Name: Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer een high-throughput RNAi-screeningmethode om gastheerfactoren te identificeren die oncolytische virustherapie versterken. Dit protocol helpt bij het ontdekken van cellulaire doelen voor verbeterde kankerbehandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door subsidies van het Ontario Instituut voor kankeronderzoek, de Stichting van Canada voor de innovatie, de Ottawa regionale Cancer Foundation en de Terry Fox Research Institute. K.J.A. werd gesteund door een Vanier Canada Graduate beurs, een Canadees Instituut voor gezondheid onderzoek-Master Award, en een Graduate beurs van Ontario.

<ol><li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+have+RNAi+screens+taught+us+about+viral-host+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?</a> Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).</li>
<li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+genomic+screening%3A+elucidating+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).</li>
<li>Houzet, L., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+using+RNA+interference+to+study+host+factors+in+viral+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis.</a> Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).</li>
<li>Friedel, C. C., Haas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomes+and+global+models+of+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells.</a> Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).</li>
<li>Gao, S., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+RNA+interference+high-throughput+screening+technology+in+cancer+biology+and+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology.</a> Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).</li>
<li>Kilcher, S., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+approaches+to+study+virus+entry+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Next generation approaches to study virus entry and infection.</a> Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).</li>
<li>Ramage, H., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+From+unbiased+genetic+screens+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function.</a> Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).</li>
<li>Mercer, J., Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+reveals+proteasome-+and+Cullin3-dependent+stages+in+vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection.</a> Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).</li>
<li>Sivan, G., Martin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+role+for+nuclear+pore+proteins+in+poxvirus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).</li>
<li>Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loss+of+function+analysis+of+host+factors+Influencing+vaccinia+virus+replication+by+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98431(2014).</li>
<li>Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNA+interference+screen+for+human+cell+factors+affecting+myxoma+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication.</a> J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).</li>
<li>Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+lentiviral+shRNA+screen+identifies+serine%2Farginine-rich+splicing+factor+2+as+a+determinant+of+oncolytic+virus+activity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).</li>
<li>Panda, D., Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+reveals+requirement+for+host+cell+secretory+pathway+in+infection+by+diverse+families+of+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).</li>
<li>Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+small+interfering+RNA+screen+identifies+host+factors+required+for+vesicular+stomatitis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection.</a> J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).</li>
<li>Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-tumor+interactome+screen+reveals+ER+stress+response+can+reprogram+resistant+cancers+for+oncolytic+virus-triggered+Caspase-2+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death.</a> Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).</li>
<li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+to+arms%3A+Using+RNAi+screening+to+improve+oncolytic+viral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).</li>
<li>Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+screening+to+enhance+oncolytic+virotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy.</a> Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).</li>
<li>Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+to+enhance+oncolytic+virus+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncolytic+Virother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy.</a> Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER%3A+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li>
<li>Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2017%3A+quality-controlled+protein-protein+association+networks%2C+made+broadly+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).</li>
<li>Luc, P. -V., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINdb%3A+a+database+of+nuclear+protein+complexes+from+human+and+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast.</a> Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).</li>
<li>Chung, N., Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+absolute+deviation+to+improve+hit+selection+for+genome-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+Score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+Score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
<li>Zhang, X. D., Lacson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+SSMD-based+false+discovery+and+false+nondiscovery+rates+in+genome-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).</li>
<li>Amberkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNA+interference+screens+integrative+analysis%3A+towards+a+comprehensive+understanding+of+the+virus-host+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Virol%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay.</a> World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).</li>
<li>Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+reproducibility+between+genome-scale+siRNA-based+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens.</a> J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).</li>
<li>Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+specific+edge+effect+correction+method+for+RNA+interference+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings.</a> Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).</li>
<li>Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+off-target+effects+can+be+reduced+at+concentrations+that+match+their+individual+potency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).</li>
<li>Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+detection+and+elimination+of+systematic+error+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening.</a> Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).</li>
<li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies%3A+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).</li>
<li>Savidis, G., McDougall, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Zika+virus+and+dengue+virus+dependency+factors+using+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics.</a> Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).</li>
<li>Ma, H., Dang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Based+screen+identifies+genes+essential+for+West-Nile-virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death.</a> Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).</li>
<li>Zhang, R., Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+screen+defines+a+signal+peptide+processing+pathway+required+by+flaviviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses.</a> Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).</li>
<li>Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te identificeren host doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie. Dit is met succes getest met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, maar, zoals opgemerkt, het kan worden aangepast voor gebruik met andere oncolytische virussen of andere virussen in het algemeen ter identificatie van de host-genen die virus replicatie moduleren. Het protocol van de screening is ook ontworp...

