Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans
20 maart 2018
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het snel produceren van honderden nematode groei media agar, 96-Wells cultuur platen met een consistent aantal Caenorhhabditis elegans per putje. Deze culturen zijn nuttig voor de fenotypische screening van hele organismen. Hier richten we ons op met behulp van deze culturen op scherm chemicaliën voor Pro-levensduur effecten.
Het algemene doel van deze techniek is om de effecten van verschillende verbindingen op het modelorganisme C.elegans in een hoogdoorvoeranalyse te testen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van scheikunde, biologie en veroudering, zoals of specifieke chemische structuren de levensduur van C.elegans verlengen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om talrijke verbindingen op een tijd-efficiënte en snelle manier te screenen.
Om massacultuurplaten voor de productie van grote aantallen wormen voor te bereiden, giet in een laminaire stroomkast eerst 30 milliliter agar van nematodengroeimedium van 60 graden Celsius op 10 centimeter grote cultuurplaten voor overnachtelijke verdichting. De volgende ochtend, voeg twee milliliter geconcentreerd E.coli toe aan elke plaat, en kanteelt en draait u de plaat om de bacteriën volledig over het plaatoppervlak te verspreiden. Wanneer de massacultuurplaten zijn opgedroogd, bewaar ze ze bij vier graden Celsius voor maximaal twee weken.
Om hoogdoorvoeranalysecultuurplaten voor screening voor te bereiden, gebruikt u een geautomatiseerd dispenser met acht kanalen om 0,15 milliliter gesmolten agar van nematodengroeimedium toe te voegen aan elke put van een 96-putjesplaat. Laat de agar een nacht lang stollen. Bewaar vervolgens de hoogdoorvoeranalyseplaten bij vier graden Celsius voor maximaal twee weken.
Om de C.elegans-culturen op te zetten, gebruikt u een wormpicker en een dissectiemicroscoop om 20 eieren over te brengen naar elke massacultuurplaat en de platen gedurende zes dagen bij 20 graden Celsius te incuberen. Op de zevende dag, gebruikt u een dissectiemicroscoop om visueel de aanwezigheid van eieren in de baarmoeder te bevestigen. Om de drachtige volwassenen te verzamelen, gebruikt u een glaspipet om twee tot drie milliliter S Basal-oplossing per plaat toe te voegen en de oplossingen met de hand rond te draaien.
Gebruik de glaspipet om de wormen over te brengen naar een 15 milliliter buis en pellet de wormen door centrifugatie. Breng de wormen opnieuw in suspensie in 10 milliliter hypochlorietoplossing en schud de buizen snel vijf seconden op en neer. Bewaar vervolgens de wormen gedurende vijf minuten op kamertemperatuur met schuddend elke 2,5 minuten.
Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de wormen opnieuw. De pellets zouden geelachtig bruin moeten zijn. Vervang de supernatants met 10 milliliter verse hypochlorietoplossing en schud de buis weer krachtig.
Incubeer de wormen nog een tot drie minuten met af en toe schudden. Wanneer er alleen nog eieren over zijn, centrifugeer de buizen en zuig de supernatants af. De pellets zouden wit moeten zijn zonder bruine verkleuring.
Gebruik steriele techniek, open de buizen in een steriele laminaire stroomkast en voeg 14 milliliter S Basal-oplossing toe aan elke pellet. Was de pellet drie keer met 14 milliliter S Basal. Na drie wasbeurten door centrifugatie, brengt u de eieren opnieuw in suspensie in twee tot drie milliliter verse S Basal-oplossing.
Om L1-stadium larvale C.elegans voor te bereiden, brengt u de supernatants over naar een steriele glazen petrischaal per buis en gebruikt u twee tot drie milliliter S Basal-oplossing om de resterende eieren uit de buizen in elke schaal te spoelen. Voeg vijf milliliter S Basal-oplossing toe aan elke schaal om overbevolking te vermijden en plaats de schaal op een orbitale shaker bij 20 graden Celsius en 20 tpm gedurende 16 tot 24 uur om het uitkomen te bevorderen. Alle uitgekomen larven zullen zich in het eerste larvale stadium vertragen vanwege een gebrek aan voedsel.
Gebruik een serologische pipet om de L1-larven over te brengen naar een 15 milliliter buis voor hun centrifugatie. Nadat alle uitgekomen L1 zijn samengevoegd door herhaalde centrifugatie en aspiratie, brengt u de larva-pellet opnieuw in suspensie in 10 milliliter steriele S Basal-oplossing. Breng vervolgens 10 microliter over naar een ongezaaide plaat en tel het aantal larven dat op de plaat aanwezig is.
