. De typische vooruitgang voor hPSCs 3D cerebellaire differentiatie ondergaan wordt afgebeeld in Figuur 2: met hESC lijn H01 beginnen als kolonies in feeder-vrije cultuur op dag 0 (linkerbovenhoek van de figuur); ondergaan EB vorming door dag 2 (bovenste midden); groeien tot grotere cel aggregaten met herkenbaar lumen na neurale inductie met RA en FGF8 op dag 14 (rechtsboven); vorming van aggregaten van verschillende grootte en vorm op dag 28 (lager links); ontwikkelen in complexiteit met verschillende structuren van een enkele aggregaat aangegeven op dag 28 (lagere midden); en met voortgezet morfologische veranderingen aan de dezelfde structuren ten dage 35 (rechtsonder). De typische vooruitgang voor hPSCs 2D cerebellaire differentiatie ondergaan wordt afgebeeld in Figuur 3: met hESC lijn H01 als kolonies in feeder-vrije cultuur op dag 0 (linkerbovenhoek van de figuur, met de cirkel onder vermelding van gedifferentieerde cellen onder hESC kolonies) ; ondergaan EB vorming door dag 2 (bovenste midden); groeien tot grotere cel aggregaten met herkenbaar lumen na neurale inductie met RA en FGF8 op dag 13 (rechtsboven); prolifererende als Adherente cellen na beplating op dag 14 (lager links); en dan als een monolayer van cellen met een meer complex/oudere morfologie ten dage 35 onder lage (lagere midden) en hoge vergroting (rechtsonder).
3D producten vertonen Markers en structuren van vroege Neuroepithelium Figuur 2 (lagere linker afbeelding) en Figuur 4 tonen de heterogeniteit van 3D statistische morfologie gezien tijdens het kweken, als gevolg van uiteenlopende groei en/of rijping tarieven, evenals de stochastische samenvoegen of splitsen van aggregaten. Ondanks de heterogeniteit produceert elke differentiatie aggregaten exposeren vroege neurale en neuronale markers, met inbegrip van cerebellaire submodule marker ZIC1, zoals aangegeven door immunocytochemie (ICC) kleuring in Figuur 5. Nog belangrijker, blijkt Figuur 5 en Figuur 6 dat een eenvoudige 3D-cultuur, met verminderde groeifactoren, geschikt voor het genereren van aggregaten met complexe structuren gerelateerd aan de ontwikkeling van de hersenen zoals de vroege neuroepithelium en rhombic lip.
2D producten vertonen cerebellaire merkers en functionele Neuronale activiteit Terwijl 2D culturen kunnen niet complexe 3D-structuren reproduceren, zijn ze geschikt voor het genereren van cellen exposeren vroege neurale en neuronale markers, met inbegrip van cerebellaire submodule cel marker ZIC1, zoals aangegeven door ICC kleuring in Figuur 7. Gen expressie analyse via RT-PCR, ondersteunt zoals te zien in Figuur 8, ICC kleuring resultaten, hoewel de aanwezigheid van vroege submodule cel markering ATOH1 variabel tussen experimenten en lijnen is. Calcium imaging is gemakkelijker in 2D cultuur behandeld. Zoals te zien in Figuur 9, aanvullende Video 1en aanvullende Video 2, Toon elektrisch gestimuleerd cellen calcium vluchtelingenstromen die kenmerkend voor neuronale afvuren patronen zijn, suggereren generatie van functionele neuronen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Figuur 1: tijdlijn van differentiatie protocol (vanaf dag 0 van differentiatie). Ononderbroken lijn vakken geven aan wanneer specifieke factoren worden toegevoegd aan het kweekmedium en stippellijn vakken geven aan plaat-coating voor optionele 2D wijziging. Voor FGF2, de pijl-omlaag verwijst naar lagere concentraties (4 ng/mL), en de pijl-omhoog naar hogere concentraties (20 ng/mL). Dit cijfer is gewijzigd van Holmes en Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Figuur 2: vertegenwoordiger helderveld beelden van 3D protocol. hESC kolonies op d0, EBs op d2, aggregaten na inductie op d14, aggregaten van verschillende grootte en morfologie (genummerde 1-5) bij d28, een enkele aggregaat met unieke, herkenbare functies (aangegeven door brieven een-c) op d28, en zichtbare veranderingen in dezelfde functies op d35. Schaal bar = 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Holmes en Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Figuur 3: vertegenwoordiger helderveld beelden van 2D protocol. hESC kolonies een d0, EBs op d2, aggregaten na inductie op d13, na plating aggregaten op d14, na rijping op d35 zoals gezien op 5 x vergroting en 20 x vergroting. De witte cirkel in het bovenste linker paneel toont het gebied van gedifferentieerde cellen onder hESC kolonies. Schaal bar = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Figuur 4: helderveld afbeeldingen tonen van verschillende grootte en complexiteit in 3D cultuur. Aggregaten op (A)-dag 8 (hESCs), en (B) d35 (hiPSCs). De laatste afbeelding is samengesteld uit drie aparte beelden te tonen van de gehele aggregaat. Beide aggregaten kunnen zijn getroffen door het samenvoegen van kleinere aggregaten of verlies (af te breken) van