Name: Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer een gestroomlijnde immunoprecipitatiemethode om meerdere endogene posttranslationele modificaties van doeleiwitten te detecteren met A431-cellen. Dit systeem maakt PTM-onderzoek toegankelijk voor niet-experts.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken cytoskelet Inc. onderzoekswetenschappers en Drs. Brian Hoover en Ashley Davis voor hun kritische recensie, bewerken en vruchtbare discussies over het manuscript. Bovendien, danken wij Dr. Robert Hom voor zijn bijdrage tijdens de productie van de video manuscript. Dit werk werd gesteund door financiële middelen van het cytoskelet Inc.

1. de monstervoorbereiding: De cultuur van de cel
<ol><li>Vier 150 mm platen van A431 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum groeien.<ol>
<li>De A431 cellen groeien tot 50% confluentie.</li>
		<li>Serum beperken de vier platen van A431 cellen met serumvrij DMEM gedurende 24 uur.</li>
		<li>Behandelen twee platen van A431 cellen met 33,3 mg/mL epidermale groeifactor voor 1 h. laten de andere twee platen onbehandeld. Opmerking: Cel groei en behandeling voorwaarden hieronder geven een voorbeeld; Deze methode is echter toepassing op veel verschillende soorten cellen en behandeling voorwaarden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiden blastR lysis en verdunning buffers met remmers (tabel 1). Combineer 2.895 mL lysisbuffermengsel blastR met 15 µL van tyrosine fosfatase-remmer, 30 µL van deubiquitinase en deSUMOylase-remmer, 30 µL van histone deacetylase (HDAC) remmer en 30 µL van proteaseinhibitor cocktail.<ol>
<li>Combineer 9.65 mL van blastR verdunning buffer met 50 µL van tyrosine fosfatase-remmer, 100 µL van deubiquitinase en deSUMOylase-remmer, 100 µL van histone deacetylase (HDAC) remmer en 100 µL van de proteaseinhibitor cocktail. Opmerking: Zie Tabel van materialen voor informatie over de samenstelling en Inhibitor van de omwenteling van de buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giet af de voedingsbodems en plaats de cellen op het ijs. Vervolgens wassen de cellen tweemaal met 10 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).<ol>
<li>Verwijder zo veel PBS mogelijk voorafgaand aan toe te voegen blastR lysis-buffermengsel maximaliseren van lysis van de cel. Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 600 µL van blastR lysis buffer voor elke 150 mm plaat. Het bedrag van de buffer is gebaseerd op verwachte eiwit opbrengst (tabel 2).<ol>
<li>Lyse de cellen met behulp van een cel schraper. De lysate zal worden als gevolg van lysis van de nucleaire viskeuze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een fijngesneden 1 mL pipet tip de ruwe lysate overbrengen naar een blastR-filter dat is geplaatst in een collectie-tube van 15 mL (Figuur 1). Hier, wordt een tube van 15 mL falcon gebruikt.</li>
	<li>Gebruik een meegeleverde filter plunjer volledig comprimeren het filter blastR en verzamelen de lysate doorstroom, met inbegrip van alle bubbels, in een tube van 15 mL (Figuur 1).</li>
	<li>Optioneel: Overdracht verduidelijkt lysate een tube van 1,5 mL microcentrifuge en een centrifuge de lysate op ongeveer 10.000 x g voor 1 min bij 4 ° C.<ol>
<li>Het supernatant overbrengen in een nieuwe falcon-tube van 15 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdun de geklaarde lysate met blastR verdunning buffer tot een eindvolume van 3 mL voor elke 150 mm plaat. Het eindvolume is gebaseerd op verwachte eiwit opbrengst (tabel 2). Opmerking: Deze stap is belangrijk aangezien de buffer van de definitieve samenstelling gevolgen voor de IP-reactie striktheid hebben zal.</li>
	<li>Kwantificeren eiwitconcentratie (sectie 2).</li>
</ol>2. eiwitten Quantitation Assay
Opmerking: Gebruik een standaard colorimetrische eiwit kwantificatie test om te bepalen eiwit kwantificatie. Hier, is kwantificatie van eiwit bepaald met behulp van precisie rode geavanceerde eiwit bepaling.
<ol><li>1 mL van precisie rode geavanceerde assay eiwitreagens aan elk van de twee 1 mL cuvettes toevoegen.</li>
	<li>Mix 10 µL van blastR lysis-buffermengsel en 40 µL van blastR verdunning buffer in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs. Opmerking: Dit zal worden gebruikt voor het lezen van de lege eiwitSteekproef.</li>
	<li>20 µL van het mengsel van de buffer lysis/verdunning (uit stap 2.2) aan de eerste cuvette en mix toevoegen door twee tot drie keer omkeren.</li>
	<li>Voeg 20 µL van de verdunde cel lysate (van experiment) naar de tweede cuvette, mengen zoals hierboven.</li>
	<li>Monsters voor 1 minuut bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Lege spectrofotometer met de lysis/verdunning buffer mix monster (uit stap 2.3).</li>
	<li>Meet de extinctie van de lysate monster (uit stap 2.4) op 600 nm.</li>
	<li>Bepaal de lysate eiwitconcentratie als volgt; monster lezen OD600 x 5 = eiwitconcentratie in mg/mL Opmerking: OD lezingen onder de 0,05 of boven 0,5 liggen dicht bij de capaciteit van de lineaire bereik van de bepaling van eiwit. Voor lezingen > 0,5, monsters kunnen worden verdund. Voor lezingen < 0,05, meer lysate kunnen worden toegevoegd aan de precisie rode geavanceerde assay eiwitreagens (maximaal 50 µL). Zie tabel 3 voor multiplicatoren spectrofotometer lezingen omzetten in mg/mL lysate eiwitconcentratie. Als er onvoldoende eiwit in één plaat, is het aanbevolen om het gebruik van 2 of meer platen per IP. In dit geval zal de platen in de serie, het overbrengen van de oorspronkelijke 300 µL van lysis buffer tussen platen worden geoogst.</li>
	<li>Op basis van eiwitconcentratie, Verdun monster met een mix van de buffer (1 deel lysis van de blastR: 4 delen blastR verdunning) naar een gewenste eindconcentratie (meestal 1 mg/mL).</li>
	<li>Module bevriezen aliquots van monsters die niet onmiddellijk zal worden gebruikt.<ol>
<li>Winkel monsters op 70 ° C.</li>
		<li>Gaat u verder met sectie 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Immunoprecipitation (IP) Assay
Opmerking: Affiniteit kraal concentraties, lysate concentraties en incubatie tijden worden aanbevolen richtsnoeren en uniek voor elke doelgroep eiwitten en specifieke PTM onderzocht kunnen worden.
