Name: Kwantificering van endogene auxine en cytokinine tijdens stengellid cultuur van Ipecac (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Leer hoe endogene auxine en cytokinine te kwantificeren tijdens stengellid cultuur van Ipecac met LC-MS/MS. Deze methode analyseert fytohormoonniveaus met hoge gevoeligheid voor weefselregeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij zijn dankbaar aan Mr. Akira Murakami van de Vakgroep Toegepaste biowetenschappen, Toyo Universiteit en Mr. Koudai Taniguchi van het Gunma Agricultural Technology Center voor hun technische bijstand. Wij zijn ook dank aan Professor Shosaku Kashiwada en Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo Universiteit voor hun suggesties. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door het Research Center for Life en milieuwetenschappen, Toyo Universiteit.

Opmerking: Ipecac (C. ipecacuanha) werd gebruikt in deze studie omdat het vergemakkelijkt de analyse van endogene fytohormonen.
1. groei omstandigheden voor het opwekken van onvoorziene scheuten van Ipecac
<ol><li>Phytohormone-gratis B5 medium aangepast aan de pH 5.710bereiden en toevoegen van 0,2% gellan tandvlees. Steriliseren in autoclaaf.</li>
	<li>Giet 25 mL van de gesteriliseerde met autoclaaf medium in een steriele petrischaal (90 × 20 mm).</li>
	<li>8-mm overslagfaciliteiten segmenten van ipecac plantjes met een chirurgische scalpel met een mes nr. 22 op een steriele acryl plaat knippen, en plaats op het medium (Figuur 1).</li>
	<li>Cultuur op phytohormone-gratis B5 medium bij 24 ° C onder de 15 µmol m−2 s−1 van licht in een donkere cyclus van 14-h licht/10-h voor 5 weken.</li>
	<li>Identificeren van de regio's ik (apicaal) tot en met IV (basale) in elk segment (Figuur 1B). Het aantal onvoorziene scheuten > 0.3 mm lengte in elke regio onder een Microscoop eenmaal per week.</li>
</ol>2. extractie en zuivering van fytohormonen
<ol><li>Een 5-mm Zirkonia parel in elk van de vier 2-mL monster buisjes plaatsen</li>
	<li>De segmenten in regio's gesneden I tot en met IV (elk 2 mm in lengte) met behulp van een chirurgische scalpel op een steriele acryl plaat.</li>
	<li>Verzamelen van acht segmenten van elke regio in aparte monster buizen (10-30 mg vers gewicht).</li>
	<li>Weeg, en vervolgens het bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof.</li>
	<li>Crush de bevroren monsters met behulp van een kraal gebaseerde homogenizer.</li>
	<li>Opschorten van de geplette monsters in 1 mL acetonitril met 500 pg van elke interne standaard van auxine en CKs (d5-IAA d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) met behulp van een vortex-mixer.</li>
	<li>Houd bij 4 ° C gedurende 1 h, dan Centrifugeer bij 3.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het wassen van de pellet in 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur. Centrifugeer nogmaals op 3.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Combineer het supernatant (uit stap 2.7 en 2.8) in een wegwerp glazen buis.</li>
	<li>Toevoegen van 600 µL water met 1% (v/v) azijnzuur aan elke gecombineerde supernatant en verdampen van de met behulp van een vacuüm concentrator acetonitril.</li>
	<li>Equilibreer hydrofiele lipofiele-evenwichtige (HLB) kolom patronen door het toepassen van elk 1 mL acetonitril, methanol en water met 1% (v/v) azijnzuur.</li>
	<li>Toepassing één monsteroplossing per geëquilibreerd HLB cartridge.</li>
	<li>Het wassen van de cartridges met 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.</li>
	<li>Elueer alle hormonen met 2 mL 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur in een glazen buis.</li>
	<li>Verdampen de acetonitril in het eluaat extract in water met 1% (v/v) azijnzuur met behulp van een vacuüm concentrator verkrijgen. Let op: Dit niet volledig drogen.</li>
	<li>Gemengde modus, sterke catie-uitwisseling (MCX) kolom cartridges equilibreer door het toepassen van 1 mL acetonitril, 1 mL methanol, 0,5 mL 0,1 M HCl en 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.</li>
	<li>Toepassing één monsteroplossing per geëquilibreerd MCX cartridge.</li>
	<li>Het wassen van de cartridges met 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.</li>
	<li>IAA Elueer met 2 mL 30% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur in een glazen buis.</li>
	<li>Het wassen van de cartridges met 2 mL 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur.</li>
	<li>Wassen van de cartridges met 2 mL en 1 mL water met 5% waterige ammoniak.</li>
	<li>Elueer de CKs met 2 mL 60% (v/v) acetonitril met 5% waterige ammoniak in een glazen buis.</li>
	<li>Damp het oplosmiddel van elk hormoon breuk met behulp van een vacuüm concentrator en bewaren op −30 ° C tot de LC-MS/MS-analyse.</li>
</ol>3. LC-MS/MS analyse van IAA en CKs
<ol><li>Los van elk hormoon uittreksel in een buis met 600 µL van methanol en breng de oplossing over in een schroef flacon voor de volledige terugvordering van de nek. Damp het oplosmiddel met behulp van een vacuüm concentrator.</li>
	<li>Los de IAA breuk in 20 µL 30% (v/v) acetonitril, en de CK breuken in 20 µL water met 1% (v/v) azijnzuur in schroef nek volledige terugvordering flesjes.</li>
	<li>Analyseer de monsters in positieve ion-modus op een triple-vierpolige MS systeem uitgerust met een systeem van HPLC. Opmerking: We stellen de HPLC-voorwaarden zoals vermeld in tabel 1.<ol>
<li>Voor de IAA elutie, gebruiken een binaire verloop van 5% - 50% oplosmiddel B meer dan 7 min, dan verhogen door 98% oplosmiddel B en houd voor 1 min en vervolgens equilibreer gedurende 2 min op 5% oplosmiddel B door nest injectie.</li>
		<li>Voor de CK elutie, gebruiken een binaire helling van 2% - 40% oplosmiddel B meer dan 5 min, 40% - 70% oplosmiddel B in 7 min, dan verhogen door 95% oplosmiddel B Houd voor 1 min en vervolgens equilibreer gedurende 2 min op 2% oplosmiddel B door injectie nesten.</li>
		<li>Instellen van de electrospray ionisatie (ESI)-MS parameters van ion bron zoals vermeld in tabel 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik de meerdere reactie controle (MRM) overgang voor kwantificering van elke analyt vermeld in tabel 3.</li>
	<li>Endogene IAA en CK niveaus tegen een standaard curve van de verhouding van labelloze deuterium-geëtiketteerden normen te kwantificeren.</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
<li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Cultivation-Utilization-Medicinal-Plants-Kapur/dp/B001I6AQI6">Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research</a>. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).</li>
<li>Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/0167-7799(94)90092-2">Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).</li>
<li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24241769">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li>
<li>Yoshimatsu, K., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+shoot+formation+on+internodal+segments+and+alkaloid+formation+in+the+regenerates+of+Cephaelis+ipecacuanha+A.+Richard%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard.</a> Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).</li>
<li>Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9684-8">Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac.</a> J. Plant Growth Regul. , (2017).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
<li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423896008746">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li>
<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen conflicten van interesse hebben.