structuren. Schaal bar = 200 µm. Dit cijfer wordt gepubliceerd van Holmes en Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Figuur 5: ICC beelden van 3D producten tonen relevante markers en structuren. Op cultuur d35, 3D producten vertonen: PAX6 (groen) en TBR2 (rood) door lumen van neurale rozet-achtige formatie (eerste rij); DCX (groen) en NeuN (rood) zich verbreidt vanuit de buitenrand ventriculaire zone (VZ)-zoals structuur (tweede rij); KIRREL2, een marker die zijn gekoppeld aan cerebellaire neuroepithelium (derde rij, links); en ZIC1 een markering gekoppeld aan cerebellaire submodule cellen (derde rij, rechts). Het experiment werd uitgevoerd meerdere keren gebruik van vier verschillende hPSC lijnen: hESC lijn H01 (n = 5), en iPSC lijnen hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), en hvs51 (n = 1). Pijlen wijzen naar Rhombic lip (RL)-als structuur. Schaal bar = 100 µm. Dit cijfer wordt gepubliceerd van Holmes en Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Figuur 6: grote schaal ventriculaire zone-achtige structuur in 3D product. Op cultuur d35 is een aggregaat hESC afkomstige positief voor PAX6 (groen) en TBR2 (rood) geassocieerd met vroege neuronen gevonden binnen ventriculaire zones (VZs) en de subventriculaire zones (SVZs), in vivo. (Boven) Een sterretje (*) markeert de apicale zijde van een VZ-achtige regio langs de rand van het gedefinieerde aggregaat met haakjes die aangeeft diepte/verdeling van VZ / SVZs. (midden) samengevoegde signalen show verspreide delen van PAX6 +/ TBR2-cellen grootte naar de bovenste rechterkant van de VZ. (Onder) Hogere vergroting afbeelding van de sectie aangegeven door een rechthoek in het middelste deelvenster. Schaal bar = 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Holmes en Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Figuur 7: ICC beelden van 2D producten tonen relevante markers. Op cultuur d35, 2D producten vertonen, uit hESCs (bovenste rij) en hiPSCs (onderste rij), positief voor cellen: submodule cel marker ZIC1 en trekkende cerebellaire neuron marker Label1 (kolom links); en neuronale marker neurofilament (NF) en Label1 (rechter kolom). Schaal bar = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Figuur 8: RT-PCR 2D vanproducten. mRNA uitdrukking analyse van hESC lijn H01 (bovenste rij) en hiPSC lijn hvs60 (onderste rij) aan het einde van de 2D protocol toont producten met de Elektroforese van het gel voor: submodule cel marker ZIC1, submodule cel marker ATOH1, trekkende cerebellaire neuron marker Label1, object cel marker Calbindin (CALB), spanning-afhankelijke calcium kanaal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gamma - aminoboterzuur (GABA) B receptor 1 (G-Br1), en huishouding gene EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Figuur 9: Calcium imaging/analyse van 2D producten. Op cultuur d35, werden hPSC differentiatie producten geregistreerd gedurende 2 minuten onder de Microscoop, na incubatie met fluor5 kleurstof. Bij 30 s, cellen werden elektrisch gestimuleerd voor 10 s op 10 Hz. (A) stilstaande beelden Toon hESCs bij 0 s (links) en na het begin van elektrische stimulatie op 30 s (rechts). Pijlen geven aan regio van belang (ROI) voor analyse van calcium toestroom. (B) grafische analyse weergegeven: verandering in de relatieve fluorescentie versus tijd voor ROI (wijzigen in fluorescentie = (F-F0) / f0, waar F0 = (∑F1-n) / n), met pieken van neuron-achtige voordoen vóór, tijdens, en na stimulatie. Zwarte balk geeft de lengte van elektrische stimulatie. Schaal bar (wit) = 50 µm. volledige opname voor hESC (zoals hier te zien) en een hiPSC lijn (niet afgebeeld) zijn beschikbaar in aanvullende Video 1 en aanvullende Video 2, respectievelijk. Opnames zijn in AVI-formaat, op 4 x snelheid. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Aanvullende Video 1: Calcium imaging video van 2D product uit hESC lijn H01. Op cultuur d35 kleurstof differentiatie producten uit hESC lijn H01 gedurende 2 minuten onder de Microscoop, na incubatie met fluor5 werden geregistreerd. Bij 30 s, cellen werden elektrisch gestimuleerd voor 10 s bij 10 Hz. de opnamen werden gemaakt op 2 frames/s, en verwerkt tot AVI video op ~ 7 frames/s, produceren een video duurt ~ 30 s, ~ 4 x snelheid. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende Video 2: Calcium imaging video van 2D product uit hiPSC lijn hvs51. Op cultuur d35, werden differentiatie producten uit hiPSC lijn hvs51 geregistreerd gedurende 2 minuten onder de Microscoop, na incubatie met fluor5 kleurstof. Bij 30 s, cellen werden elektrisch gestimuleerd voor 10 s bij 10 Hz. de opnamen werden gemaakt op 2 frames/s, en verwerkt tot AVI video op ~ 7 frames/s, produceren een video duurt ~ 30 s, ~ 4 x snelheid. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

