Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie
3 april 2018
Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.
Het algemene doel van dit protocol is om gastheerdoelen te identificeren die kunnen worden gemanipuleerd om oncolytische virustherapie te verbeteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van oncolytische virustherapie, zoals welke specifieke gastheerfactoren en cellulaire routes de replicatie van oncolytische virussen moduleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om gastheerdoelen te identificeren die kunnen worden gemanipuleerd om oncolytische virustherapie te verbeteren op een uitgebreide en onbevooroordeelde manier.
Dit protocol kan ook worden gebruikt om gastheerfactoren te identificeren die de virusreplicatie in het algemeen moduleren. Na het ontwikkelen van een high-throughput screeningstest volgens het tekstprotocol, verwijdert u een partij microtiterplaten uit de vriezer en laat ze 20 tot 30 minuten ontdooien. Vul ondertussen twee flessen met 70% ethanol, vul vervolgens twee 50mL conische buizen met PBS en één met gedistilleerd water.
Dompel de slang van de vloeistofdispenser in een fles 70% ethanol en plaats een stuk plakband rond de slang om het punt te markeren waaronder de slang als steriel kan worden beschouwd. Gebruik ongeveer 25 mL 70% ethanol om de slang te primen. Giet extra ethanol in de fles om het verloren volume te vervangen en laat de slang minimaal vijf minuten in ethanol zitten.
Na het voorbereiden van de celkweekkap, centrifugeert u de verzegeld platen en sets bij 1026 keer G op kamertemperatuur gedurende twee minuten. Verwijder vervolgens de verzegelingen van de platen. Pipetteer vervolgens de vereiste hoeveelheid transfectiemiddel in de conische buizen met de voorverwarmde transfectiemiddelverdunning.
Begin met het trypsiniseren van de cellen door het medium van elke plaat af te zuigen. Gebruik negen mL PBS om de cellen te spoelen en pipet vervolgens drie mL trypsine per plaat. Incuber de cellen gedurende ongeveer vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Gebruik vervolgens 22mL medium om de cellen te resuspenderen door 10 keer op en neer te pipetten. Combineer de celsuspensie van elke weefselkweekplaat in een steriele fles en meng de celsuspensie door de fles te keren. Pipetteer vervolgens één mL aliquots in de celsuspensie in twee afzonderlijke microfugebuizen.
Verwijder het monster uit elke microfugebuis en tel de cellen. Bereken vervolgens het volume celsuspensie dat nodig is voor de vereiste dichtheid en bereid voldoende verdunde celsuspensie om over een partij platen te verdelen. Terwijl de cellen worden voorbereid, maakt u de slang van de vloeistofdispenser leeg van ethanol.
Gebruik ongeveer 25mL PBS om de slang te primen en giet vervolgens de slang leeg. Zorg ervoor dat het deel van de slang dat in transfectiemiddel en later in de celsuspensie zal worden ondergedompeld, steriel wordt gehouden. Bepaal welke platen veilig kunnen worden gedaan met één conische buis transfectiemiddeloplossing.
Pipetteer de transfectiemiddeloplossingen 10 keer op en neer. Gebruik vervolgens de oplossing om de slang te primen voordat u 5 microliter per putje toedient. Centrifugeer de platen bij 1026 keer G op kamertemperatuur gedurende één minuut.
Incubeer vervolgens de platen op kamertemperatuur gedurende de tijd die is voorgeschreven voor het gebruikte transfectiemiddel. Tijdens de incubatie maakt u de slang van de transfectiemiddeloplossing leeg en plaatst u deze in een volle 50mL conische buis met PBS. Gebruik vervolgens ongeveer 25mL PBS om de slang te spoelen door deze te primen en vervolgens te legen.
Meng de fles met de celsuspensie, plaats de slang in de suspensie en prime de slang voldoende om te zien dat elke tip goed doseert. Doseer 30 microliter per putje van de celsuspensie over alle platen. Giet de celsuspensie uit de slang en spoel de slang met ongeveer 25mL PBS gevolgd door ongeveer 50mL gedistilleerd water.
