On-Site moleculaire detectie van bodem-gedragen planteziekteverwekkers met behulp van een draagbare Real-Time PCR-systeem
23 februari 2018
Snelle en nauwkeurige detectie van plant ziekteverwekkers on-site, met name bodem overgedragen ziekteverwekkers, is van cruciaal belang om te voorkomen dat verdere entmateriaal productie en verspreiding van plantenziekten in het veld. De methode ontwikkeld die hier met behulp van een draagbaar real-time PCR detectiesysteem kunt on-site diagnose onder veldomstandigheden.
Hallo, mijn naam is Joseph DeShields, ik werk bij het Department of Plant Pathology aan de Washington State University en vandaag laat ik je een protocol zien voor de detectie van bodemziekten op locatie.Diagnose van plantenziekten op het veld is cruciaal voor effectief ziektemanagement en kan uiteindelijk de secundaire verspreiding van pathogenen in het veld verminderen.Bodemgebonden pathogenen zijn bijzonder moeilijk te diagnosticeren vanwege de grote en complexe bodemomgevingen en dit kan het begrijpen van bodemgebonden ziekten moeilijk maken.Polymerasekettingreactie, ook bekend als PCR, is momenteel de meest algemeen aanvaarde gevoelige en nauwkeurige benadering voor het detecteren van plantpathogenen in het veld.Het volgende protocol demonstreert een gevoelige en on-site methode voor het detecteren van bodemgebonden pathogenen, bestaande uit een magnetische-kraal-gebaseerde DNA-extractie, PCR, die kan worden uitgevoerd met behulp van een draagbaar PCR-instrument, en data-analyse, die op afstand kan worden gedaan met behulp van een laptopcomputer.Magnetische-kraal-gebaseerde DNA-extractie.Het DNA- en RNA-extractiekit werd bereid en gebruikt volgens de instructies van de fabrikant met lichte wijzigingen.Alle reagentia werden bewaard bij kamertemperatuur en de bereide Proteinase K werd bewaard bij een 20
Overzicht
Dit artikel presenteert een draagbaar real-time PCR-detectiesysteem voor de on-site diagnose van bodenpathogenen bij planten. Snelle detectie is essentieel voor een effectieve ziektebestrijding en om de verspreiding van plantenziekten te voorkomen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Plantpathologie
- Bodemmicrobiologie
- Velddiagnostiek
Achtergrond
- Bodemgebonden pathogenen zijn moeilijk te diagnosticeren vanwege de complexe bodemomgevingen.
- Diagnostiek ter plaatse is cruciaal voor het effectief beheersen van plantenziekten.
- Polymerasekettenreactie (PCR) is een algemeen aanvaarde methode voor de detectie van pathogenen.
- Draagbare PCR-systemen maken diagnostiek in het veld mogelijk.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een gevoelige en nauwkeurige methode voor het detecteren van bodemgebonden pathogenen.
- Het demonstreren van het gebruik van een draagbaar PCR-systeem voor diagnose ter plaatse.
- Het verminderen van de secundaire verspreiding van pathogenen in landbouwsituaties.
Gebruikte methoden
- DNA-extractie op basis van magnetische korrels.
- Real-time PCR voor pathogeendetectie.
- Gebruik van een draagbaar PCR-instrument voor veldanalyse.
- Afstandsanalyse van gegevens met behulp van een laptop.
Belangrijkste resultaten
- De ontwikkelde methode maakt een snelle detectie van bodemgebonden pathogenen mogelijk.
- Veldomstandigheden kunnen effectief worden beheerd met behulp van dit draagbare systeem.
- Diagnose ter plaatse kan verdere productie van inoculum voorkomen.
- Het protocol is aanpasbaar voor diverse bodemomgevingen.
Conclusies
- Het portable PCR-systeem vergroot de mogelijkheid om bodemgebonden pathogenen in het veld te diagnosticeren.
- Snelle en nauwkeurige detectie is essentieel voor een effectieve ziektebestrijding.