We beschrijven een vereenvoudigde 3D differentiatie protocol voor hPSCs, met behulp van gedefinieerd medium en verminderd van groeifactoren, geschikt voor het genereren van cel aggregaten met vroege neuroepithelial structuren en gunstig zijn voor de cerebellaire-geassocieerde markeringen, evenals een optionele 2D modificatie voor differentiatie van cellen als een enkelgelaagde voor het genereren van functionele neuronen.

Gestroomlijnde 3D cerebellaire differentiatie Protocol met optionele 2D wijziging

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Het algemene doel van deze differentiatieculturen is om cerebellare cellijnen te genereren in 2D of 3D omgevingen.Deze methoden kunnen helpen om basisvragen te beantwoorden over nieuwe ontwikkelingen of ziektemechanismen die ten grondslag liggen aan hersenaandoeningen bij kinderen, met behulp van door patiënten afgeleide stamcellen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige start en onderhoud heeft met weinig factoren en dat het kan worden gebruikt als basis voor het testen van complexere neurale protocollen.Het demonstreren van de procedure zal Lisa zijn, een technicus uit mijn laboratorium.Om de differentiatie op te zetten met de gemodificeerde methode G-methode van het passeren van hPSC's, breng het vereiste volume neurale onderhoudsmedium over naar een steriele buis en supplement met 4 nanogram per milliliter FGF2 en tien micromolar rock-remmer.Houd vervolgens de mediumbuis op kamertemperatuur of in een waterbad bij 37

streamlined-3d-cerebellar-differentiation-protocol-with-optional-2d

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video describes a method to generate tissue slices from the mouse cerebellum. The cerebellar slices can be used for organotypic culturing that provides insights into neurodevelopmental mechanisms, including myelination dynamics.

