Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans
1 januari 2018
Dit protocol wordt beschreven hoe cellulaire om processen te bestuderen tijdens de cel lot conversie in Caenorhabditis elegans in vivo. Met behulp van transgene dieren, waardoor warmte-schok promotor gestuurde overexpressie van het neuron lot-inducerende transcriptiefactor CHE-1 en RNAi-gemedieerde uitputting van de regulering van de chromatine factor LIN-53 kiem naar neuron herprogrammering waarneembaar in vivo.
Het algemene doel van deze procedure is om de omzetting van kiemcellen in neuronen in C.elegans te induceren. Deze methode kan helpen bij het onderzoeken van de implicatie van biologische processen, zoals signaalroutes of epigenetica bij de regulatie van reprogrammering van cellulaire bestemmingen. Het grote voordeel van de methode die in deze video wordt beschreven, is dat in levende dieren kiemcellen kunnen worden uitgedaagd door de overexpressie van een bestemmings-inducerende transcriptiefactor.
Terwijl parallel een genetisch scherm, zoals een RNAi-screen, kan worden uitgevoerd om nieuwe factoren te identificeren die betrokken zijn bij het reguleren van cellulaire reprogrammering. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot regeneratieve therapie. Omdat deze in vivo-methode kan worden gebruikt om cellulaire reprogrammering onder verschillende ontwikkelings- en omgevingscondities te bestuderen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de reprogrammeringsstappen moeilijk te leren zijn. Omdat het fenotype van omzetting van kiemcel naar neuron, na depletie van lin-53, alleen plaatsvindt onder zorgvuldig gecontroleerde omstandigheden. Voor de RNAi-platen, laad zes centimeter platen met NGM-agar bevattende IPTG en carbencillin.
Laat ze 24 tot 48 uur op kamertemperatuur in het donker drogen. Breng ze vervolgens over naar vier graden Celsius gedurende maximaal 14 dagen. Streek vervolgens selectieve platen bevattende carbencillin en tetracycline met RNAi-bacterieklonen met L4440-plasmide dat het lin-53-gen draagt.
Gebruik een driestaps streekpatroon en zorg ervoor dat je een lege vectorcontrole plateert. Kweek vervolgens de platen een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag, pluk ten minste drie enkele kolonies en inoculeer elk van hen in een aparte kweekbuis met twee milliliter LB, aangevuld met carbencillin, maar niet tetracycline.
Plan om drie gezonde culturen per conditie te hebben. Kweek vervolgens de culturen een nacht bij 37 graden Celsius tot ze een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,6 tot 0,8 bereiken. Voeg vervolgens 500 microliter van elke bacteriecultuur toe aan een zes centimeter NGM-agar RNAi-plaat.
Incubeer de platen een nacht bij kamertemperatuur in het donker. Dit protocol is geoptimaliseerd voor BAT28-stamwormen die bij 15 graden Celsius worden bewaard, waarbij de transgenen het meest stabiel zijn. Details over de stamgenetica worden in de tekst gegeven.
Leeftijdsynchronisatie van de wormen is cruciaal. Gebruik de bleechingtechniek. Was zes centimeter NGM-agar platen met volwassenen en eieren met 800 microliter M9. Pelet de wormen vervolgens door centrifugatie en verwijder het supernatant.
Voeg vervolgens 1/2 tot een milliliter bleechingoplossing toe aan de wormen. En terwijl je de wormen onder een stereoscoop bekijkt, schud de buis tot de volwassen wormen beginnen te barsten, en verzamel dan de eieren. Scheid nu het afval van de eieren.
Centrifugeer eerst de buis en gooi het supernatant weg. Was vervolgens het pellet van weefsels drie keer met 800 microliter M9. Zorg ervoor dat je centrifugatie gebruikt om de weefsels tussen de wasbeurten samen te brengen.
Breng nu de schoongemaakte eieren over naar verse NGM-platen gezaaid met OP50-bacteriën. Controleer kort op succesvolle isolatie van embryo's en hun overdracht naar de NGM-platen. Laat de dieren groeien bij 15 graden Celsius.
