Kwantificering van endogene auxine en cytokinine tijdens stengellid cultuur van Ipecac

Het algemene doel van deze procedure is om te beschrijven hoe endogene fytohormoonniveaus veranderen tijdens adventieve scheutvorming in ipecac. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen met betrekking tot weefselregeneratie in de plantweefselkweekwiel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het endogene niveau van Indole-3-azijnzuur en cytokinines eenvoudig kan worden geanalyseerd met hoge gevoeligheid.

De implicatie van deze techniek strekt zich uit over de hele opbouw van plantweefseldegeneratie omdat veranderingen in het endogene fytohormoonniveau adventieve scheutvorming veroorzaken. Om te beginnen, bereid een fytohormoonvrij B5-medium voor en voeg 0,2 procent gellan gom toe. Steriliseer vervolgens het medium door het te autoclaveren.

Gebruik een chirurgisch scalpel op een steriele acrylplaat om acht millimeter internodale segmenten van ipecac-plantjes te snijden en plaats ze op het medium. Cultiveer vervolgens de ipecac-segmenten bij 24 graden Celsius onder 15 micromol per vierkante meter seconden licht in een cyclus van 14 uur licht, 10 uur donker gedurende vijf weken. Na het kweken van de ipecac-segmenten, identificeer gebieden één tot en met vier in elk segment.

Gebruik eenmaal per week een microscoop om het aantal adventieve scheuten in elk gebied te tellen. Plaats eerst een vijf millimeter zirkoniakraal in vier monstersbuisjes van twee milliliter. Snijd vervolgens de ipecac-segmenten met een chirurgisch scalpel op een steriele acrylplaat in gebieden I tot en met IV. Verzamel vervolgens acht segmenten uit elk gebied in één monstersbuisje.

Weeg elk van de monsters en bevries ze in vloeibare stikstof. Gebruik vervolgens een kralenhomogenisator om de bevroren monsters te pletten. Gebruik een vortexmixer om de monsters op te schorsen in één milliliter acetonitril met 500 picogram van elk intern standaard van oxen en CK's.

Home de monsters gedurende één uur bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende vijf minuten bij 3500 G bij kamertemperatuur. Was de pellet in 80 procent acetal nitril met één procent azijnzuur.

Herhaal vervolgens de centrifugatie en gebruik een wegwerpklassebuis om de supernatanten te combineren. Voeg 600 microliters water met één procent azijnzuur toe aan de gecombineerde supernatant. Gebruik vervolgens een vacuümconcentrator om het acetal nitril te verdampen.

Laad de monsteroplossingen in individuele geëquilibreerde HLB-cartridges. Was de cartridges met één milliliter water met één procent azijnzuur. Eludeer vervolgens alle hormonen met twee milliliter van 80 procent acetyl nitril met één procent azijnzuur in een glasbuis.

Gebruik een vacuümconcentrator om het acetal nitril te verdampen om extract in water met één procent azijnzuur te verkrijgen. Laad de monsteroplossingen in individuele geëquilibreerde MCX-cartridges en was de cartridges met één milliliter water met één procent azijnzuur. Eludeer vervolgens IAA in een glasbuis met twee milliliter 30 procent acetal nitril met één procent azijnzuur.

Was vervolgens de cartridges met twee milliliter 80 procent acetal nitril met één procent azijnzuur. Was vervolgens de cartridges met twee milliliter water en één milliliter water met vijf procent waterige ammoniak in een tochtkamer. Eludeer de CK's in een glasbuis met twee milliliter 60 procent acetal nitril met vijf procent waterige ammoniak in een tochtkamer.

Gebruik vervolgens een vacuümconcentrator om het oplosmiddel van elk hormoonfractie te verdampen. Roer de monsters bij min dertig graden Celsius tot LCMSMS-analyse. Los eerst elk hormoonextract op in een buisje met 600 microliters methanol.

Breng vervolgens de oplossing over in een schroefhalsbuisje en gebruik een vacuümconcentrator om het oplosmiddel te verdampen. Los de IAA-fractie op in 20 microliters 30 procent acetal nitril en de CK-fracties in 20 microliters water met één procent azijnzuur. Gebruik vervolgens een triple quadrupool MS-systeem uitgerust met een HPLC-systeem om de monsters in positieve ionmodus te analyseren.

Kwantificeer ten slotte endogene IAA in CK-niveaus tegen een standaardcurve van de verhouding van ongelabelde tot deuteriumlabelstandaarden. In dit protocol werd endogene oxidant cytokinine in adventieve schotten gedurende vijf weken gemeten via LCMSMS. In de eerste week waren er nog geen adventieve schotten gevormd en de eerste kleine schotten verschenen tijdens de tweede week.

Tijdens de derde en vierde week nam het aantal schotten toe, vooral in regents één en twee. Tijdens de vijfde week was het aantal schotten ongeveer zeven in regio één en vijf in regio twee. Vóór de cultuur was het IAA-niveau iets hoger in regio één dan in regio's twee, drie en vier.

Tijdens de eerste week nam het IAA-niveau sterk toe in regio vier en nam lichtjes af in regio's één, twee en drie. Na vijf weken cultuur ontstond er een IAA-concentratiegradiënt. Met niveaus die toenamen van regio één naar regio vier.

Voor de cultuur waren er slechts spoorniveaus van de meeste CK's. In de eerste week nam het tZR-niveau toe tot 13,8 picogram per milligram in regio twee. En 18,1 picogram per milligram in regio drie.

In tegenstelling daarmee veranderden de niveaus van tZ, iP en iPR slechts licht tijdens de cultuur. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat endogene deelhormoon stabiel is. Nadat het is ontwikkeld, baant deze techniek de weg voor onderzoekers op het gebied van plantweefselkweek.

Om adventieve vorming bij andere organismen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u endogene Indole-3-azijnzuur en cytokinines kunt analyseren.