Laat de platen 45 tot 60 minuten bij kamertemperatuur staan vanaf het moment van celzaaien. Incubeer vervolgens de platen in een ongestoord incubatoir gedurende de gewenste lengte van genuitschakeling. Om tijd te besparen, pipetteer op de dag voordat de cellen worden geïnfecteerd de precieze hoeveelheid medium die nodig is om elke batch platen te infecteren, inclusief medium voor niet-geïnfecteerde putjes, in steriele flessen.
Verwarm het medium op 37 graden Celsius en vul vervolgens twee flessen met 70% ethanol, twee 50mL conische buizen met PBS en één met gedistilleerd water. Steriliseer de slang met 70% ethanol zoals eerder is aangetoond. Terwijl de slang in de ethanol staat, eerst het virus vortexen en vervolgens het precieze volume virus dat nodig is pipetteren in de fles met infectiemedium.
Spoel vervolgens de slang door deze te primen met 25mL PBS en vervolgens leeg te maken. Nadat de platen uit de incubatoir zijn verwijderd, plaatst u ze in de weefselkweekkap. Gebruik medium om de slang te primen en doseer vervolgens 40 microliter medium in de niet-geïnfecteerde controleputjes.
Giet de slang leeg van medium en spoel deze met 25mL PBS. Nadat het virus is gemengd, plaatst u de slang in de fles met het virus en doseert u 40 microliter virus over de platen. Centrifugeer de platen bij 400 keer G op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Incubeer de platen gedurende de eerder bepaalde lengte van de tijd. De dag voor het fixeren, bereidt u een fles fixeer- en standoplossing voor met vier procent formaldehyde en PBS voor elke batch platen, maar laat de Hoechst-kleuring weg. Bewaar de oplossing in de brandbare kast uit de buurt van licht.
De volgende dag spoelt u de slang met 70% ethanol en PBS zoals eerder is aangetoond. Doseer 30 microliter van de oplossing over alle platen en plaats de platen vervolgens 30 minuten in de incubatoir. Na incubatie, brengt u de verzegelingen aan op de platen en bewaart u ze op vier graden Celsius beschermd tegen licht.
Voer beeldvorming en analyse uit volgens het tekstprotocol. Hier getoond zijn 786 O-cellen die zijn gekleurd met Hoechst 33342 na een 72-urige incubatie met alleen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor high-throughput RNAi-screening om gastheerdoelen te identificeren die oncolytische virustherapie kunnen verbeteren, in het bijzonder voor rhabdovirus en vacciniavirus. Het is aanpasbaar voor andere oncolytische virusplatforms en voor het ontdekken van gastheergenen die de virusreplicatie beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Oncolytische virustherapie
- RNA-interferentie (RNAi)
- Interacties tussen gastheer en pathogeen
Achtergrond
- Oncolytische virussen zijn ontworpen om selectief kankercellen te infecteren en te doden.
- Inzicht in gastheerfactoren kan de effectiviteit van therapieën met oncolytische virussen verbeteren.
- High-throughput screening maakt een uitgebreide identificatie van relevante gastheerdoelen mogelijk.
- Dit protocol kan worden aangepast voor diverse virale platforms.
Doel van de studie
- Om gastheerdoelen te identificeren die kunnen worden gemanipuleerd om oncolytische virustherapie te verbeteren.
- Om gastheerfactoren en cellulaire pathways te onderzoeken die virusreplicatie moduleren.
- Om een uitgebreide en onbevooroordeelde methode te bieden voor de identificatie van doelen.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een high-throughput screening-assay.
- Voorbereiding van microtiterplaten voor screening.
- Gebruik van RNAi voor knockdown van gastheergenen.
- Analyse van virale replicatie als reactie op manipulatie van doelen in de gastheer.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van specifieke gastheerschapsfactoren die oncolytische virustherapie verbeteren.
- Inzichten in cellulaire signaalpaden die de virusreplicatie beïnvloeden.