<ol><li>Omkeren voorraad reagens buizen met Ub affiniteit kralen, pY affiniteit kralen, SUMO 2/3 affiniteit kralen en Ac affiniteit kralen meerdere malen om ervoor te zorgen dat de kralen zijn volledig geresuspendeerde in de buis.</li>
	<li>Voor elk IP-assay, aliquoot kraal schorsing in aparte 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs (IP-buis). Hier, 20 µL van ubiquitin affiniteit kralen, 30 µL van phosphotyrosine affiniteit kralen, 40 µL van SUMOylation 2/3 affiniteit kralen of 50 µL van acetylation affiniteit kralen toevoegen aan afzonderlijke 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs. Opmerking: Zie tabel 4 voor de aanbevolen hoeveelheid kraal schorsing te gebruiken voor elke kraal affiniteit.</li>
	<li>Omkeren voorraad reagens buizen met ubiquitination IP-controle kralen en kralen van IgG controle meerdere malen om ervoor te zorgen dat de kralen zijn volledig geresuspendeerde in de buis.</li>
	<li>Aliquot controle kralen per besturingselement reactie om niet-specifieke binding (controle IP-buis). Hier, 20 µL van Ub controle kralen, 30 µL van pY controle kralen, 40 µL van SUMO 2/3 controle kralen of 50 µL van Ac control kralen toevoegen aan afzonderlijke 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs. Opmerking: Zie tabel 4 voor de aanbevolen hoeveelheid kraal schorsing te gebruiken voor elk soort affiniteit kraal.</li>
	<li>Een kleine hoeveelheid lysate (20 µL) uit te voeren aan een westelijke vlek lysate controle-invoer opslaan. Voeg 5 µL van 5 x monster buffer en kook bij 95 ° C gedurende 5 min. Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.</li>
	<li>Voeg toe lysate naar elk IP-buis en controle IP-buis. 1 mg lysate werd hier gebruikt per IP en controle reactie, resulterend in een totaal van 8 IP-reacties. Opmerking: 1,0 mg lysate per assay wordt aanbevolen als uitgangspunt. De hoeveelheid lysate vereist zal variëren afhankelijk van de overvloed van gemodificeerde doel eiwit.</li>
	<li>Incubeer de buizen op een roterend platform van eind over bij 4 ° C gedurende 2 uur. Hier werd een ATR buis rotator gebruikt bij snelheid 22.</li>
	<li>Kralen verzamelen door centrifugeren bij 3000-5000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.</li>
	<li>Gecombineerd uit zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.</li>
	<li>Wassen kralen in 1 mL blastR was Buffer (remmers zijn niet nodig in dit stadium) gedurende 5 minuten op een 4 ° C roteren van platform.</li>
	<li>Kralen verzamelen door centrifugeren bij 3000-5000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.</li>
	<li>Gecombineerd uit zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.</li>
	<li>Herhaal de stap wassen (stappen 3.10-3.12) twee keer.</li>
	<li>Na de definitieve wash, volledig verwijderen buffer supernatant. Minimale verstoring van de kraal pellet is aanvaardbaar (tot een verlies van 5%). Residuele bovendrijvende vloeistof verwijderen met behulp van een boete droeg eiwit laden tip.</li>
	<li>Voeg 30 µL van kraal elutie buffer en resuspendeer de kralen door zachtjes te tikken/flicking de kant van de buis. Gebruik een pipet niet in dit stadium. Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Spoel zachtjes elke kraal-suspensie op een 1,5 mL microcentrifuge spin kolom die in een tube van 1,5 mL microcentrifuge is geplaatst. Opmerking: Het is aanbevolen om het einde off van de overdracht Pipetteer tip voor zachtere overdracht snip.</li>
	<li>Centrifugeer bij 9000-10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur aan de IP-monster verzameld.</li>
	<li>2 µL van 2-mercaptoethanol toevoegen aan elk monster en meng goed. Opmerking: Het is handig om snap het deksel uit de kolom van de spin en gebruik dit om de dop van de tube collectie voor verdere verwerking.</li>
	<li>Leg monsters in een bad van water van 95 ° C voor 5 min. verzamelen monster door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 1 minuut op RT.</li>
	<li>Indien nodig, monsters bij-70 ° C worden opgeslagen en stoppen hier, of gaan met SDS-pagina, overdracht en westelijke vlekkenanalyse (afdeling 4).</li>
</ol>4. westelijke vlekkenanalyse: Identificatie van de proteïne van belang
<ol><li>Afzonderlijke monsters door natrium dodecyl sulfaat van polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en transfer naar een Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan, volgens standaard laboratorium protocollen32.</li>
	<li>Het gebruiken van een primair antilichaam voor het detecteren van de post-translationally gewijzigde versies van de proteïne van belang. Hier, werd PD-L1 antilichaam gebruikt voor het detecteren van post-translationally gemodificeerde PD-L1.</li>
	<li>Ultrasensitive Chemoluminescentie detectie reagens wordt gebruikt voor detectie. Opmerking: De chemiluminiscent reagens gebruikt moet worden gebruikt in combinatie met een HRP-gelabeld secundair antilichaam die kunnen detecteren of het primaire antilichaam.</li>
	<li>Een volume van 2 mL chemiluminescent reagens wordt gebruikt per mini-gel en middelgrote overdracht membraan (ongeveer 8 x 7 cm) gebruiken.<ol>
<li>Na incubatie met passende secundair antilichaam (60 min op RT wordt aanbevolen), de vlek 6 x 10 min wassen in 30 mL tris-gebufferde zoutoplossing-tween-20 (TBST). Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.</li>
		<li>Onmiddellijk vóór gebruik, meng 1 mL chemiluminescent reagens A met 1 mL chemiluminescent reagens B (voldoende voor een 8 x 7 cm membraan).</li>
		<li>Voeg chemiluminescent reagens wordt gebruikt aan membraan en incubeer met zachte rockende op RT voor 1-5 min vóór visualisatie van eiwit signaal met x-ray film of charge - coupled apparaat (CCD) camera imaging. Opmerking: Kortere incubatietijd tijden in het chemiluminescent reagens kunnen nodig zijn voor zeer overvloedig eiwitten zijn.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27296530">The world of protein acetylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).</li>
<li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin modifications.</a> Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).</li>
<li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3996475/">The genesis of tyrosine phosphorylation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).</li>
<li>International Human Genome Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finishing+the+euchromatic+sequence+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finishing the euchromatic sequence of the human genome.</a> Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).</li>
<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification-specific+proteomics%3A+characterization+of+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).</li>
<li>Pellegrino, S., Altmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Ubiquitin%2C+SUMO%2C+and+Poly%28ADP-Ribose%29+in+the+Cellular+Response+to+Genotoxic+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress.</a> Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).</li>
<li>Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+decorations%3A+post-translational+modifications+and+heart+disease+delineated+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics.</a> Genome Med. 5 (2), 20(2013).</li>
<li>Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxia%2C+dementia%2C+and+hypogonadotropism+caused+by+disordered+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination.</a> N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).</li>
<li>Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+rules%3A+regulatory+concepts+and+their+implication+in+neurologic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions.</a> Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).</li>
<li>Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+nuclear+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Recept+Signal%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease.</a> Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).</li>
<li>Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transcription+factor+modifications+in+the+pathogenesis+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance.</a> Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).</li>
<li>West, A. C., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+emerging+HDAC+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment.</a> J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
<li>Gu, B., Zhu, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surf+the+post-translational+modification+network+of+p53+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Surf the post-translational modification network of p53 regulation.</a> Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).</li>
