Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans
7 februari 2018
Dit protocol beschrijft het gebruik van genetisch gecodeerde Ca2 + verslaggevers om recordwijzigingen in neurale activiteit in gedragen Caenorhabditis elegans wormen.
Het algemene doel van deze procedure is om Ratiometrische Calcium Imaging uit te voeren van de effecten van hermafrodiet specifiek neuron, of HSN activiteit, op het gedrag van Caenorhabditis elegans. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de Gedragsneurowetenschappen te beantwoorden over hoe neurocircuitactiviteit veranderingen in diergedrag produceert terwijl dieren wisselen tussen gedragstoestanden. Deze techniek maakt het mogelijk om veranderingen in intracellulaire calciumactiviteit te registreren met een hoog signaal-ruisverhouding, terwijl tegelijkertijd het gedrag en de locomotie van het dier worden gevolgd.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in neuronale activiteit in C.elegans, kan deze ook worden toegepast op andere transparante modelsystemen, waaronder Drosophila-larven en Zebravis. Het demonstreren van de procedure met mij, zullen Collin's Labs-studenten zijn: Richard Kopcock, Pravat Dhakal en Layla Nassar. Om de dieren te monteren, brengt u eerst OP50 bacterieel voedsel van een geïncubeerde nematode groeimedium agarplaat aan op de bodem van een platina worm pick en gebruikt u de pick om ongeveer 20 late L vier L-X 2, 000 voor dieren die de gevoelige calcium reporter GCaMP5 en mCherry in HSN van de N-L drie P promotor tot expressie brengen, over te brengen naar een geïncubeerde nematode groeimedium plaat.
Bevestig de aanwezigheid van de zich ontwikkelende vulva onder een stereomicroscoop als een duidelijke donkere vlek omgeven door een witte halve maan en incubeer de wormen gedurende 24-40 uur bij 20 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, brengt u OP50 aan op een nieuwe pick en brengt u drie wormen over naar een ongeïncubeerde nematode groeimedium plaat en laat u een klein deel voedsel op de nieuwe plaat achter voor de wormen om tijdens de beeldvorming op te eten. Vervolgens gebruikt u een platte afgeronde spatel om een 20 bij 20 millimeter groot stuk van de ongeïncubeerde plaat te snijden en plaatst u het stuk, wormzijde naar beneden, op één rand van een schone 24 bij 60 millimeter nummer 1,5 dekglas.
Schuif vervolgens voorzichtig het agarstuk in het midden van het dekglas en plaats een 22 bij 22 millimeter nummer één dekglas bovenop het agarstuk om plakken en verdamping te verminderen. Om de beeldvormer in te stellen, plaatst u de wormen op de tafel van een omgekeerde microscoop en selecteert u de 20x subjectief. Gebruik de binoculair oogstukken om een worm voor beeldvorming te selecteren en schuift u de infraroodfilter en plaatst u deze boven de condensator.
Open een geschikt videoanalyseprogramma en voer het seriële stage XY-stadium eindcommunicatie script uit. Klik op CsvWriter en selecteer een map voor het opslaan van de geregistreerde X en Y-stadiuminformatie. Klik vervolgens op de groene pijl om het digitale acquisitieapparaat te initialiseren.
In de infrarood camera opnamesoftware onder instellingen, selecteert u Toggle Camera Control Dialog. Selecteer vervolgens het menu Custom Video Modes en selecteer Modus 1 en Pixel Format Raw acht. Onder Trigger Stroke, stelt u de Trigger Input Line in op drie, de Polariteit op hoog en de Modus op 14.
Schakel Enable in om de frameacquisitie te stoppen totdat het voltagetriggersignaal van de fluorescentiecamera is ontvangen. Met het geopende beeldweergavevenster, klikt u op Record en selecteert u de map voor het opslaan van de beeldsequenties. Selecteer Buffered Recording Mode en sla de beelden op in JPEG-formaat.
Klik vervolgens op Start Recording om de acquisitie te initialiseren. Open vervolgens het Capture-tabblad in de Fluorescentie Acquisitie Software en stel de belichtingstijd in op 10 milliseconden, de Binning op vier X en de Image Depth op 16 bit. Selecteer een gecentreerde camera Sub-Array van 512 pixels breed door 256 pixels hoog.
Het programma zal het brede beeld automatisch in het midden delen om de afzonderlijke fluorescentiekanalen te genereren. Klik op Show Output Trigger Options en stel alle triggers in op positief. Bevestig dat trigger een en trigger twee zijn ingesteld op Exposure en trigger drie is ingesteld op Programmable met een periode van 25 milliseconden.