Herhaal dit 10 keer om de gemiddelde dichtheid van L1's in uw oplossing te verkrijgen. Bepaal met een steriele serologische pipet het totale volume oplossing dat de L1's bevat. Gebruik vervolgens het volume van de L1-oplossing en de dichtheid van L1's in de oplossing om het totale aantal L1's in uw oplossing te berekenen.
Om de wormen op een 96-putjes hoogdoorvoeranalyseplaat te plaatsen, verdunt u de L1-suspensie tot één L1-larve per microliter in een steriele, ronde mediafles, uitgerust met een matig langzaam draaiende roerbar en laat de analyseplaten opwarmen tot kamertemperatuur. Voeg vervolgens in een laminaire stroomkast vijf microliter geconcentreerd E.coli toe aan elke put, gevolgd door 10 microliter L1-suspensie per put om een gemiddelde van 10 wormen per put te verkrijgen. Wanneer alle wormen zijn geplaatst, bedekt u de platen en incubeert u de wormen gedurende twee dagen bij 25 graden Celsius, om de larven te laten ontwikkelen tot volwassenen.
Aan het einde van de incubatie, brengt u de chemische bibliotheekplaten vanuit de bevriezing op kamertemperatuur. Schud de ontdooide platen voorzichtig gedurende één minuut op 60 tpm op een microplaatshaker direct voor gebruik. Gebruik een geautomatiseerde 96-putjes vloeistoofdhandelaar om 0,75 microliter van de verbinding van de bibliotheekplaat over te brengen naar de analyseplaat.
Wanneer alle putten zijn behandeld, laat u de verbinding uit de oppervlakte van de platen in een laminaire stroomkast gedurende vier tot acht uur drogen, en verwijdert u de afzonderlijke platen zodra ze droog zijn. Verzegeld de droge platen met transparant film en dek ze af. Draai vervolgens de platen gedurende 45 seconden op 1000 G en bewaar ze in omgekeerde positie bij 25 graden Celsius.
Om de reacties van C.elegans op de stoffen van belang te testen, kan een neg
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het produceren van hoogdichte culturen van Caenorhabditis elegans in 96-wells platen, wat fenotypische screening naar pro-longevity effecten van diverse chemicaliën faciliteert. De methode maakt efficiënt testen van talrijke verbindingen mogelijk in een high-throughput formaat.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Verouderingsonderzoek
Achtergrond
- Caenorhabditis elegans is een modelorganisme dat veelvuldig wordt gebruikt in verouderingsstudies.
- High-throughput screeningtechnieken zijn essentieel voor het evalueren van de effecten van verbindingen op de levensduur.
- Het protocol is erop gericht de bereiding van culturen te stroomlijnen voor een efficiënte experimentatie.
- Inzicht in de chemische impact op de levensduur kan bijdragen aan onderzoek naar veroudering en de ontwikkeling van therapeutica.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een snel protocol voor het kweken van C.elegans in een high-throughput formaat.
- Het beoordelen van de effecten van diverse verbindingen op de levensduur van C.elegans.
- Het bieden van een betrouwbare methode voor fenotypische screening in verouderingsonderzoek.
Gebruikte methoden
- Bereiding van nematode growth medium agar en massakweekplaten.
- Gebruik van geautomatiseerde dispensers voor high-throughput assay-platen.
- Incubatie en overdracht van C.elegans eieren naar kweekplaten.
- Screening van verbindingen op pro-longeviteitseffecten met behulp van survival assays.
Belangrijkste resultaten
- Er werden 57 hits geïdentificeerd uit een bibliotheek van 179 geteste verbindingen.
- 32% van de opnieuw geteste chemicaliën vertoonde positieve effecten op de overleving.
- De testputjes presteerden beter dan de controleputjes wat betreft de overlevingspercentages.
- Kleine screenings hebben de effectiviteit van de methode aangetoond.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol maakt efficiënte screening mogelijk van verbindingen die de levensduur van C.elegans beïnvloeden.
- De resultaten wijzen op het potentieel voor het identificeren van chemicaliën die de levensduur verlengen.