- Deze methode kan een aanzienlijke bijdrage leveren aan het verminderen van de verspreiding van plantenziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Snelle detectie ter plaatse van bodemgebonden pathogenen maakt tijdige interventie in biotechnologische pijplijnen voor de landbouw mogelijk, waardoor gewasverlies wordt beperkt en voorspellende strategieën voor ziektebeheer worden ondersteund. Draagbare moleculaire diagnostiek slaat de brug tussen monstername in het veld en laboratoriumvalidatie, wat de besluitvorming in de vroege fasen van de ontwikkeling van agrochemicaliën en biopesticiden versnelt. Deze benadering verbetert de targetvalidatie in studies naar plant-pathogeeninteracties door kwantificeerbare, reproduceerbare gegevens over de pathogene load direct uit complexe milieumatrices te leveren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie van virulentiefactoren van pathogenen mogelijk via kwantitatieve detectie van DNA-kopieën in bodem.
- Operationele waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing in workflows voor targetvalidatie door reproduceerbare kwantificering van pathogenen uit in het veld verzamelde monsters te leveren.
- Voorspellende waarde: Genereert dosis-responodata voor screening van antimicrobiële of resistentie-doorbrekende verbindingen onder realistische milieuomstandigheden.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Nucleïnezuurextractie op basis van magnetische beads biedt gestandaardiseerde, inhibitor-resistente monstervoorbereiding voor high-throughput pathogeendetectie.
- Kwantitatieve output: Real-time PCR op basis van fluorogene probes levert Ct-waarden die bepalings van de detectielimiet (tot 100 kopieën) mogelijk maken voor optimalisatie van de assay.
- Overdraagbaarheid van het platform: Protocolcompatibiliteit met portable instrumenten ondersteunt gedecentraliseerde screeningsworkflows over geografisch diverse onderzoekslocaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekte-relevant systeem: Maakt gebruik van Spongospora subterranea in bodemmatrices om praktijkuitdagingen bij de detectie van pathogenen in knolgewassen te modelleren.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontwikkeling van laboratoriumassays en veldinzetbare diagnostiek, waardoor het translationele risico in de agrarische biotechnologie wordt verminderd.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt monitoring van de dynamiek van de pathogenenlast mogelijk om het werkingsmechanisme van in de bodem toegepaste biologische middelen of chemische beschermingsmiddelen te evalueren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het continuüm van ontdekking tot translationeel onderzoek door vroege pathogeenkwantificering bij doelvalidatie mogelijk te maken, standaardisatie van assays bij screening te ondersteunen en go/no-go-beslissingen te informeren bij de preklinische ontwikkeling van gewasbeschermingsmiddelen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar pathogeen-gastheerinteracties door middel van nauwkeurige kwantificering van doel-DNA in natuurlijke bodemomgevingen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor pathogeendetectie die geschikt zijn voor het evalueren van verbindingenbibliotheken in bodemgebaseerde assay-formaten.
- Analytics: Genereert reproduceerbare Ct-waarden en amplificatiecurven die statistische vergelijking van behandelingseffecten over experimentele condities ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van gecontroleerde laboratoriumassays naar veldvalidatiestudies door de assayprestaties over verschillende monstertypes constant te houden.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een draagbaar, reproduceerbaar platform voor pathogeendetectie dat toepasbaar is op meerdere gewas-pathogeensystemen binnen wereldwijde R&D-netwerken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in plant-pathogeenstudies door nauwkeurige, in het veld gevalideerde metingen van de pathogeenlast te bieden.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van pathogeendetectie op diverse veldlocaties via gestandaardiseerde extractie- en amplificatieprotocollen.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in go/no-go-beslissingen bij vroegstadium-programma's voor gewasbescherming door het percentage fout-negatieven bij pathogeendetectie te verlagen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van leidende kandidaten mogelijk op basis van aangetoonde effectiviteit onder realistische omstandigheden van pathogeendruk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire diagnostiek en plantpathologie voor het ontwerp en de interpretatie van de assay.
- Afhankelijk van toegang tot draagbare real-time PCR-instrumenten en compatibele fluorogene probesets.
- Maakt standaardisatie van protocollen voor monstername en monsterverwerking over verschillende veldlocaties noodzakelijk om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Moet rekening houden met PCR-remmers uit de bodem door validatie van de extractie-efficiëntie met magnetische beads in de doelmatrices.
- Beperkt tot detectie op basis van nucleïnezuren; beoordeelt de levensvatbaarheid of infectiviteit van pathogenen niet zonder aanvullende assays.