Selecteer vervolgens onder het sequence-tabblad Time Lapse onder Scan Instellingen, stel Field Delay een in op 50 milliseconden om beelden te verzamelen bij 20 hertz. Selecteer save naar Temporary Buffer. Voor Ratiometrische Calcium Imaging, klikt u onder het Sequence-tabblad op Start om met opnemen te beginnen en volgt u de worm met de joystick waarbij de cellen en synapsen van belang in focus in het midden van het gezichtsveld worden gehouden.
Op het moment dat de fluorescentieopname wordt gestart, worden triggers verzonden naar de wachtende bright field camera en de stagecontroller die beginnen met het verzamelen van gesynchroniseerde beelden en stagepositie. Klik op de Stats-knop in het Histogram-venster om pixelstatistieken voor elk kanaal weer te geven. Pas de LED-vermogen aan om een maximum van één enkele pixel van mCherry fluorescentie bij het presynaptische terminaal van minimaal 8.000 tellen in het rode kanaal te garanderen, wat ongeveer 12 bit dynamisch bereik boven de achtergrond geeft.
De Calcium Reporter Signalen bij het presynaptische terminaal tijdens rust of laag calcium zouden rond de 2.500 tellen in het groene kanaal moeten zijn. Neem het gedrag op totdat een actieve eierleggende toestand wordt bereikt. Sla vervolgens een subset van 10 minuten op die 6.000 frames voor en 6.001 frames na het eerste eierleggende evenement bevat.
Zorg ervoor dat u dezelfde subset van bright field beelden van wormgedrag en tijdstippen van de X-Y stage positie behoudt of de precieze synchronisatie van datastromen zal verloren gaan. Voor Beeldsegmentatie, importeert u de beeldsequenties in een geschikt Ratiometrisch Kwantisatie Software Programma en klikt u met de rechtermuisknop op de tijdreeks in het sequence-tabblad om de tijdreeks in te stellen op 20 frames per seconde en 1,25 micrometer per pixel. Selecteer onder het Tools-menu Ratio en selecteer vervolgens mCherry voor Kanaal A en GCaMP5 voor Kanaal B en klik op Calculate om de achtergrond van elke beeldsequentie af te trekken.
Selecteer Apply a rainbow look up table to the ratio channel en gebruik de mCherry-kanaal om een intensiteitsgemoduleerde ratiokanaal te genereren om de kleur van de ratio op de helderheid van het mCherry-kanaal te mappen. Klik op Ratio om
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol waarin genetisch gecodeerde Ca2+-reporters worden gebruikt voor ratiometrische calcium-imaging om de neurale activiteit in jagende Caenorhabditis elegans-wormen te beoordelen. Deze methode onderzoekt hoe de activiteit van hermaphrodiete specifieke neuronen (HSN) het gedrag van wormen beïnvloedt, waarmee fundamentele vragen in de gedragsneurowetenschappen worden behandeld.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Gedragsneurowetenschap
- Neuro-imaging
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Calciumimaging is een cruciale methode voor het bestuderen van neuronale activiteit.
- Caenorhabditis elegans dient als model voor het begrijpen van neurale circuits.
- Dit protocol richt zich op de HSN-neuronen die bijdragen aan gedragsmodulatie.
- Het begrijpen van de relatie tussen neurale activiteit en gedrag is essentieel voor inzichten in de neurowetenschappen.
Doel van de studie
- Om de effecten van HSN-neuronactiviteit op het gedrag van C. elegans te verduidelijken.
- Om inzicht te bieden in de dynamiek van neurale circuits en gedragsovergangen.
- Om het gebruik van calciumreporters te valideren bij het vastleggen van neurale responsen tijdens verschillende gedragsstaten.
Gebruikte methoden
- Ratiometrische calcium-imaging met gebruik van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GCaMP5 en mCherry).
- Gedragsobservaties bij C. elegans om neurale activiteit te correleren met eiafscheidingstoestanden.
- Toepassing van imagingtechnieken met aangepaste software voor gegevensacquisitie en -analyse.
- De stappen omvatten de preparatie van wormen, incubatie, de imaging-opstelling en gegevensregistratie.
Belangrijkste resultaten
- De studie demonstreert succesvol de correlatie tussen HSN-activiteit en gedragsveranderingen in C. elegans.
- De geregistreerde calciumsignalen boden duidelijke inzichten in de neurale dynamiek tijdens actieve gedragingen.
