Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Het algemene doel van deze aggregatietest is om de binding van de Notch-receptor met trans-liganden en de remming ervan door cis-liganden te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een belangrijke vraag: Hoe zullen genetische of farmacologische factoren de binding van de Notch-receptor met zijn ligand beïnvloeden en de signalering wijzigen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de trans- en cis-binding van de Notch-receptor met zijn ligand te evalueren.

Interessant is dat dit gebeurt zonder de overlappende effecten van endogene liganden. Begin de beoordeling door signaalontvangende cellen te centrifugeren en ze opnieuw te suspenderen in Schneider's Medium. Tel de cellen handmatig met behulp van een hemacytometer.

Plaats vijf maal 10 tot de vijfde S2 en stabiele S2-Notch cellen in elke put van een zes-putsplaat, in één milliliter per put van Schneider's Medium. Voeg vervolgens 7,5 microgram dubbelstrengs RNA toe aan elke put en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius. Voeg 0,7 millimolair kopersulfaat toe om de expressie van Notch te induceren en incubeer de cellen gedurende drie dagen bij 25 graden Celsius.

Na incubatie, tel de signaalsturen cellen handmatig met behulp van een hemacytometer. Plaats vervolgens vijf maal 10 tot de zesde stabiele cellen in elke put van een zes-putsplaat, in één milliliter per put van aangevuld Schneider's Medium. Voeg vervolgens 0,7 millimolair kopersulfaat toe om de expressie van liganden te induceren en incubeer de cellen gedurende drie uur bij 25 graden Celsius.

Verzamel de dubbelstrengs RNA-behandelde S2-controle en S2-Notch cellen door voorzichtig te pipetteren. Plaats vervolgens 2,5 maal 10 tot de vijfde cellen per put in een 24-putsplaat. Voeg vijf maal 10 tot de vijfde stabiele S2-Delta of S2-Serrate Tomato cellen toe aan een totaal volume van 200 microliter aangevuld Schneider's Medium.

Plaats de plaat op een orbitale shaker bij 150 rpm. Na één minuut, meng de inhoud van elke put en neem 20 microliter om het aantal aggregaten te tellen. Neem tegelijkertijd een representatief beeld onder een omgekeerde compoundmicroscoop met 10x vergroting.

Om de cellen te visualiseren, plaats de camera op de microscoop en maak verbinding met de software om het beeld te verkrijgen. Tel de aggregaten handmatig met behulp van een hemacytometer. Plaats de plaat op de shaker.

Herhaal de beeldverwerving en telling na vijf en vijftien minuten van aggregatie. Voer kwantificering van trans-binding uit door het aantal aggregaten per milliliter te berekenen tussen S2 cellen en S2-Delta of S2-Serrate Tomato cellen als achtergrondcontrole, en het aantal aggregaten per milliliter tussen S2-Notch en S2-Delta of S2-Serrate Tomato cellen. Bereid de signaalontvangende cellen voor door vijf maal 10 tot de vijfde S2 cellen in elke put van een zes-putsplaat te plaatsen, in één milliliter per put van aangevuld Schneider's Medium.

Voeg 7,5 microgram dubbelstrengs RNA toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius. Na incubatie, cotransfecteer de dubbelstrengs RNA-behandelde cellen voor een totale DNA-concentratie van twee microgram per put met behulp van een commercieel transfectiereagens. Incubeer de tijdelijk getransfecteerde S2 cellen gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius.

De volgende dag, voeg 0,7 millimolair kopersulfaat toe om de expressie van Notch en de liganden te induceren en incubeer gedurende drie dagen bij 25 graden Celsius. Bereid signaalsturen cellen zoals beschreven in de vorige sectie. En voer tenslotte aggregatie uit tussen signaalsturen en signaalontvangende cellen, zoals eerder beschreven.

Een scherpe toename werd waargenomen in het aantal aggregaten tussen één en vijf minuten. Vervolgens bleef het aantal aggregaten toenemen tot 30 minuten, maar in een langzamere snelheid. Beelden die de aggregatie op drie tijdstippen tonen, demonstreren dat de met EGFP dubbelstrengs RNA behandelde S2-Notch cellen aggregaten vormden met S2-Delta cellen, die in aantal toenemen met de tijd.

In tegenstelling daarmee, vormden shams en dubbelstrengs RNA-behandelde S2-Notch cellen sneller aggregaten, en de aggregaten waren groter en groter in aantal. Dit geeft aan dat het verlagen van shams-niveaus de trans-binding van Notch met Delta versterkte. Het transfecteren van gelijke hoeveelheden Notch en Delta expressieconstructen in S2 cellen vermindert drastisch het aantal aggregaten dat tussen deze cellen en S2-Delta cellen wordt gevormd.

Bovendien resulteert het verminderen van de hoeveelheid cis-Delta in een toename van het aantal aggregaten. Dit geeft aan dat in het bereik van Notch/cis-Delta verhoudingen gebruikt in deze tests, cis-Delta de binding tussen Notch en trans-Delta op dosisafhankelijke wijze kan remmen. Kwantificering van relatieve aggregatie toonde een vergelijkbare remming van aggregatie aan na behandeling met EGFP en shams dubbelstrengs RNA.

Zodra alle reagentia zijn voorbereid, is deze test eenvoudig en kan in een paar uur worden uitgevoerd.