<li>Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%3A+molecular+components%2C+readout+mechanisms%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions.</a> J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).</li>
<li>Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+ubiquitination+meets+phosphorylation%3A+a+systems+biology+perspective+of+EGFR%2FMAPK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling.</a> Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).</li>
<li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+age+of+crosstalk%3A+phosphorylation%2C+ubiquitination%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond.</a> Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).</li>
<li>Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+stimulates+the+epithelial+sodium+channel+by+reducing+its+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation.</a> J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+posttranslational+modifications+regulate+PKC+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation.</a> Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).</li>
<li>Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+posttranslational+modifications+program+FEN1+degradation+during+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression.</a> Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).</li>
<li>Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SUMO-acetyl+switch+in+PXR+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A SUMO-acetyl switch in PXR biology.</a> Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).</li>
<li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Siuti, N., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+protein+modifications+using+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry.</a> Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).</li>
<li>Mischerikow, N., Heck, A. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21246731">Targeted large-scale analysis of protein acetylation.</a> Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).</li>
<li>Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+endogenous+SUMO1+and+SUMO2%2F3+targets+in+mammalian+cells+and+tissues+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies.</a> Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).</li>
<li>Emmerich, C. H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+methods+for+the+preservation%2C+capture+and+identification+of+ubiquitin+chains+and+ubiquitylated+proteins+by+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).</li>
<li>Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+proteins%3A+the+importance+of+lysis+buffer+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice.</a> Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).</li>
<li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).</li>
<li>Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Regulatory+Posttranslational+Modifications+of+PD-L1%3A+A+Focus+on+Monoubiquitinaton%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton.</a> Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).</li>
<li>Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+toolset+to+identify+endogenous+post-translational+modifications+for+a+target+protein%3A+a+snapshot+of+the+EGFR+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway.</a> Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRF+phosphorylation+by+glycogen+synthase+kinase-3+promotes+axon+growth+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Strahl, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+histone+post-translational+modifications%3A+emerging+issues+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects.</a> Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+combinatorial+histone+modifications+on+antibody+and+effector+protein+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition.</a> Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).</li>
<li>Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitination+and+Stabilization+of+PD-L1+by+CSN5%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5.</a> Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).</li>
<li>Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+method+to+measure+absolute+protein+phosphorylation+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries.</a> Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).</li>
<li>Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ubiquitin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying ubiquitin signaling.</a> Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).</li>
<li>Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+balance+between+phosphorylation+and+O-GlcNAc+glycosylation+of+Tau+proteins--a+role+in+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization.</a> Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).</li>
<li>Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Roles+of+Fructose%3A+Crosstalk+between+O-Linked+Glycosylation+and+Phosphorylation+of+Akt-TSC2-MTOR+Cell+Signaling+Cascade+in+Ovine+Trophectoderm+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells.</a> Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).</li>
<li>Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Cbl%2FSli-1+regulates+endocytic+sorting+and+ubiquitination+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor.</a> Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).</li>
<li>Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+at+K340+inhibits+tau+degradation+through+deregulating+its+phosphorylation+and+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).</li>
</ol>

H.H. en A.L. zijn werknemers van cytoskelet Inc. K.M. is een van de oprichters van cytoskelet Inc.

Eerste benaderingen gebruikt om te bepalen of een doel-proteïne is gewijzigd door een PTM kunnen worden uitgevoerd met behulp van het doel eiwit specifieke antilichaam voor IP, gevolgd door westelijke vlek met een antilichaam PTM (bv., anti-acetyl lysine), of met behulp van een antilichaam PTM voor IP, gevolgd door westelijke vlek met de doelgroep eiwit specifiek antilichaam30,31,33. Hoewel beide benaderingen theoretisch werken, heeft gebruik makend van een doel-eiwit-specifieke antilichaam meer potentiële valkuilen, zoals het antilichaam niet IP compatibel worden kan of grote PTM wijzigingen de antilichaam erkenning site op het doel eiwit34 blokkeren kunnen ,35. Het voordeel van de PTM affiniteit kralen is dat het antilichaam of bindende domeinen specifiek de PTM van belang herkennen; Dus, aangebrachte wijzigingen in het doel-eiwit moeten niet meer wijzigen erkenning door de affiniteit kralen. Als voorbeeld, PD-L1 Ub werd geïdentificeerd met de hier beschreven techniek, en zowel endogene mono - en poly-Ub werd waargenomen (Figuur 4). Een recente publicatie door Lim et al. in vitro Ub technieken om te onderzoeken PD-L1 Ub gebruikt, en het resultaat was erg vergelijkbaar met de resultaten die worden weergegeven in Figuur 436. Interessant, traden ze ook IP met een antilichaam PD-L1 te verrijken PD-L1 uit cel lysate, waar Ub was overexpressie en MG-132 is toegevoegd aan het verbeteren van het signaal. De Ub-patroon was niet robuust en zeer verschillend zijn van het in vitro Ub patroon. Onderzoek van endogene PD-L1 Ub in cel cultuur modellen werd niet in de Lim et al.uitgevoerd. verslag aan het verschil tussen hun cultuur en in vitro celgegevens verduidelijken.
Onderzoeken of een eiwit is gewijzigd door een PTM kan lastig zijn, vanwege de lage overvloed en38van de37,van voorbijgaande aard, en vaak vereist verrijking via IP. Effectieve IP van PTMs vereist optimalisatie van verschillende belangrijke stappen en reagentia, zoals lysis buffers en affiniteit reagentia. Bij het onderzoeken van meerdere PTMs van een doel-eiwit, verhoogt de vereiste optimalisatie waarschijnlijk. Met behulp van het systeem van de lysis van de blastR is een cruciale stap in dit protocol, zoals het onderhoudt robuuste IP-vermogen, terwijl het toelaten van PTM detectie van de pY, SUMO 2/3, Ub en Ac PTMs in één systeem. Deze techniek wordt geoptimaliseerd voor de tijd en middelen vereist om te bepalen of een specifiek streefcijfer proteïne is gewijzigd door deze vier PTMs en potentieel geeft een beter beeld van PTM Overspraak ten opzichte van het vergelijken van PTM resultaten uitgevoerd met behulp van meerdere lysis van de systemen. Onderzoek van het blastR systeem van de lysis van de compatibiliteit met alternatieve PTMs, zoals glycosylatie, werd uitgevoerd; echter, het is niet onderzocht uitputtend voor alle soorten PTMs.