- Het protocol beschrijft effectieve methoden voor het synchroniseren van imaging en gedragsgegevens.
- De bruikbaarheid van genetisch gecodeerde reporters voor het bestuderen van neuronale functies is gevalideerd.
Conclusies
- Deze studie maakt een beter begrip mogelijk van hoe specifieke neurale circuits het gedrag bij C. elegans beïnvloeden.
- De toepassing van calcium-imagingtechnieken kan worden uitgebreid naar andere modelorganismen.
- Inzichten uit dit onderzoek dragen bij aan een breder begrip van neuronale mechanismen en gedragsplasticiteit.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Ratiometrische calcium-imaging in actieve C. elegans maakt een directe correlatie mogelijk tussen de activiteit van individuele neuronen en gedragsmatige toestanden, wat een schaalbaar platform biedt voor target-validatie bij de ontdekking van neurotherapeutica. Door het kwantificeren van HSN-gestuurde calciumtransiënten die voorafgaan aan eiafzettingen, ondersteunt deze methode het mechanische de-risking van modulatoren van de serotonerge route. Deze benadering vergroot het voorspellende vertrouwen bij vroege screening door moleculaire targets te koppelen aan kwantificeerbare gedragsmatige uitkomsten in een genetisch hanteerbaar systeem.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar serotonerge signalering in de HSN als therapeutisch doelwit voor gedragsmodulerende verbindingen.
- Operationele waarde: Biedt ratiometrische uitlezingen die bewegingsartefacten corrigeren, waardoor de betrouwbaarheid van gegevens in vrij bewegende preparaten wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Koppelt presynaptische calciumdynamiek aan gedragstransities, wat hypothesetesten van neuroactieve verbindingen ondersteunt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Stelt een fluorescentieverhouding (GCaMP5:mCherry) vast als een kwantitatieve proxy voor intracellulaire calciumflux in gedefinieerde neuronen.
- Operationele waarde: Ondersteunt imaging met hoge resolutie bij 20 Hz met gesynchroniseerde gedragsregistratie, wat reproduceerbare assay-formaten mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met gemotoriseerde tafels en infrarood brightfield-systemen voor longitudinale monitoring van gedragsstaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Faciliteert continuïteit van neurale activiteitsmetingen naar gedragsfenotypes in een ziekterelevant systeem.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt observatie van HSN calcium-transiënten ~4 seconden vóór ei-afzetting mogelijk, wat helpt bij de temporele targeting van interventies.
- Verduidelijking van het signaalpad: Correleert HSN-activiteit met samentrekking van de vulva-spieren en veranderingen in locomotie, waardoor de effecten van serotonerge modulatie op circuitniveau worden verduidelijkt.
Pipeline- & Workflowintegratie
De methode integreert in vroege discovery-workflows door real-time, neuron-specifieke calcium-readouts te bieden die leiden tot lead-identificatie en preklinische prioritering via gedragsmatige correlatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt mechanistisch onderzoek naar HSN-gestuurde serotonerge signalering bij het moduleren van het ei-leggingsgedrag.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gesynchroniseerde fluorescentie- en gedragsdatastromen met een temporele resolutie van 20 Hz.
- Analytica: Genereert ratiometrische fluorescentiekanalen en metrics voor object-tracking voor kwantitatieve vergelijking van neurale activiteit over verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt HSN-calciumdynamiek met ei-leggingsgedrag, wat de afstemming van biomarkers bij preklinische validatie ondersteunt.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform voor longitudinale neuro-gedragsstudies in genetisch gecodeerde reporterlijnen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door HSN-calciumtransiënten te correleren aan specifieke gedragsgebeurtenissen.
- Operationele waarde: Standaardiseert ratiometrische beeldvorming om variabiliteit door focusdrift en beweging van het dier te minimaliseren.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door target-engagement te koppelen aan kwantificeerbare gedragsverschuivingen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk op basis van neurale-gedragsmatige concordantie in preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de genetische codering van GCaMP5 en mCherry in specifieke neuronale lijnen.
- Is afhankelijk van geïnverteerde microscopie met dual-channel fluorescentie en infrarood brightfield-mogelijkheden.
- Vereist synchronisatieprotocollen voor fluorescentieacquisitie, stage tracking en gedragsregistratie.
- Omvat postprocessingstappen voor ratiometrische kwantificering en objectdetectie met behulp van intensiteitsdrempels.
- Beperkt tot transparante modelsystemen en neuronen die toegankelijk zijn voor optische sectieering.