High-throughput genoom-brede RNAi screening is gebleken een instrument van onschatbare waarde voor het openbaren van biologische inzichten in diverse gebieden van studie, met inbegrip van virus biologie. In de afgelopen tien jaar of zo, talrijke groepen hebben zich ertoe verbonden cel-gebaseerde grootschalige RNAi screening om te identificeren uitgebreid host genen die virus replicatie (herzien in1,2,,3,4 moduleren , 5 , 6 , 7). interessant, een groot aantal van deze schermen zijn uitgevoerd in kankercellen en diverse met virussen die zijn huidige oncolytische virus kandidaten waaronder vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12,13,,14van de virus van de vesiculaire stomatitis en Maraba virus15. Terwijl de focus van de meerderheid van deze studies was op het identificeren van gastheer factoren die invloed hebben op bepaalde aspecten van de replicatie van het virus en niet op het identificeren van biotherapeutic doelstellingen ter verbetering van de oncolytische virus therapie, kan waardevolle gegevens worden gedolven uit deze data sets in dit verband. Het is duidelijk dat het krachtige potentieel te identificeren host doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie heeft niet ten volle zijn benut.
Een overvloed aan oncolytische virus platformen worden momenteel getest in preklinische en klinische studies met inbegrip van herpes simplex virus, reovirus en vaccinia virus, die aantoonbaar succes in laat-stadium klinische proeven hebben gehad. Voor de meerderheid van deze platforms, hebben inspanningen zijn gericht op het veranderen van het genoom van het virus ter verbetering van de therapie. Bijvoorbeeld het vergroten van tumor specificiteit, zijn specifieke virus genen verwijderd of gemuteerd om aanzienlijk beperken van virale replicatie in normale cellen, maar niet in tumorcellen. In sommige gevallen transgenen bijgekomen zoals GM-CSF (granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor) te versterken het immuunrespons of NIS (natrium jodide symporter) in vivo imaging en cellulaire radioiodide opname inschakelen voor therapeutische doeleinden. Echter is er zeer weinig werk, gericht op het manipuleren van genen van de gastheer/tumor en het verkennen van de impact van gastheer/tumor genen op oncolytische virus replicatie. Met de komst van high-throughput screening technologie, is het nu mogelijk om te sonderen virus-gastheer interacties op de schaal van een genoom en te ontcijferen van mogelijkheden voor het manipuleren van het genoom van de gastheer om oncolytische virus therapie (herzien in16, 17,,18).
We gemeld de eerste studie demonstrerende proof-of-concept voor het gebruik van high-throughput genetische screening ter identificatie van de host-doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie. Om te ontdekken van host-genen die moduleren Maraba virus oncolysis, een oncolytische rhabdovirus momenteel getest in fase I en II proeven, voerden we genoom-brede RNAi schermen over drie verschillende tumor cellijnen in tweevoud met een siRNA (korte inmenging van RNA) bibliotheek gericht op 18,120 genen15. Traject analyse van hits geïdentificeerd in de schermen geopenbaard verrijking van leden van het ER (endoplasmatisch reticulum) stress reactie trajecten. Wij hebben 10 hits binnen deze trajecten voor secundaire validatie met behulp van siRNA met verschillende targeting sequenties van die van het primaire scherm hebt geselecteerd. Als onderdeel van de tertiaire validatie, voerden we een redding experiment met IRE1α (inositol-vereisen enzym 1 alpha) om te bevestigen dat de hit op doel was. In vitro en in vivo tests met een klein molecuul inhibitor van IRE1α resulteerde in sterk verbeterde oncolytische werkzaamheid.
Workenhe et al. 12 leidee een genoom-brede RNAi scherm met behulp van een gebundelde lentivirale shRNA (korte haarspeld RNA) bibliotheek gericht op 16,056 genen te identificeren gastheer factoren beperken het menselijke herpes simplexvirus type 1 (HSV-1) mutant KM100-gemedieerde oncolysis van borst kankercellen. In het primaire scherm ze geïdentificeerd 343 genen de knockdown van die leiden tot verbeterde cytotoxiciteit van KM100-geïnfecteerde cellen over mock-geïnfecteerde cellen; ze geselecteerd 24 van deze genen voor secundaire validatie. Uit de 24 genen, 8 genen werden bevestigd in de secundaire scherm met één van hen wordt SRSF2 (serine/arginine-rijke splicing factor 2) die werd vervolgens bevestigd met behulp van een genetische redding experiment tijdens de tertiaire validatie. De groep ging naar het identificeren van een DNA topoisomerase remmer chemotherapeutische dat verminderd de fosforylatie van SRSF2 en is gebleken dat de behandeling van de combinatie van HSV-1 KM100 met dit remmer leidde tot uitgebreide voortbestaan van TUBO tumor-dragende muizen.
In de bovengenoemde studies volgde een soortgelijke workflow. Elk begon met een primaire genoom-brede RNAi scherm gevolgd door een secundaire scherm op een select aantal hits geïdentificeerd in het primaire scherm. Dit werd gevolgd door tertiaire validatieonderzoek, waaronder om te bevestigen dat de hit op de doelsoort was redden door het uitvoeren van genetische experimenten in vitro met uiteindelijke validatie uitgevoerd door het manipuleren van de target gene product in vivo. In dit artikel geven we eerst een algemeen protocol voor de ontwikkeling en validatie van een high-throughput siRNA-screening test, waarbij sprake is van een vaststelling van de voorwaarden van de optimale transfectie, hoeveelheid virus en de duur van de infectie. Wij bieden ook een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een primaire, een high-throughput siRNA scherm evenals een algemene beschrijving van de methode voor het uitvoeren van validatie van de secundaire scherm en tertiaire validatie.