Om omzetting van kiemcel naar neuron te bereiken bij depletie van lin-53, moet de depletie in de oudergeneratie beginnen. Om lin-53 te depelteren, onderwerp L4-dieren aan RNAi. Breng handmatig 50 L4-wormen per replicaat over naar een NGM RNAi-plaat zonder bacteriën.
Gebruik een platinadraad. L4-wormen kunnen worden herkend aan een witte vlek ongeveer halverwege hun ventrale zijden. Incubeer de wormen nu ongeveer zeven dagen bij 15 graden Celsius in het donker.
De IPTG is lichtgevoelig. Wanneer de F1-nakomelingen de L3- en L4-stadia bereiken, scheid ze van de grotere, dikkere ouderlijke dieren. Op dit punt screen de F1 op het uitpuilende vulva-fenotype, wat aangeeft dat de RNAi tegen lin-53 succesvol is geweest.
De RNAi-activiteit kan ook resulteren in letaliteit, die boven 15 graden Celsius toeneemt. Om che-1 te activeren en de omzetting van kiemcel naar neuron in de F1-nakomelingen te induceren, schok de wormen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in het donker. Gebruik een geventileerde incubator, omdat deze een efficiëntere hitteschok mogelijk maakt.
Na de hitteschok, incubeer platen een nacht bij 25 graden Celsius in het donker. Het is belangrijk om te voorkomen dat overexpressie van che-1 wordt geïnduceerd door hitteschok voordat de dieren het midden van het L3-stadium bereiken. Dit kan leiden tot expressie van che-1-eiwit in niet-doelgerichte weefsels.
De volgende dag, zet een fluorescentielichtbron en GFP-filter op om de dieren te onderzoeken op transgeen-afgeleide fluorescentie in het midden van het lichaam. Om de fenotypepenetrantie te beoordelen, vind de verhouding van dieren die een fluorescerend signaal uitzenden. Typisch zal ongeveer 30% een discreet GFP-signaal vertonen.
In vergelijking, bij dieren die de lege vector RNAi dragen, wordt zelfs een diffuus signaal in de geslachtslijn niet gezien in meer dan 5% van de populatie. F1-dieren die het uitpuilende vulva-fenotype vertonen, illustreren een succesvolle toepassing van lin-53 RNAi. Bij deze dieren is omzetting van kiemcellen in ASE-neuronachtige cellen na hitteschok-inductie van che-1 gebruikelijk.
Nauwkeurige inspectie onthult neuronachtige projecties die typisch zijn voor neuronen van geslachtscellen. Daarentegen toonden lege vectorcontroles minimale expressie van GFP, die hoogstens diffuus was. De kiemcellen in deze dieren misten neuronachtige kenmerken.
Toen de dieren te jong waren op het moment van inductie van che-1-overexpressie, vertoonden ze vaak ectopische transgene expressie in andere delen van he
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om cellulaire processen te bestuderen tijdens de omzetting van kiemcellen in neuronen in Caenorhabditis elegans in vivo. Door gebruik te maken van transgene dieren kunnen onderzoekers de effecten observeren van overexpressie van de neuron-lot-inducerende transcriptiefactor CHE-1 en het uitschakelen van de chromatine-regulerende factor LIN-53 via RNA-interferentie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Cellulaire biologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de herprogrammering van het cellulaire lot is essentieel voor inzichten in de ontwikkelingsbiologie.
- Transgene modellen maken real-time observatie van cellulaire processen mogelijk.
- LIN-53 staat erom bekend een rol te spelen bij de chromatine-regulatie en de cellulaire identiteit.
- CHE-1 is een transcriptiefactor die een neuronaal lot kan induceren.
Doel van de studie
- Om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de conversie van kiemcellen naar neuronen.
- Om de rol van signaleringspaden en epigenetische factoren bij cellulaire herprogrammering te verkennen.
- Om een methode te ontwikkelen die kan worden toegepast in onderzoek naar regeneratieve therapie.
Gebruikte methoden
- Transgene C. elegans die CHE-1 tot expressie brengen onder een hitte-shockpromotor.