Ter identificatie van de verdeling van fytohormonen betrokken is in de organogenese, het is belangrijk om het gebruik van plantaardig materiaal waarin organogenese kan worden waargenomen op de drager van de phytohormone-vrij, omdat wanneer fytohormonen exogenously worden toegepast op explantaten voor inducerende scheuten of wortels, beïnvloeden ze de hele explant, waardoor het moeilijk is om te evalueren van de inherente plasticiteit van planten in de celdifferentiatie en organogenese. Onvoorziene scheuten kunnen worden ...

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) voorgesteld het concept van "totipotent", door welke plant kunnen cellen verdelen, differentiëren en regenereren van hele planten zelfs na hun voorafgaande differentiatie in specifieke celtypes in volwassen planten1. In de weefselkweek, wordt of plant regeneratie kan worden opgewekt, of niet bepaald door de combinatie en de concentratie van exogenously toegepaste fytohormonen in het groeimedium. Skoog en Miller gevonden dat onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt uit tabak eelt op kweekmedium dat een hoge verhouding van CKs tot auxines, overwegende dat de bijwortels kon worden geïnduceerd op medium met een lage verhouding2. Sinds dat zoeken, is weefselkweek wijd verbeid gebruikt voor de verspreiding van economisch belangrijke gewassen en voor de regeneratie van transgene planten3. Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt uit weefsels dan schieten apicale meristeem, zoals bladeren, wortels en groeispurt. Phytohormone behandeling is vereist voor de inductie van onvoorziene scheuten in meeste plantensoorten. Echter, de optimale concentratie en de combinaties verschillen per soort en onder weefsels als explantaten gebruikt. Dus, veel moeite gaat in het bepalen van de optimale concentraties en combinaties van fytohormonen voor experimenten.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Braakwortel) is een medicinale plant die alkaloïden zoals emetine en Phosphatidylethanolamine, vooral in de wortels4 bevat. Root extracten worden gebruikt als een braakmiddel, een slijmoplossend en een amoebicide5. Hoewel Braakwortel natuurlijk in de tropische regenwouden van Brazilië groeit, het is terughoudend om zaden in cultuur, en de kiemkracht tarief vermindert tijdens de opslag van het zaad in Japan, met haar kouder klimaat6. In plaats daarvan, het is vermeerderd door weefselkweek, in die onvoorziene schieten formatie op de groeispurt is de meest efficiënte methode7,8. Interessant, kunnen onvoorziene scheuten worden opgewekt in deze soort zonder phytohormone behandeling8.
Onvoorziene scheuten worden gevormd op de epidermis in de apicale regio van overslagfaciliteiten segmenten zonder callusing, maar niet in de basale regio9. Dit verschil geeft aan weefsel polariteit in overslagfaciliteiten segmenten, die waarschijnlijk is onder phytohormonal verordening. De Braakwortel cultuur systeem maakt het mogelijk een unieke gelegenheid om veranderingen in de endogene phytohormone analyseren tijdens onvoorziene schieten vorming. Hier introduceren wij onze werkwijze voor de analyse van de endogene niveaus van één auxine (indool-3-azijnzuur (IAA)) en vier CKs (isopentenyl adenine (iP), isopentenyl adenine riboside (iPR), trans-Zeatine (tZ), en trans-Zeatine riboside (tZR)) in overslagfaciliteiten segmenten met behulp van LC-MS/MS.