<table><tbody><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA bibliotheek</td><td>GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-well plaat</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 384-well plaat</td><td>Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars Negatieve Controle siRNA</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome Niet-targeterend siRNA Pool #2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HOGE Glucose</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Runderserum</td><td>Sigma</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES oplossing (1M)</td><td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine 100X oplossing</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Gemodificeerd</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>Oligofectamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin natriumzout</td><td>Sigma</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (37% gewicht)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>500 ml flessen</td><td>Corning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>Zelfklevende Afsluitfolie Voor Microplates</td><td>Excel Scientific</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>Schilbare Het Zegelfolie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-625</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroFlo Select (vloeistofdispenser)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120621</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT plaatlezer</td><td>Biotek</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opera Beeldvorming en Analyse Instrument</td><td>PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td>KiNEDx Robotarm</td><td>Peak Analysis and Automation (voorheen Peak Robotics)</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Cytomat 24C Series Geautomatiseerde Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS Geautomatiseerde Werkplek</td><td>PerkinElmer</td><td>AJI4M01</td><td></td></tr><tr><td>Plaatcarrousel</td><td>Peak Analysis and Automation (voorheen Peak Robotics)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alps 3000 plaatsealer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

genoom-brede rnai screening factoren te identificeren host die moduleren van oncolytische virus therapie

