Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten
8 januari 2018
Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.
Het algemene doel van dit experimentele protocol is om onervaren PTM-onderzoekers in staat te stellen effectief te bepalen of hun doelwiteiwit endogene is gemodificeerd door een of meer PTM's met behulp van een enkele uitgebreide systeem. Deze methode zal het onderzoek naar het gebied van post-translationele modificatie verbeteren door de detectie van belangrijke PTM's en potentiële kruisreacties voor elk doelwiteiwit mogelijk te maken met behulp van een enkel, vereenvoudigd systeem. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat niet-PTM-experts kunnen detecteren of een eiwit endogene is gemodificeerd door een of meer PTM's in hun modelsysteem.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode tijdens het bestuderen van regulerende mechanismen voor verschillende celsignaleringsroutes en ontdekten dat onze gebruiksvriendelijke kits of systemen niet echt beschikbaar waren voor het bestuderen van niet-fosfo PTM's. Begin deze procedure met de voorbereiding van A431-cellen, zoals beschreven in de tekstprotocol. Bereid ook blaster lysis in verdunningsbuffers met remmers.
Giet het kweekmedium af en plaats de cellen op ijs. Was vervolgens de cellen twee keer met 10 milliliter 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing. Verwijder zoveel mogelijk PBS voordat u blaster lysisbuffer toevoegt om cellysis te maximaliseren.
Voeg 600 microliter blaster lysisbuffer toe aan elk 150 millimeter bord. De hoeveelheid buffer is gebaseerd op de verwachte eiwitopbrengst. Lyseer vervolgens de cellen met behulp van een celschraper.
Het lysate wordt viskeus door nucleaire lysis. Gebruik een afgesneden 1 millimeter pipettentip om het ruwe lysate over te brengen in een blasterfilter dat in een 15 milliliter verzamelbuis is geplaatst. Gebruik de meegeleverde filterduwer om de blasterfilter volledig te comprimeren en verzamel het lysate flow-through, inclusief eventuele luchtbellen, in een 15 milliliter buis.
Het eenvoudige, efficiënte blasterfilter verwijdert genomisch DNA, in plaats van het af te breken zoals gezien in andere veelgebruikte methoden. Verdun het opgehelderde lysate met blaster verdunningsbuffer tot een eindvolume van drie milliliter voor elk 150 millimeter bord. Het eindvolume is gebaseerd op de verwachte eiwitopbrengst.
Deze stap is belangrijk, omdat de uiteindelijke buffersamenstelling de strengheid van de aminozuurprecipitatiereactie zal beïnvloeden. Bereid vervolgens de eiwitkwantificeringstest voor, zoals beschreven in de tekstprotocol. Meet de absorptie van het lysatemonster bij 600 nanometer en bereken de eiwitconcentratie.
Keer de voorraadreagensbuis meerdere keren om te zorgen dat de kralen volledig in de buis zijn opgeschort. Voor elke IP-test, verdeel de kralensuspensie in aparte 1,5 milliliter microcentrifugebuizen op ijs. Voeg hier 20 microliter ubiquitine affiniteitskralen, 30 microliter fosfotyrosine affiniteitskralen, 40 microliter SUMOylering 2/3 affiniteitskralen of 50 microliter acetylering affiniteitskralen toe aan de individuele microcentrifugebuizen.
Keer de voorraadreagensbuizen met ubiquitinering IP-controlekralen en IGG-controlekralen meerdere keren om om er zeker van te zijn dat de kralen volledig in de buis zijn opgeschort. Verdeel vervolgens de controlekralen per controlereactie om niet-specifieke binding te bepalen. Voeg hier 20 microliter ubiquitine controlekralen, 30 microliter fosfotyrosine controlekralen, 40 microliter SUMOylering 2/3 controlekralen of 50 microliter acetylering controlekralen toe aan individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen op ijs.