Overvloedige genomic DNA kan interfereren met eiwit metingen met behulp van hetzij colorimetrische of nanodrop methoden, invloed op de migratie van eiwitten in een SDS acrylamide gel en voorkomen van eiwitten en affiniteit matrix interactie tijdens IP-testen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een speciale filter om effectief verwijderen van genomic DNA besmetting, dat een andere kritische stap van dit protocol is. Nadruk wordt gelegd op dit punt, viscositeit tests werden uitgevoerd voor en na blastR filter behandeling en de resultaten toonden een vermindering van een hoge viscositeit tot de viscositeit van water (gegevens niet worden weergegeven). Deze verandering in de viscositeit werd gesteund door de resultaten in Figuur 3, waaruit blijkt dat bijna alle van de genomic DNA had verwijderd. Nog belangrijker is, is DNA niet geschoren met deze methode, zoals elke sheared DNA zal niet worden onderschept door het filter (gegevens niet worden weergegeven). Dit hulpprogramma is superieur aan conventionele methoden, zoals ultrasoonapparaat of spuit-DNA-scheren, omdat het vereist geen gespecialiseerde apparatuur, zeer reproduceerbaar, en verwijdert het DNA in plaats van het scheren. Bovendien, het zal niet degraderen eiwit in de lysate, die zich kan voordoen met behulp van conventionele methoden29. Met behulp van het filter duurt 5-30 seconden per monster vergeleken met alternatieve methoden waar effectieve verdeling van DNA kan enige tijd duren (d.w.z., spuit schuintrekken) en kan leiden tot voorbeeld heterogeniteit zoals DNA verontreinigingen in de lysate blijven. Uitgebreide analyse van het filteren van de lysate pre- en post-blastR werd uitgevoerd, en geen waarneembaar verschil in het profiel van eiwit werd waargenomen door Coomassie, doelgroepen gerichte westerse, of totale en doelgroepen gerichte PTM analyses; Dus, de integriteit van het eiwit-profiel kan niet zijn getroffen door de genomic DNA worden uitgefilterd. Uiteindelijk, dit filtersysteem is heilzaam voor een westerse of IP-applicatie waar genomic DNA is aanwezig en kan van invloed zijn op de interpretatie van de eiwit-analyse.
Het is belangrijk op te merken dat er is potentieel voor valse negatieve detectie met behulp van deze techniek, die wijten zijn gedeeltelijk aan affiniteit kraal verzadiging, bindende site interferentie of PTM maskeren te kan. Bijvoorbeeld, kan een bepaald doel-eiwit worden gewijzigd door Ac op een zeer laag niveau; het kan dus niet worden geïsoleerd door pan-acetyl lysine affiniteit kralen die hebben al verzadigd door meer overvloedig doel Ac gemodificeerde eiwitten. Lopende studies worden uitgevoerd voor de beoordeling van de detectiegrenzen van de affiniteit reagentia die in dit protocol wordt gebruikt, maar een recente publicatie suggereert dan ook een zeer robuuste detectiegrens. De gegevens bleek dat deze techniek kon identificeren slechts 17 geacetyleerd doel eiwitmolecules per cel31. Nog steeds, specifieke omstandigheden zoals cell type specificiteit, voorbijgaande PTMs in antwoord op specifieke stimuli, of maskeren van PTMs als gevolg van eiwit interactie kan alle leiden tot vals-negatieve resultaten. Dit zijn de mogelijke valkuilen van deze techniek, evenals de meeste PTM IP methoden. Het is dus aangeraden resultaten met behulp van meerdere benaderingen te bevestigen.
Wijzigingen zoals glycosylatie en fosforylering is gebleken om te concurreren voor soortgelijke aminozuren39,40, en andere PTMs zoals ubiquitination en fosforylering is aangetoond dat ze werken achter elkaar om te regelen van een eiwit functie17,41. Recent werk op de neuropathologische eiwit Tau gewezen op het belang van PTM Overspraak, waar-hyper Tau fosforylatie en Tau SUMOylation elkaar42 versterkt. Bovendien, deze groep toonde dat SUMOylation van Tau voorkomen poly-Ub en latere Tau aantasting, eventueel leiden tot samenvoeging. Dit is enkel één van vele voorbeelden van regelgevende PTM overspraak en het nut van deze techniek voor het verlichten van het belang van PTMs en hun Overspraak bij het reguleren van de belangrijke eiwitten in gezondheid en ziekte zal helpen.

Posttranslationele modificaties (PTMs) zijn sterk gereguleerde wijzigingen aan een proteïne, waarbij de wijziging wordt toegevoegd of verwijderd op een specifieke wijze. PTMs zijn vaak dynamische, voorbijgaande veranderingen die aanzienlijk veranderen de eiwitstructuur, interacties met partner eiwitten, ruimtelijke lokalisatie en uiteindelijk waardoor de eiwitten voor het uitvoeren van verschillende functies1,2 , 3 , 4. PTMs zijn zo overvloedig dat ze het aantal unieke eiwit vormen (of proteoforms) van ongeveer 30.000 genproducten tot meer dan een miljoen proteoforms5,6 stijgen. Het identificeren van PTMs en definiëren hun effect op een doel-proteïne is kritisch naar het begrip van het eiwit van fysiologische en pathologische functies7,8,9,10, 11,12,13,14. Werken op select eiwitten zoals tubuline, p53 en epidermale groeifactor receptor (EGFR) de regelgevende taken van PTMs15,16,17hebben toegelicht. Deze studies aan het licht gebracht dat de verordening van deze eiwitten ontstaat door meerdere PTMs, en in veel gevallen deze wijzigingen werken in concert ter bevordering van een specifieke functie. Nieuwe studies hebben aangetoond dat zowel de negatieve als de coöperatieve PTM Overspraak kan plaatsvinden op diverse verschillende eiwitten18,19,20,21,22, 23,24,25. Echter zijn de PTM profielen van de meerderheid van eiwitten opgebouwd uit verschillende studies die hebben gebruikt verschillende modellen en unieke omstandigheden. Een geoptimaliseerde systeem te onderzoeken van meerdere PTMs in één systeem zou zeer gunstig inzicht te krijgen in de potentiële PTM Overspraak voor een doel-eiwit.
Een uitdaging met het onderzoek naar PTMs in één systeem is dat er specifieke PTMs worden onderzocht met behulp van verschillende lysis buffers. Bijvoorbeeld het gebruik van buffers zoals RIPA of NP-40 die vaak worden gebruikt voor fosforylatie of ubiquitination onderzoeken mogelijk onvoldoende voor het bestuderen van een labiele PTM zoals kleine ubiquitin-achtige modifier (SUMO) ylation26. Bovendien, niet-denaturering buffers niet toereikend zijn om eiwitinteractie distantiëren, en kunnen leiden tot valse positieve PTM identificatie27. Onderzoek naar PTMs in een denatureren lysis-buffermengsel kan zijn voorkeur, en het is aanzienlijk beter bij het isoleren van eiwitten uit alle cellulaire compartimenten28, zal de meeste eiwitinteractie distantiëren, zal remmen proteasen die veranderen van PTM Staten, zoals deSUMOylases 26; echter de denaturering van buffers kan de integriteit van specifieke affiniteit reagentia zoals ubiquitin bindend domein gebaseerde tools27compromis. Ontwikkeling van een systeem van de lysis van de denaturering-achtige om te bestuderen van meerdere PTMs van een proteïne in een affiniteit reagens-compatibel systeem zou zeer nuttig zijn voor PTM Overspraak onderzoeken.