Cerebellum Dissection and Slice Preparation: A Method to Generate Tissue Slices from Mouse Cerebellum

This video demonstrates a protocol for differentiating human induced pluripotent stem cells into cerebellar progenitors. It involves transferring stem cell colonies to an ultra-low attachment plate to form embryoid bodies, promoting differentiation with growth factors, and then transferring the embryoid bodies onto a matrix-coated plate for adhesion. Subsequent steps involve inducing cell migration and adding a maturation medium to guide the development of glutamatergic and GABAergic cerebellar...

A Technique to Generate a 2D Monolayer of Cerebellar Cells from Induced Pluripotent Stem Cells

-Nestin uiten voorouders zijn een nieuw geïdentificeerde populatie van neurale voorlopercellen in de zich ontwikkelende cerebellum. De microdissectie techniek hier gepresenteerd in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering, kan deze celpopulatie worden gezuiverd zonder contaminatie met andere cerebellaire regio's en kunnen worden gekweekt voor verdere studies.

Isolatie van Verschillende celpopulaties uit het ontwikkelen van kleine hersenen door Microdissection

Tijdens de postnataal ontwikkeling van de cerebellum, vertonen onrijpe granulecellen afkomstig uit de germinale zone verschillende modaliteiten van migratie om hun uiteindelijke bestemming te bereiken en neuronale netwerken te vestigen. Dit protocol beschrijft de bereiding van cerebellaire plakjes en de confocale macroscopische benadering die wordt gebruikt om de factoren die neuronale migratie reguleren te onderzoeken.

Ex vivo beeldvorming van postnatale cerebellaire Korrel Cell Migration met behulp van confocale Macroscopie

Kernmembraaneiwitten spelen een centrale rol in veel fundamentele biologische processen en zijn betrokken geweest bij een verscheidenheid aan menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft een nieuw Cre/Lox-gebaseerd muismodel dat de ruimtelijk-tijdelijke controle van LINC-complexen-verstoring mogelijk maakt.

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Dit protocol beschrijft een dynamisch cultuursysteem om gecontroleerde grootteaggregaten van menselijke pluripotente stamcellen te produceren en differentiatie in cerebellar organoïden verder te stimuleren onder chemisch gedefinieerde en feedervrije omstandigheden met behulp van een bioreactor voor eenmalig gebruik.

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Het huidige protocol verklaart de generatie van een 2D-monolaag van cerebellaire cellen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het onderzoeken van de vroege stadia van cerebellaire ontwikkeling.

Modellering van menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro in 2D-structuur

We presenteren een driedimensionaal (3D) in vitro differentiatieprotocol dat neurosferen van reproduceerbare grootte genereert om craniale neurale lijstcellen te produceren uit embryonale stamcellen van muizen. We laten zien dat deze methodologie de variabiliteit vermindert in vergelijking met eerdere protocollen en hoe deze kan worden gebruikt voor multiplexed assay om de ontwikkeling van craniale neurale lijstcellen te bestuderen.

Het craniale Neurale Protocol van de Lijstcellen Driedimensionaal in vitro Differentiatie voor Gemultiplexte Analyse

Leer een gestroomlijnd 3D differentiatieprotocol voor cerebellaire celtypen uit pluripotente stamcellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar mechanismen van kinderhersenaandoeningen.

Gestroomlijnde 3D cerebellaire differentiatie Protocol met optionele 2D wijziging

Meer video's verkennen