Bewaar 20 microliter lysate om als western blot input lysate controle te gebruiken. Voeg vijf microliter 5x monsterbuffer toe aan het gereserveerde lysate en kook gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius. Voeg vervolgens lysate toe aan elke IP-buis en controle-IP-buis.
Hier werd één milligram lysate gebruikt per IP en controlereactie, resulterend in een totaal van acht IP-reacties. Incubeer de buizen op een draaiend platform op vier graden Celsius gedurende twee uur. Na incubatie, verzamel de kralen door centrifugatie bij drie tot 5.000 keer G gedurende één minuut bij vier graden Celsius.
Zuig zoveel mogelijk supernatant af zonder de kralen te verstoren, was vervolgens de kralen in één milliliter blaster wasbuffer gedurende vijf minuten op een draaiend platform van vier graden Celsius en verzamel de kralen door centrifugatie zoals eerder. Na centrifugatie, zuig zoveel mogelijk supernatant af zonder de kralen te verstoren en herhaal de wasstap nog twee keer. Na de laatste wasstap en centrifugatie, zuig het grootste deel van het buffersupernatant af en verwijder het resterende supernatant met behulp van een fijnboorgeïntegreerde eiwitlaadtip.
Minimale verstoring van het kralenpellet is acceptabel. Zorg ervoor dat alle wasbuffer is verwijderd terwijl de verstoring van het kralenpellet wordt geminimaliseerd om de herstel van uw PTM-eiwitten te maximaliseren. Voeg vervolgens 30 microliter bead elutiebuffer toe en suspendeer de kralen door voorzichtig te tikken of te flikkeren aan de zijkant van de buis.
Gebruik in dit stadium geen pipet. Incubeer de gesuspendeerde kralen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Snijd het uiteinde van de overdrachtpipettip af en breng elke bead suspensie voorzichtig over naar een 1,5 milliliter microcentrifuge spinkolom die in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis is geplaatst.
Centrifugeer het monster tussen de negen en 10.000 keer G gedurende één minuut bij kamertemperatuur om het IP-monster te verzamelen, voeg vervolgens twee microliter 2-mercaptoethanol toe aan elk monster en meng goed. Plaats de monsters in een 95 graden Celsius waterbad gedurende vijf minuten. Na incubatie, verzamel het monster door centrifugatie bij 10.000 keer G gedurende één minuut bij kamertemperatuur.
Ga ten slotte door met het uitvoeren van SDS PAGE, overdracht en western blot-analyse zoals beschreven in de tekstprotocol. Onbehandelde en EGF-behandelde A431-cellysaat werd toegevoegd aan ubiquitine, fosfotyrosine, SUMO 2/3 en acetyllysine affiniteits
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestroomlijnde methode voor het detecteren van meerdere endogene post-translationele modificaties (PTM's) van doeleiwitten. De techniek maakt gebruik van een geoptimaliseerde lysisbuffer en filtersysteem om de identificatie van acetylering, ubiquitinering, SUMOylering 2/3 en tyrosinefosforylering te vergemakkelijken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Posttranslationele modificaties
Achtergrond
- Post-translationele modificaties spelen een cruciale rol in de eiwitfunctie.
- Het gelijktijdig detecteren van meerdere PTM's kan uitdagend zijn.
- Bestaande methoden missen vaak gebruiksvriendelijke systemen voor niet-experts.
- Deze studie richt zich op de behoefte aan een uitgebreide detectiemethode.
Doel van de studie
- Om een vereenvoudigd protocol te bieden voor het detecteren van endogene PTM's.
- Om onderzoekers zonder expertise in PTM's in staat te stellen eiwitmodificaties te onderzoeken.
- Om het begrip van PTM-crosstalk in cellulaire signalering te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van A431-cellen en lyse met gebruik van een blaster-lysebuffer.
- Gebruik van affiniteitsmatrices voor specifieke PTM's.
- Eiwitkwantificering en immunoprecipitatie-assays.
- Western blot-analyse om PTM-modificaties te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- De methode identificeert effectief endogene modificaties van PD-L1.