Hoewel denatureren buffers belangrijke voordelen ten opzichte van niet-denaturering buffers hebben voor het onderzoek naar PTMs, ze kunnen minder vaak gebruikte vanwege hun aanzienlijke nadelen, zoals incompatibiliteit met conventionele eiwit testen, aanzienlijke genomic deoxyribonucleic acid (DNA) verontreiniging en verstoring van immunoprecipitation (IP) reagentia29. Deze nadelen kunnen leiden tot langere voorbereidingstijd en mogelijke schade aan target eiwitten wanneer scheren genomic DNA. Twee veelgebruikte methoden wilt schuintrekken DNA omvatten spuit lysis en ultrasoonapparaat29. Beide methoden vereisen uitgebreide optimalisatie en ontbreekt het vaak aan precieze reproduceerbaarheid. Alternatieve methoden voor het verwijderen van genomic DNA omvatten de toevoeging van DNAses; echter hiervoor kunnen aanvullende optimalisatie en wijzigingen in de samenstelling van de buffer. Uiteindelijk, een eenvoudige en reproduceerbare methode om te verwijderen van genomic DNA besmetting zou zinvol zijn bij het werken met de denaturering van lysis buffers voor PTM onderzoeken.
Het doel van deze techniek is het ontwikkelen van een systeem om te isoleren en onderzoeken ubiquitination (Ub), tyrosine fosforylering (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) en acetylation (Ac) PTMs in één systeem beter onderzoeken PTM Overspraak voor een doel-eiwit. Dit detectiesysteem PTM werd gebruikt om te onderzoeken snel het endogene PTM-Profiel van verschillende doel eiwitten in een enkel systeem. Nieuw inzicht in de potentiële Overspraak was geïdentificeerde30,31. Over het geheel genomen de hier beschreven techniek verbetert op bestaande methoden te onderzoeken PTMs en PTM Overspraak op drie verschillende manieren: 1) een unieke denatureren buffer werd ontwikkeld dat isoleert van eiwitten uit alle cellulaire compartimenten, terwijl nog steeds compatibel met PTM affiniteit reagentia, 2) een uniek filtersysteem werd ontwikkeld dat snel genomic DNA besmetting verwijderd gedenatureerde lysates met hoge reproduceerbaarheid en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, en 3) de robuuste affiniteit kralen, lysis systeem, en remmende reagentia stroken; Dus, het vereenvoudigen van het isolement van deze vier PTMs voor een doel-eiwit om te maximaliseren PTM verrijking, en potentiële Overspraak efficiënt te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Cel lysis/genoom DNA verwijdering en analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>Recept: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4</td></tr><tr><td>BlastR lysis buffer</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BLST01</td><td>Gepatenteerde mix van detergentia, zouten en andere bufferadditieven</td></tr><tr><td>Radioimmunoprecipitatie assay buffer (RIPA)</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>Recept: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal</td></tr><tr><td>Mammalian eiwit extractie reagens (mPER)</td><td>Thermofisher</td><td>78503</td><td>Gepatenteerde mix van detergentia, zouten en andere bufferadditieven</td></tr><tr><td>Immunoprecipitatie (IP) Lysis</td><td>Pierce</td><td>87787</td><td>Gepatenteerde mix van detergentia, zouten en andere bufferadditieven</td></tr><tr><td>1% natriumdodecylsulfaat (SDS) denaturerende buffer</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>Recept: PBS, SDS, EDTA, EGTA</td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>Recept: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromofenolblauw</td></tr><tr><td>BlastR verdunningsbuffer</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BDB01</td><td>Gepatenteerde mix van detergentia, zouten en andere bufferadditieven</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>PIC02</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimide (NEM) &amp; N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethyleendiamine (TPEN)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>NEM09BB</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatin A (TSA) &amp; Nicotinamide</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>TSA01</td><td></td></tr><tr><td>Geactiveerd natriumorthovanadate (Na3VO4)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>PYI01</td><td></td></tr><tr><td>cel schrapers</td><td>Costar</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>BlastR Filter</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BLR02</td><td></td></tr><tr><td>BD Insuline spuitnaald</td><td>BD</td><td>08290-3284-11</td><td></td></tr><tr><td>sonicator (Branson Sonifier)</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>Precision Red Advanced Protein Reagens</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>ADV02</td><td></td></tr><tr><td>1 mL cuvettes</td><td>Fisher</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer (Genesys20)</td><td>Thermofisher</td><td>4001</td><td>Andere spectrofotometers kunnen worden gebruikt om eiwitconcentratie te meten</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>BP1356-500</td><td></td></tr><tr><td>1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder</td><td>NEB</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>DNA gel box</td><td>Thermofisher</td><td>7312 B1A</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>Recept: Tris-HCl, Boorzuur, EDTA</td></tr><tr><td>PTM Immunoprecipitatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfotyrosine kralen</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>APY03-kralen</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitinatie kralen</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>UBA01-kralen</td><td></td></tr><tr><td>SUMOylation 2/3 kralen</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>ASM24-kralen</td><td></td></tr><tr><td>Acetylatie kralen</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>AAC04-kralen</td><td></td></tr><tr><td>Fosfotyrosine controle kralen</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CIG01-kralen</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitinatie controle kralen</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CUB02-kralen</td><td></td></tr><tr><td>SUMOylation 2/3 controle kralen</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CIG01-kralen</td><td></td></tr><tr><td>Acetylatie controle kralen</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CIG02-kralen</td><td></td></tr><tr><td>BlastR wasbuffer</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BWB02</td><td>Gepatenteerde mix van detergentia, zouten en andere bufferadditieven</td></tr><tr><td>Kraal elutie