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

High-throughput genoom-brede RNAi (RNA-interferentie) screening technologie is wijd verbeid gebruikt om gastheer factoren die van invloed zijn virus replicatie te ontdekken. Hier presenteren we de toepassing van deze technologie op blootleggen host doelen die specifiek het moduleren van de replicatie van Maraba virus, een oncolytische rhabdovirus en vacciniavirus met als doel verbetering van de therapie. Terwijl het protocol is getest voor gebruik met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, deze aanpak geldt voor andere oncolytische virussen en kan ook worden gebruikt voor de identificatie van de host-doelen die moduleren virus replicatie in zoogdiercellen in algemene. Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een assay voor high-throughput RNAi screening in zoogdiercellen, belangrijke overwegingen en voorbereiding maatregelen belangrijk zijn voor het uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm, en een stapsgewijze handleiding voor uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm; Bovendien is het in grote lijnen schetst voor de methoden voor de uitvoering van de secundaire scherm validatie en tertiaire validatieonderzoek. Het voordeel van high-throughput RNAi screening is dat het maakt het mogelijk een catalogus, in een uitgebreide en onbevooroordeelde manier, gastheer factoren die enig aspect van virus replicatie waarvoor een een in vitro assay zoals infectiviteit ontwikkelen kan, moduleren barsten grootte, en cytotoxiciteit. Het heeft de bevoegdheid om te ontdekken van biotherapeutic doelstellingen onvoorziene op basis van de huidige kennis.

Een overzicht van de workflow voor het identificeren van host doelstellingen ter verbetering van de oncolytische virus therapie wordt gepresenteerd in Figuur 1.
Zoals aangegeven in Figuur 1, is de kritieke eerste stap om het uitvoeren van een high-throughput RNAi scherm assay ontwikkeling. Figuur 2A biedt een monster plaat indeling voor de ...

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Het algemene doel van dit protocol is om gastheerdoelen te identificeren die kunnen worden gemanipuleerd om oncolytische virustherapie te verbeteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van oncolytische virustherapie, zoals welke specifieke gastheerfactoren en cellulaire routes de replicatie van oncolytische virussen moduleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om gastheerdoelen te identificeren die kunnen worden gemanipuleerd om oncolytische virustherapie te verbeteren op een uitgebreide en onbevooroordeelde manier.Dit protocol kan ook worden gebruikt om gastheerfactoren te identificeren die de virusreplicatie in het algemeen moduleren. Na het ontwikkelen van een high-throughput screeningstest volgens het tekstprotocol, verwijdert u een partij microtiterplaten uit de vriezer en laat ze 20 tot 30 minuten ontdooien. Vul ondertussen twee flessen met 70% ethanol, vul vervolgens twee 50mL conische buizen met PBS en één met gedistilleerd water.Dompel de slang van de vloeistofdispenser in een fles 70% ethanol en plaats een stuk plakband rond de slang om het punt te markeren waaronder de slang als steriel kan worde

genome-wide-rnai-screening-to-identify-host-factors-that-modulate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Nieuwe gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie kan worden geïdentificeerd door middel van cel-gebaseerde genoom-brede verlies van functie RNAi screening.

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

Hier gebruiken we een menselijke LentiPlex samengevoegde bibliotheek en traditionele sequencing methoden om gen-doelstellingen het bevorderen van overleving van de cel te identificeren. Laten we zien hoe op te zetten en deconvolute een LentiPlex scherm en valideren van de resultaten.

MISSIE LentiPlex Gepoolde shRNA Library Screening in zoogdiercellen

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

We presenteren een protocol om aan te tonen van een roman somatic gene transfersysteem met behulp van RIP-Tag; RIP-BTW muismodel om te bestuderen van de functie van genen in metastase. De aviaire retrovirussen zijn intracardiacally om ervoor te zorgen genenoverdracht in pre-maligne, noninvasive laesies van de cellen van de alvleesklier β in volwassen muizen geleverd.

Identificatie en karakterisering van metastatische factoren door genenoverdracht in de roman RIP-Tag; RIP-BTW lymfkliertest Model

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA's kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.

Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Insertionele mutagenese is een essentieel hulpmiddel in forward genetics voor het identificeren van functionele genomische elementen. Hier beschrijven we het op insertie gebaseerde scherm voor functionele elementen en transcripten (InSET), een methode voor het detecteren van lentivirus-integratieplaatsen binnen een op lentivirus gebaseerde insertiemutagenese-celbibliotheek.

Identificatie van functioneel relevante integratieplaatsen van lentivirussen in een cellenbibliotheek met insertionele mutagenese

Leer een high-throughput RNAi-screeningmethode om gastheerfactoren te identificeren die oncolytische virustherapie versterken. Dit protocol helpt bij het ontdekken van cellulaire doelen voor verbeterde kankerbehandeling.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

Meer video's verkennen