<table><tbody><tr><td>[2H5]indole-3-azijnzuur</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>Interne standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H5]trans-zeatine</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>Interne standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H5]trans-zeatine riboside</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>Interne standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-isopentenyl adenine</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td><td>Interne standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-isopentenyl adenosine</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0171</td><td>Interne standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>indole-3-azijnzuur</td><td>Wako</td><td>098 00181</td><td>standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>trans-zeatine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 5MG</td><td>standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>trans-zeatine riboside</td><td>Wako</td><td>262 01081</td><td>standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenyl adenine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674 1G</td><td>standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenyl adenosine</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td><td>standaard voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>acetonitril hypergrade voor LC-MS LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td><td>oplosmiddel voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Water voor chromatografie LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>oplosmiddel voor LC-MS/MS</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>SHIMADZU</td><td>Prominence</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 30 mg/1 cc</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>cartridgekolom</td></tr><tr><td>Oasis MCX 30 mg/1 cc</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td>cartridgekolom</td></tr><tr><td>schroefhals totaal herstelvial</td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>blauw, 12 x 32mm schroefhalsdop en PTFE/siliconen septum</td><td>Waters</td><td>186000274</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm</td><td>Waters</td><td>186002350</td><td>UPLC kolom</td></tr><tr><td>Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>UPLC kolom</td></tr><tr><td>Digitaal microscoop</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch mes</td><td>Feather</td><td>No. 22</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelhandgreep</td><td>Feather</td><td>No. 4</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac/Refregerated dampval</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD111/RVT4104</td><td>vacuüm concentrator</td></tr><tr><td>wegwerp glazen buis (13x100 mm)</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>Steriele petrischaal</td><td>INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van endogene auxine en cytokinine tijdens stengellid cultuur van ipecac

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

Onvoorziene schieten formatie is een belangrijke techniek voor de verspreiding van economisch belangrijke gewassen en voor de regeneratie van transgene planten. Phytohormone behandeling is vereist voor de inductie van onvoorziene scheuten in de meeste soorten. Of onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt wordt bepaald door het evenwicht tussen auxine en cytokinine (CK) niveaus. Veel moeite gaat in het bepalen van de optimale concentraties en combinaties van fytohormonen in elk weefsel gebruikt als explantaten en bij elke plantensoorten. In Braakwortel, kunnen echter onvoorziene scheuten worden opgewekt op overslagfaciliteiten segmenten in een kweekvloeistof zonder phytohormone behandeling. Hierdoor is de inherente plasticiteit van ipecac voor celdifferentiatie worden geëvalueerd. Om onvoorziene scheuten in Braakwortel, gekweekt we overslagfaciliteiten segmenten bij 24 ° C onder de 15 µmol m−2 s−1 van licht in een donkere cyclus van 14-h licht/10-h op phytohormone-gratis B5 medium voor 5 weken met 0,2% gellan tandvlees verhard. Om te onderzoeken phytohormone dynamiek tijdens onvoorziene schieten vorming, we gemeten endogene indool-3-azijnzuur en CKs in de segmenten door vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie LC-MS/MS. Met deze methode kunt analyse van endogene indool-3-azijnzuur en CKs niveaus op een eenvoudige manier. Het kan worden toegepast om te onderzoeken van de dynamiek van endogene auxine en CK tijdens organogenese bij andere plantensoorten.