- De resultaten duiden op een succesvolle detectie van meerdere PTM's in reactie op EGF-stimulatie.
- Deze aanpak is reproduceerbaar en gebruiksvriendelijk voor onderzoekers.
Conclusies
- De beschreven methode vereenvoudigt de detectie van diverse PTM's.
- Het maakt een bredere deelname aan PTM-onderzoek onder wetenschappers mogelijk.
- Toekomstige toepassingen kunnen het begrip van eiwitregulatie verbeteren.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de industrie
Het detecteren van endogene posttranslationele modificaties (PTM's) is cruciaal voor doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling. Deze methode maakt gelijktijdige beoordeling van acetylering, ubiquitinerings, SUMOylering 2/3 en tyrosinefosforylering mogelijk, waardoor een gestroomlijnde aanpak ontstaat om PTM-cross-talk en functionele proteïnestaten te evalueren. Door technische barrières voor niet-experts te verlagen, ondersteunt het reproduceerbare, schaalbare PTM-profilering binnen discovery-workflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de endogene PTM-status van doeleiwitten te bepalen.
- Operationele waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door directe detectie van meerdere PTM's in een enkele lysaatpreparatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van target-betrouwbaarheid door modificatiepatronen te onthullen die de stabiliteit, activiteit of interacties van eiwitten kunnen beïnvloeden.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert een geklaard lysaat dat compatibel is met downstream immunoprecipitatie en western blot-analyse.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van een denaturerend lysis- en filtratiesysteem om genomisch DNA te verwijderen, waardoor variabiliteit in PTM-verrijking wordt geminimaliseerd.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-well-formaten en controle-reacties om aspecifieke binding over replicaten heen te beoordelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Maakt PTM-profilering mogelijk in ziekterelevante systemen, zoals EGF-gestimuleerde A431-cellen, waardoor ontdekkingen worden gekoppeld aan pathway-modulatie.
- Mechanistische Risicoreductie: Faciliteert de evaluatie van PTM-crosstalk, wat veel voorkomt in signaleringsnetwerken en cruciaal is voor het voorspellen van functionele uitkomsten.
- Preklinische Afstemming: Ondersteunt onderzoek naar biomarker-gerelateerde aspecten door endogene modificatietoestanden te identificeren die reageren op stimuli.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-engagement tot lead-identificatie en levert PTM-data die functionele assays en structuur-activiteitsrelaties informeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door vast te stellen of een doeleiwit endogene modificatie ondergaat onder basale of gestimuleerde omstandigheden.
- Screening: Levert kwantitatieve PTM-verrijkingsresultaten die genormaliseerd kunnen worden en vergeleken kunnen worden tussen verschillende condities of behandelingen met verbindingen.
- Analytics: Genereert monsters die geschikt zijn voor immunoblotting, waardoor semi-kwantitatieve beoordeling van modificatieniveaus en stoichiometrie mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische validatie door PTM-dynamiek te beoordelen in cellulaire modellen met ziekterelevantie.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd PTM-detectieplatform dat toepasbaar is op meerdere targets en projecten.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij target-validatie door het verminderen van fout-negatieven als gevolg van het over het hoofd zien van PTM's.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde lyse, filtratie en bead-gebaseerde verrijking.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van functionele variabiliteit gestuurd door PTM's mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door targets te identificeren met modificatiepatronen die gekoppeld zijn aan pathway-activiteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in immunoprecipitatie- en western blot-technieken.
- Afhankelijk van toegang tot centrifugatie, rotatieplatformen en compatibele affiniteitsmatrices.
- Vereist standaardisatie van lysis- en wascondities tussen gebruikers en laboratoria.
- Aanpassing aan alternatieve modelsystemen kan optimalisatie van de compatibiliteit van de lysisbuffer vereisen.
- Praktische beperking: de detectie van het PTM-signaal is afhankelijk van de antilichaamspecificiteit en de abundantie van de modificatie.