buffer</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>BEB01</td><td>Gepatenteerde mix van detergentia, zouten en andere bufferadditieven</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417</td><td>Andere microcentrifuges kunnen worden gebruikt&nbsp;</td></tr><tr><td>buis rotator</td><td>ATR</td><td>RKVSD</td><td>Andere eind-over-eind buis rotators kunnen worden gebruikt&nbsp;</td></tr><tr><td>eiwit laadtips</td><td>VWR</td><td>37001-150</td><td></td></tr><tr><td>spin columns</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>SPN22</td><td></td></tr><tr><td>hitteblok 95 &deg;C</td><td>Benchmark</td><td>BSH1002</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE/Transfer/Western analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x sample buffer</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>recept: Bromofenolblauw, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl</td></tr><tr><td>novex wedge well 4-20% Tris-gly gels</td><td>Invitrogen</td><td>XP04200BOX</td><td>De grote wedgewells zijn uitstekend voor het laden van grote volumes</td></tr><tr><td>1x Loopbuffer</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>recept: Tris-HCl, Glycine, SDS</td></tr><tr><td>seeblue eiwit ladder</td><td>Life Technologies</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr><td>elektroforese cel</td><td>Invitrogen</td><td>Xcell SureLock elektroforese cel</td><td>Andere elektroforese cellen kunnen worden gebruikt, deze zijn echter compatibel met de novex wedgewell gels&nbsp;</td></tr><tr><td>stroomvoorziening</td><td>Biorad</td><td>PowerPac HC</td><td>Andere stroomvoorzieningen kunnen worden gebruikt&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Transfer buffer</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>recept: Tris-HCl, glycine, methanol</td></tr><tr><td>Transfer cel</td><td>Biorad</td><td>mini trans-blot cel</td><td>Andere transfer cellen kunnen worden gebruikt&nbsp;</td></tr><tr><td>Immobilon- P membranen (PVDF)</td><td>millipore</td><td>IPVH 304F0</td><td></td></tr><tr><td>magere melk</td><td>thrive</td><td>813503015095</td><td></td></tr><tr><td>Tris gebufferde zoutoplossing met tween (TBST)</td><td>gebruikelijke buffer</td><td></td><td>recept: Tris-HCl, NaCl, Tween 20</td></tr><tr><td>Chemiluminescent Detectiereagens</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CLRA/CLRB</td><td></td></tr><tr><td>Celgroei en behandeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's medium&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>ATLAS</td><td>&nbsp;F-0500-A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Epidermale groeifactor</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>CN02-A</td><td></td></tr><tr><td>150 mm celkweekplaten</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td>

met behulp van een uitgebreide immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor target eiwitten

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Het is nu goed gewaardeerd dat posttranslationele modificaties (PTMs) een integrale rol spelen in het reguleren van de structuur en de functie, die essentieel zijn voor een bepaald eiwit rol zowel fysiologisch en pathologisch van een eiwit. Verrijking van PTMs is het vaak nodig bij het onderzoeken van de PTM status van een doel-eiwit, omdat PTMs vaak van voorbijgaande aard zijn en relatief laag in overvloed. Vele valkuilen worden aangetroffen als verrijkend voor een PTM van een doel-eiwitten, zoals buffer onverenigbaarheid, is het doel eiwit antilichaam niet IP-compatibele, verlies van PTM signaal, en anderen. De graad van moeilijkheid wordt vergroot bij het onderzoeken van meerdere PTMs zoals acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering voor een bepaald doel-eiwit. Bestuderen van een combinatie van deze PTMs kan noodzakelijk zijn als Overspraak tussen PTMs overwegend en essentieel voor eiwit-verordening is. Deze PTMs worden vaak bestudeerd in verschillende lysis buffers en met unieke remmer composities. Om het proces te vereenvoudigen, unieke denatureren lysis werd een systeem ontwikkeld dat effectief isoleert en behoudt deze vier PTMs; waardoor onderzoek van potentiële overspraak in een enkele lysis-systeem. Een uniek filtersysteem werd ontworpen om te verwijderen besmetten genomic DNA van de lysate, die een problematische bijproduct van de denaturering van buffers. Robuuste affiniteit matrices gericht op elk van de vier PTMs werden ontwikkeld in samenspraak met de buffersysteem om de verrijking en de detectie van de endogene Staten van deze vier PTMs te maximaliseren. Deze uitgebreide PTM detectie toolset stroomlijnt het proces van het verkrijgen van belangrijke informatie over of een eiwit is gewijzigd door een of meer van deze PTMs.

Het vermogen van deze hulpprogramma's te onderzoeken van PTM Overspraak door effectief opsporen van deze 4 PTMs is deels afhankelijk van de unieke lysis buffersysteem. De blastR denatureren buffer isoleert effectief eiwitten uit alle cellulaire compartimenten ook aan andere denatureren buffers, die zorgt voor een compleet eiwit Profiel (figuur 2A). Daarnaast behoudt het zeer labiele PTM signalen zoals SUMO 2/3, die is snel verminderd in niet-denaturering buffers zoals radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (figuur 2B). Nog belangrijker is, wanneer op de juiste manier verdund, heeft het geen invloed op de integriteit van de affiniteit reagentia zoals andere denatureren buffers (b.v., Laemmli buffer).
Een belangrijke hindernis bij het werken met denatureren buffers is de mogelijkheid om effectief verwijderen van genomic DNA besmetting. De conventionele methode voor het verminderen van de viscositeit is wilt schuintrekken van het DNA met behulp van een naald van de spuit of sonicating van het monster. Figuur 3A toont genomic DNA besmetting in A431 cel lysate na behandeling met BlastR filter, naald van de spuit of ultrasoonapparaat. Er is bijna volledige verwijdering van genomic DNA met behulp van de filter van de BlastR, die niet het geval is met behulp van een conventionele spuit-naald of ultrasoonapparaat. Genomic DNA besmetting heeft grote invloed op eiwit migratie door middel van een SDS-acrylamide gel; behandeling met het BlastR-filter verwijdert echter genomic DNA, resulterend in goede eiwit migratie (figuur 3B). Gewijzigde migratie veroorzaakt door genomic DNA besmetting kan aanzienlijk beïnvloeden interpretatie western blots; bijvoorbeeld kan het vlekkerig EGFR patroon gezien in de ongefilterde lysate worden onnauwkeurig geïnterpreteerd als uitdrukking van de toegenomen ten opzichte van het gefilterde monster (Figuur 3 c).