- RNA-interferentie om LIN-53 in kiemcellen te depletion.
- Leeftijdssynchronisatie van wormen middels een bleaching-techniek.
- Hitte-shockbehandeling om CHE-1-expressie te induceren in specifieke ontwikkelingsstadia.
Belangrijkste resultaten
- Na de uitputting van LIN-53 werd een succesvolle conversie van kiemcellen in neuron-achtige cellen waargenomen.
- Ongeveer 30% van het F1-nageslacht vertoonde een fluorescentiesignaal dat wees op een succesvolle expressie van het transgen.
- Controlegroepen met RNAi van een lege vector vertoonden minimale fluorescentie, wat de specificiteit van de methode bevestigt.
- Fenotypische analyse onthulde neuron-achtige uitlopers in de geconverteerde cellen.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van cellulaire herprogrammering in vivo.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de regulatie van cellulaire identiteit en potentiële therapeutische toepassingen.
- Beheersing van deze techniek kan verder onderzoek naar cellulaire herprogrammeringsfactoren faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het herprogrammeren van kiemcellen tot neuronen in C. elegans maakt directe onderzoeken naar mechanismen van cellulaire identiteit en epigenetische regulatie in een levend systeem mogelijk. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie met een hoge betrouwbaarheid en mechanistische risicoreductie voor pathways die betrokken zijn bij beslissingen over het cellot. De methode is strategisch gepositioneerd voor vroege discovery-teams die regulatoire netwerken willen ontleden die de celidentiteit waarborgen en regeneratieve strategieën informeren.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt functionele validatie van chromatine-regulatoren en transcriptiefactoren bij herprogrammering van het cellot mogelijk.
- Ondersteunt genetische screening om nieuwe modulatoren van het behoud van de cellulaire identiteit te identificeren.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door de impact van specifieke genperturbaties op de resultaten van de herprogrammering te isoleren.
- Biedt een context in levende dieren voor het verduidelijken van pathways en het testen van hypothesen.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een robuust in vivo systeem vast voor RNAi-gebaseerde genetische screens gericht op herprogrammeringsfactoren.
- Levert kwantitatieve, op fluorescentie gebaseerde readouts voor assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid.
- Maakt schaalbare evaluatie van genfunctie mogelijk over meerdere condities en ontwikkelingsstadia.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening van verbindingen of genetische modifiers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde vragen over cellulaire plasticiteit en regeneratief potentieel.
- Zorgt voor continuïteit van genetische bevindingen in de ontdekkingsfase naar de ontwikkeling van preklinische modellen.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van targets die betrokken zijn bij de regulatie van het cellot.
- Biedt voorspellende inzichten in de haalbaarheid van therapeutische strategieën gebaseerd op herprogrammering.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, waardoor hypothese-gestuurde genetische screens en functionele validatie van herprogrammeringsfactoren mogelijk worden.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van de nulhypothese voor genfunctie bij de conversie van het celslot.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-outputs voor vergelijking tussen verschillende condities.
- Analytics: Verschaft statistische penetrantiegegevens ter ondersteuning van go/no-go-beslissingen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische bevindingen en de ontwikkeling van preklinische modellen wanneer deze in lijn zijn met ziekte-relevante pathways.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor iteratieve genetische en epigenetische analyse van diverse targets.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar celbestemming.
- Operationele waarde: Standardiseert in vivo herprogrammeringsworkflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert vroege go/no-go-beslissingen en verhoogt de kapitaalefficiëntie door biologische hypothesen te ontrisken.
- Impact op portfolio: Maakt risicogewogen prioritering van targets en pathways voor verdere ontwikkeling mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in C. elegans-genetica, RNAi en het omgaan met transgene stammen.
- Vereist toegang tot fluorescentiemicroscopie en gecontroleerde heat-shock-instrumentatie.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams van de stadia van de dieren en de inductieprotocollen.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie en validatie van het protocol vereisen.
- Fenotype-penetrantie en specificiteit zijn gevoelig voor de timing van de ontwikkeling en omgevingscondities.