Op de 1st -week, had geen onvoorziene scheuten gevormd. Tijdens de week van 2nd verscheen de kleine scheuten. Op de 3rd en 4th weken, schiet vooral in de apicale regio's (I en II) het aantal toegenomen(Figuur 2). Op de 5th -week, het aantal van scheuten was ongeveer 7 in regio ik en 5 regio II (Figuur 2B). In tegenstelling, werden alleen een ...

Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt op overslagfaciliteiten segmenten van ipecac zonder phytohormone behandeling. Om te beoordelen phytohormone dynamiek tijdens onvoorziene schieten vorming, we gemeten endogene auxine en cytokinine in overslagfaciliteiten segmenten door LC-MS/MS.

Kwantificering van endogene auxine en cytokinine tijdens stengellid cultuur van Ipecac

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

Het algemene doel van deze procedure is om te beschrijven hoe endogene fytohormoonniveaus veranderen tijdens adventieve scheutvorming in ipecac. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen met betrekking tot weefselregeneratie in de plantweefselkweekwiel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het endogene niveau van Indole-3-azijnzuur en cytokinines eenvoudig kan worden geanalyseerd met hoge gevoeligheid.De implicatie van deze techniek strekt zich uit over de hele opbouw van plantweefseldegeneratie omdat veranderingen in het endogene fytohormoonniveau adventieve scheutvorming veroorzaken. Om te beginnen, bereid een fytohormoonvrij B5-medium voor en voeg 0,2 procent gellan gom toe. Steriliseer vervolgens het medium door het te autoclaveren.Gebruik een chirurgisch scalpel op een steriele acrylplaat om acht millimeter internodale segmenten van ipecac-plantjes te snijden en plaats ze op het medium. Cultiveer vervolgens de ipecac-segmenten bij 24 graden Celsius onder 15 micromol per vierkante meter seconden licht in een cyclus van 14 uur licht, 10 uur donker gedurende vijf weken. Na het kweken van de ipecac-segmenten, identificeer gebieden één tot en met

quantification-endogenous-auxin-cytokinin-during-internode-culture

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

This video demonstrates the seedling growth inhibition assay in the Arabidopsis thaliana plant. The impact of increased concentration of immune peptide elicitor on seedling growth is determined.

Measuring Immune-Induced Inhibition of Seedling Growth

Het Lateral Root Inducible System (LRIS) maakt gelijktijdige inductie van laterale wortels mogelijk en wordt gepresenteerd voor Arabidopsis thaliana en maïs.

Laterale Root Induceerbare System in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; En maïs

Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl   van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.

Een strategie om de rol van callose gemedieerde Plasmodesmal Poortsignalen in de Tropic Response valideren

De hier beschreven protocollen vergemakkelijken de gemakkelijke onderzoeking van bacteriële ethyleenreacties door gebruik te maken van 2-chloorethylfosfonzuur (CEPA).  Ethyleen wordt in situ geproduceerd door de ontbinding van CEPA in een aqueus bacteriegroeimedium, waardoor de vereiste voor zuiver ethyleengas wordt omzeild.

Gebruik makend van de Ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-Chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in Bacteria Studie

Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Het protocol hierin beschreven is een methode voor het meten van endoreduplicatie binnen knollen van de aardappel (Solanum tuberosum). Het omvat Plasmolyse en protoplast extractie stappen om te verminderen van het lawaai en puin in downstream flow cytometrische analyse.

Meten van endoreduplicatie door Stroom Cytometry van geïsoleerde Knol protoplasten

Gibberelline perceptie Sensor 1 (GPS1) is de eerste Förster resonance energie overdracht gebaseerde biosensor voor het meten van de cellulaire niveaus van Gibberelline fytohormonen met een hoge Spatio resolutie. Dit protocol rapporteert over de methode om te visualiseren en te kwantificeren van cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de genetisch gecodeerde nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls en wortel tips.

Visualiseren cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Hier beschrijven we sterke anion uitwisseling high-performance vloeibare chromatografie van [3H]-myo-inositol-gelabelde zaailingen die een zeer gevoelige methode is om inositol polyfosfaten in planten te detecteren en te kwantificeren.

Extractie en kwantificering van oplosbare, radiogelabelde Inositol Polyfosfaten van verschillende plantensoorten met SAX-HPLC

Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Leer hoe endogene auxine en cytokinine te kwantificeren tijdens stengellid cultuur van Ipecac met LC-MS/MS. Deze methode analyseert fytohormoonniveaus met hoge gevoeligheid voor weefselregeneratie.

Kwantificering van endogene auxine en cytokinine tijdens stengellid cultuur van Ipecac

Meer video's verkennen