Door gebruik te maken van deze geoptimaliseerde PTM verrijkings- en detectie systeem, kan men snel bepalen als een doel-eiwit wordt gewijzigd door een of meer PTMs. onderzoek van de PD-L1 PTM profiel werd onlangs uitgevoerd met behulp van deze techniek, en de resultaten bleek dat PD-L1 ubiquitinated, geacetyleerd, en tyrosine phosphorylated in reactie op EGF (Figuur 4). Nog belangrijker is, deze gegevens gerapporteerd endogene PD-L1 PTM veranderingen, die vertegenwoordigd een klein percentage van de totale PD-L1 geïdentificeerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig1.jpg"> Figuur 1: genomic DNA van de cel lysate filteren met BlastR filter. (A) afbeelding van BlastR filter. (B) Lysate is geladen in het filter dat werd geplaatst in een tube van 15 mL collectie. (C) de plunjer wordt geplaatst in de spuit en lysate is doorgegeven door het filter van compressie. (D) verzamelen lysate, met inbegrip van alle bubbels door volledige compressie. (E) gefilterd lysate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig2.jpg"> Afbeelding 2: vergelijking van BlastR lysis-buffermengsel naar alternatieve lysis buffers. Figuur 2A aangepast van Horita et al. 2017. de de Biosci. Rep. 31 (A) A431 cellen werden lysed met RIPA, mPER, BlastR, IP-lysis, denaturering (1% SDS), en Laemmli lysis buffers. Alle denatureren lysates had genomic DNA verwijderd met behulp van BlastR filter. Isolatie van proteïnen van de membraan, cytoplasmatische, mitochondriaal, en nucleaire markeringen werden bepaald met behulp van antilichamen tegen de respectieve compartiment marker proteïnen. (B) de A431 cellen werden met BlastR, RIPA en 1% SDS denatureren buffer lysed. Lysates waren immunoprecipitated met SUMO 2/3 of besturingselement IgG affiniteit kralen. Monsters werden gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd door westelijke vlek met behulp van een SUMO 2/3-horseradish peroxidase (HRP) antilichaam. Vertegenwoordiger vlekken van N≥3 onafhankelijke experimenten worden weergegeven. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig3.jpg"> Figuur 3: BlastR lysis filter is effectief in het verwijderen van genomic DNA. (A) A431 cellen werden lysed met een denatureren lysis-buffermengsel. Genomic DNA werd verwijderd of schuingetrokken met BlastR filter, naald van de spuit of ultrasoonapparaat 5, 10, 20 of 30 seconden. 2% van de lysate werd geanalyseerd door ethidiumbromide, agarose gelelektroforese. (B) Lysate uit A431 cellen lysed met een denatureren buffer was ofwel ongefilterd of hierop wilt filteren met de filter van de BlastR. Monsters werden gescheiden met SDS-pagina en gevisualiseerd met behulp van Coomassie vlek. (C) duplicaat monsters uit B werden gescheiden door SDS-PAGE, overgedragen aan PVDF, en EGFR eiwit werd onderzocht met behulp van een antilichaam EGFR. Representatieve blots uit N ≥3 onafhankelijke experimenten worden weergegeven. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56912/56912fig4.jpg"> Figuur 4: detectie voor het EGF-geïnduceerde posttranslationele modificaties voor PD-L1. Figuur overgenomen van Horita et al. 2017. neoplasia30(A). Serum-beperkte A431 cellen werden beide ongestimuleerde (UT) of gestimuleerd met EGF gedurende één uur voorafgaand aan cellysis met BlastR lysis-buffermengsel. WVA werd geanalyseerd voor PD-L1 niveaus (rijstroken 1,2). Ubiquitin bindende kralen (UBA01) werden gebruikt om IP-ubiquitinated eiwitten (rijstroken 3,4). Phosphotyrosine bindende kralen (APY03) werden gebruikt om IP-tyrosine-phosphorylated eiwitten (rijstroken 5,6). SUMO 2/3 bindende kralen (ASM24) werden gebruikt om IP-SUMOylated 2/3 eiwitten (rijstroken 7,8). Acetyl lysine bindende kralen (AAC01) werden gebruikt om IP-geacetyleerd eiwitten (rijstroken 9,10). IgG bindende controle kralen werden gebruikt om IP-aspecifieke bindende proteïnen (rijstroken 11,12). Monsters werden gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd door westelijke vlek met behulp van een antilichaam PD-L1. Een representatieve vlek uit N ≥3 onafhankelijke experimenten wordt weergegeven. Witte sterretjes werden gebruikt voor het markeren van PD-L1 pY en Ac eiwit bands. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56912/56912fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Berekeningen voor BlastR lysis-buffermengsel</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>2,0 mL</td>
			<td>5,0 mL</td>
			<td>10,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BlastR Lysis buffer</td>
			<td>965 ΜL</td>
			<td>1930 ΜL</td>
			<td>4.825 mL</td>
			<td>9.650 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tyrosine fosfatase Inhibitor</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>de-ubiquitinase/de-sumoylase-remmer</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HDAC-inhibitor</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteaseinhibitor cocktail</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Berekeningen voor BlastR verdunning buffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>4,0 mL</td>
			<td>8.0 mL</td>
			<td>20,0 mL</td>
			<td>40.0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BlastR Lysis buffer</td>
			<td>3.86 mL</td>
			<td>7.72 mL</td>
			<td>19.3 mL</td>
			<td>38.6 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tyrosine fosfatase Inhibitor</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>de-ubiquitinase/de-sumoylase-remmer</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>80 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HDAC-inhibitor</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>80 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteaseinhibitor cocktail</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>80 ΜL</td>
			<td>200 ΜL</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Lysis en verdunning Buffer voorbereiding grafiek. Grafiek verstrekken van concentraties van remmers toe te voegen voor een bepaalde lysis en verdunning buffervolume bij de voorbereiding van buffers voor lysis van de cel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gehalte aan andere melkeiwitten plaat</td>
			<td>De aanbevolen BlastR Lysis-buffermengsel volume</td>
			<td>Aanbevolen BlastR verdunning buffervolume</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 1 mg</td>
			<td>Combineren van eiwit uit meerdere platen</td>
			<td>Te maken van 1,5 mL eindvolume</td>
		</tr>
<tr>
<td>1-2 mg</td>
			<td>300 ΜL</td>
			<td>Te maken van 1,5 mL eindvolume</td>
		</tr>
<tr>
<td>2-4 mg</td>
			<td>600 ΜL</td>
			<td>3 mL eindvolume maken</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-6 mg</td>
			<td>900 ΜL</td>
			<td>Om het eindvolume 4.5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: BlastR Lysis/verdunning Buffer grafiek. Verstrekken van grafiek aanbevolen lysis en verdunning buffer volumes bij het verkrijgen van lysate.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Volume van cel lysate toegevoegd aan 1 ml reagens Precision Red eiwit Assay (µL)</td>
			<td>Multiplier te gebruiken met monster lezen OD600</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>30</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Multiplicatoren spectrofotometer lezingen omzetten in mg/mL Lysate. Grafiek conversie getallen te verlenen aan aide met berekening van de eiwitconcentratie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>affiniteit kralen</td>
			<td>volume van de kraal drijfmest/IP (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ubiquitination</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphotyrosine</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>SUMOylation 2/3</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acetylation</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>controle kralen</td>
			<td>volume van de kraal drijfmest/IP (mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ubiquitination controle kralen</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphotyrsoine controle kralen</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>SUMOylation 2/3 controle kralen</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acetylation controle kralen</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: Aanbevolen Volume van kralen/IP grafiek. Verstrekken van grafiek aanbevolen hoeveelheden van affiniteit parels te gebruiken per IP-reactie.