- Deze methode kan worden toegepast in verdere studies naar veroudering en chemische biologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
High-throughput fenotypische screening in C. elegans maakt de snelle identificatie van chemische modulatoren van complexe verouderingsgerelateerde fenotypen mogelijk, wat vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie ondersteunt in ontdekkingsprogramma's gericht op levensduur. De methode biedt kwantitatieve overlevingsread-outs die het voorspellend vertrouwen bij de selectie van hits en portfolio-triage verbeteren. Door de wormdichtheid en assaycondities te standaardiseren, wordt de reproduceerbaarheid over verschillende screeningscampagnes vergroot en wordt de cross-functionele afstemming tussen biologie-, chemie- en translationele teams gefaciliteerd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen met betrekking tot levensduurmodulatie en verouderingspaden mogelijk via directe fenotypische uitlezing in een context van het gehele organisme.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door chemische structuur te koppelen aan functionele resultaten in een genetisch hanteerbaar model met geconserveerde regulatoren van levensduur.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, dosisresponsieve overlevingsgegevens die structuur-activiteitsrelatieanalyse en hit-bevestiging mogelijk maken.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, hoge-densiteit plating van wormen (gem. 10 wormen/well) met minimale variatie tussen de wells, wat de robuustheid van de assay garandeert voor grote verbindingenbibliotheken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Identificeert verbindingen met pro-longeviteitseffecten in een ziekterelevant systeem, wat vroegtijdig bewijs levert voor target engagement in verouderingsmechanismen.
- Operationele waarde: Produceert schaalbare, vriesbestendige assayplates die batchverwerking en retrospectieve hit-validatie ondersteunen, zoals aangetoond bij de herhaalde test van 179 verbindingen waarbij 57 bevestigde hits werden gevonden.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot de identificatie van leads, waardoor fenotypische screening mogelijk is voorafgaand aan mechanistische follow-up in preklinische modellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en targetvalidatie door het overlevingspercentage van organismen te meten als geïntegreerde readout van genetische en chemische perturbaties.
- Screening: Garandeert de gereedheid van de assay door gesynchroniseerde plating van L1-larven en een gecontroleerde bacteriële voedseltoevoer, waardoor ontwikkelingsvariabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Analytics: Maakt kwantitatieve scoring van overlevingscurven en binning van data over het percentage levende exemplaren mogelijk om echte positieven te onderscheiden van toxiciteitsartefacten.
- Translational Research: Verbindt chemische hits aan verouderingsmechanismen via follow-up assays (bijv. mitofagie-reporters), mits ondersteund door het bronmateriaal.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor herhaalde screeningcampagnes, met assayplaten die tot twee weken stabiel blijven bij 4°C en compatibel zijn met geautomatiseerde vloeistofbehandeling.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door vals-positieven te reduceren middels replicatie en op controles gebaseerde score-drempelwaarden (bijv. testen alleen wanneer >99% van de controles dood is).
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerd bleken van wormen, L1-synchronisatie en nauwkeurige dispensatie (10 µL L1-suspensie + 5 µL E. coli per well).
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door screening van duizenden verbindingen in een tijdspanne van 2–4 weken mogelijk te maken, waardoor uitval in latere stadia wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door hit-rates te kwantificeren (32% in retest-bibliotheek) en werkzaamheid te bevestigen via hertesting.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van C. elegans, steriele technieken en hypochloriet-gebaseerde eipreparatie om contaminatie te voorkomen en de levensvatbaarheid te waarborgen.
- Is afhankelijk van automatische dispensers en liquid handlers voor consistente agar-plating en overdracht van verbindingen, om handmatige variabiliteit te minimaliseren.
- Maakt omgevingscontroles noodzakelijk (incubatoren, shakers, laminaire flow) voor gesynchroniseerd uitkomen en adultontwikkeling bij gedefinieerde temperaturen.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het gebruik van mutante of transgene stammen, aangezien het protocol vertrouwt op de ontwikkelingstijd en fertiliteit van het wildtype.
- Wordt beperkt door de noodzaak van temperatuurgevoelige steriele stammen om contaminatie door nakomelingen tijdens de incubatie van volwassenen te voorkomen, zoals vermeld in de bron.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
Nematode Growth Medium (NGM) Plates and C. elegans Mass Culture Preparation
3:24
Hatch in Buffer to Obtain Synchronized Culture of Arrested Larva
5:01
Setup and Chemical Treatment of 96-well Culture/Assay Plates
6:42
Results: Representative Compound Screening and Re-testing
8:11
Conclusion