- Demonstratie van de effectiviteit van high-throughput RNAi-screening.
- Potentieel voor bredere toepassingen in het begrijpen van virus-gastheerinteracties.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol instrument voor het verbeteren van oncolytische virustherapieën.
- Het identificeren van gastheerdoelen kan leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse onderzoekstoepassingen in de virologie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Genoombrede RNAi-screening maakt de onbevooroordeelde identificatie mogelijk van gastheerfactoren die de replicatie van oncolytische virussen moduleren, wat een systematische aanpak biedt om risico's bij de selectie van therapeutische targets in de vroege ontdekkingsfase te beperken. Door het in kaart brengen van gastheer-pathogeeninteracties die de virale infectiviteit, burst size en cytotoxiciteit beïnvloeden, ondersteunt deze methode het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en portfolio-prioritering. Deze mogelijkheid vergroot het mechanistische begrip en informeert go/no-go-beslissingen in ontwikkelingspipelines voor oncolytische virussen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door gastheergenen te identificeren die de virusreplicatie in kankercellen moduleren.
- Operationele waarde: Biedt een uitgebreid, onbevooroordeeld overzicht van gastheerfactoren over het gehele genoom om de betrokkenheid van signaalpaden te verduidelijken.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de biologische risicoreductie van targets door de modulatie van gastheerfactoren te koppelen aan meetbare veranderingen in de oncolytische virale activiteit.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Vestigt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar assaysysteem voor het kwantificeren van virusreplicatiefenotypen, zoals infectiviteit en het cytopathisch effect.
- Operationele waarde: Genereert kwantitatieve high-content data die geschikt zijn voor hit-selectie en downstream validatieworkflows.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de schaalbaarheid van de assay en de toepasbaarheid over verschillende platforms op andere oncolytische virussen naast Maraba en vaccinia.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Identificeert gastheerdoelen met ziekterelevantie in tumorcellijnen, wat de translationele afstemming van biomarkers ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt secundaire en tertiaire validatie mogelijk met behulp van orthogonale siRNA-sequenties om de doelgerichtheid te bevestigen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt risicogecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door hits in meerdere kankercellijnen te bevestigen met robuuste statistische methoden (MAD).
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van doelwitidentificatie tot preklinische validatie, waardoor hypothesegestuurde analyse van gastheerpaden die de effectiviteit van oncolytische virussen beïnvloeden, mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking door de knockdown van gastheergenen te koppelen aan veranderingen in de dynamiek van virale replicatie.
- Screening: Levert assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten (bijv. overlevingsplots, infectiemetrieken) die een betrouwbare evaluatie van verbindingen of genetische perturbaties mogelijk maken.
- Analytics: Genereert statistische resultaten (bijv. MAD-gebaseerde hit-calling) die vergelijking tussen condities en prioritering van kandidaten mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ontdekkingsresultaten met preklinische continuïteit door hits te valideren in meerdere tumormodellen en deze te koppelen aan bekende paden (UPR, ERAD).
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare screeningscapaciteit die toepasbaar is op diverse oncolytische virusplatforms en algemene studies naar virus-gastheerinteracties.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie, vermindering van mechanische ambiguïteit in gastheer-pathogeeninteracties.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van high-throughput RNAi-screeningworkflows.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door vroege target-risicoreductie.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van gevalideerde gastheer-targets in meerdere kankermodellen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in celkweek, transfectie en high-throughput vloeistofbehandeling.
- Afhankelijk van toegang tot RNAi-bibliotheken, transfectiereagentia en imagingplatformen voor het uitlezen van virale replicatie.
- Vereist cross-team standaardisatie van assaycondities, reagentbehandeling en protocollen voor data-analyse.
- Omvat overwegingen voor adaptatie over verschillende tumorcellijnen en virusstammen om de relevantie van de assay te waarborgen.
- Praktische beperkingen omvatten reagenttoxiciteit, off-target effecten en de noodzaak van orthogonale validatie om de specificiteit van hits te bevestigen.