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om onervaren PTM-onderzoekers in staat te stellen effectief te bepalen of hun doelwiteiwit endogene is gemodificeerd door een of meer PTM's met behulp van een enkele uitgebreide systeem. Deze methode zal het onderzoek naar het gebied van post-translationele modificatie verbeteren door de detectie van belangrijke PTM's en potentiële kruisreacties voor elk doelwiteiwit mogelijk te maken met behulp van een enkel, vereenvoudigd systeem. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat niet-PTM-experts kunnen detecteren of een eiwit endogene is gemodificeerd door een of meer PTM's in hun modelsysteem.We hadden voor het eerst het idee voor deze methode tijdens het bestuderen van regulerende mechanismen voor verschillende celsignaleringsroutes en ontdekten dat onze gebruiksvriendelijke kits of systemen niet echt beschikbaar waren voor het bestuderen van niet-fosfo PTM's. Begin deze procedure met de voorbereiding van A431-cellen, zoals beschreven in de tekstprotocol. Bereid ook blaster lysis in verdunningsbuffers met remmers.Giet het kweekmedium af en plaats de cellen op ijs. Was vervolgens de cellen twee keer met 10 milliliter 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing. Verwijder zoveel mogelijk PBS voordat u blaster lysisbuffer toevoegt om cellysis te maximaliseren.Voeg 600 microliter blaster lysisbuffer toe aan elk 150 millimeter bord. De hoeveelheid buffer is gebaseerd op de verwachte eiwitopbrengst. Lyseer vervolgens de cellen met behulp van een celschraper.Het lysate wordt viskeus door nucleaire lysis. Gebruik een afgesneden 1 millimeter pipettentip om het ruwe lysate over te brengen in een blasterfilter dat in een 15 milliliter verzamelbuis is geplaatst. Gebruik de meegeleverde filterduwer om de blasterfilter volledig te comprimeren en verzamel het lysate flow-through, inclusief eventuele luchtbellen, in een 15 milliliter buis.Het eenvoudige, efficiënte blasterfilter verwijdert genomisch DNA, in plaats van het af te breken zoals gezien in andere veelgebruikte methoden. Verdun het opgehelderde lysate met blaster verdunningsbuffer tot een eindvolume van drie milliliter voor elk 150 millimeter bord. Het eindvolume is gebaseerd op de verwachte eiwitopbrengst.Deze stap is belangrijk, omdat de uiteindelijke buffersamenstelling de strengheid van de aminozuurprecipitatiereactie zal beïnvloeden. Bereid vervolgens de eiwitkwantificeringstest voor, zoals beschreven in de tekstprotocol. Meet de absorptie van het lysatemonster bij 600 nanometer en bereken de eiwitconcentratie.Keer de voorraadreagensbuis meerdere keren om te zorgen dat de kralen volledig in de buis zijn opgeschort. Voor elke IP-test, verdeel de kralensuspensie in aparte 1,5 milliliter microcentrifugebuizen op ijs. Voeg hier 20 microliter ubiquitine affiniteitskralen, 30 microliter fosfotyrosine affiniteitskralen, 40 microliter SUMOylering 2/3 affiniteitskralen of 50 microliter acetylering affiniteitskralen toe aan de individuele microcentrifugebuizen.Keer de voorraadreagensbuizen met ubiquitinering IP-controlekralen en IGG-controlekralen meerdere keren om om er zeker van te zijn dat de kralen volledig in de buis zijn opgeschort. Verdeel vervolgens de controlekralen per controlereactie om niet-specifieke binding te bepalen. Voeg hier 20 microliter ubiquitine controlekralen, 30 microliter fosfotyrosine controlekralen, 40 microliter SUMOylering 2/3 controlekralen of 50 microliter acetylering controlekralen toe aan individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen op ijs.Bewaar 20 microliter lysate om als western blot input lysate controle te gebruiken. Voeg vijf microliter 5x monsterbuffer toe aan het gereserveerde lysate en kook gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius. Voeg vervolgens lysate toe aan elke IP-buis en controle-IP-buis.Hier werd één milligram lysate gebruikt per IP en controlereactie, resulterend in een totaal van acht IP-reacties. Incubeer de buizen op een draaiend platform op vier graden Celsius gedurende twee uur. Na incubatie, verzamel de kralen door centrifugatie bij drie tot 5.000 keer G gedurende één minuut bij vier graden Celsius.Zuig zoveel mogelijk supernatant af zonder de kralen te verstoren, was vervolgens de kralen in één milliliter blaster wasbuffer gedurende vijf minuten op een draaiend platform van vier graden Celsius en verzamel de kralen door centrifugatie zoals eerder. Na centrifugatie, zuig zoveel mogelijk supernatant af zonder de kralen te verstoren en herhaal de wasstap nog twee keer. Na de laatste wasstap en centrifugatie, zuig het grootste deel van het buffersupernatant af en verwijder het resterende supernatant met behulp van een fijnboorgeïntegreerde eiwitlaadtip.Minimale verstoring van het kralenpellet is acceptabel. Zorg ervoor dat alle wasbuffer is verwijderd terwijl de verstoring van het kralenpellet wordt geminimaliseerd om de herstel van uw PTM-eiwitten te maximaliseren. Voeg vervolgens 30 microliter bead elutiebuffer toe en suspendeer de kralen door voorzichtig te tikken of te flikkeren aan de zijkant van de buis.Gebruik in dit stadium geen pipet. Incubeer de gesuspendeerde kralen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Snijd het uiteinde van de overdrachtpipettip af en breng elke bead suspensie voorzichtig over naar een 1,5 milliliter microcentrifuge spinkolom die in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis is geplaatst.Centrifugeer het monster tussen de negen en 10.000 keer G gedurende één minuut bij kamertemperatuur om het IP-monster te verzamelen, voeg vervolgens twee microliter 2-mercaptoethanol toe aan elk monster en meng goed. Plaats de monsters in een 95 graden Celsius waterbad gedurende vijf minuten. Na incubatie, verzamel het monster door centrifugatie bij 10.000 keer G gedurende één minuut bij kamertemperatuur.Ga ten slotte door met het uitvoeren van SDS PAGE, overdracht en western blot-analyse zoals beschreven in de tekstprotocol. Onbehandelde en EGF-behandelde A431-cellysaat werd toegevoegd aan ubiquitine, fosfotyrosine, SUMO 2/3 en acetyllysine affiniteits

utilizing-comprehensive-immunoprecipitation-enrichment-system-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Eiwit-eiwitinteracties zijn belangrijk voor het ophelderen van de functie van doeleiwitten, en co-immunoprecipitatie (co-IP) kan PPI's gemakkelijk bevestigen. We transfecteerden tijdelijk een plasmide dat codeert voor een epitoop-gelabeld eiwit in HEK-293-cellen en ontwikkelden een immunoprecipitatiemethode om de binding van twee doeleiwitten gemakkelijk te bevestigen.

Immunoprecipitatie met een Anti-Epitope Tag Affinity Gel om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen

Leer een gestroomlijnde immunoprecipitatiemethode om meerdere endogene posttranslationele modificaties van doeleiwitten te detecteren met A431-cellen. Dit systeem maakt PTM-onderzoek toegankelijk voor niet-experts.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten (Video) | JoVE Journal

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Meer video's verkennen