Name: Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Leer celaggregatie-assays om de binding van Drosophila Notch-receptor met trans-liganden en remming door cis-liganden te evalueren. Deze methode helpt bij het bestuderen van genetische en farmacologische effecten op Notch-signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen steun van de NIH/NIGMS (R01GM084135 tot HJN) en Mizutani Stichting voor Glycoscience (grant #110071 naar HJN), en zijn dankbaar aan Tom V. Lee voor discussies en suggesties op het testen, en Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine en de Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) voor plasmiden en cellijnen.

1. bereiding van dubbele Stranded RNA (dsRNA) Shams Knockdown
<ol>
	<li>PCR versterking van de producten
	<ol>
		<li>Wild-type geel wit (y w) genomic DNA en pAc5.1-EGFP gebruiken als sjabloon en de volgende primerparen aan het versterken van de DNA-fragmenten gebruikt in dsRNA synthese. Gebruik het volgende PCR thermische profiel: denaturatie (95 ° C, 30 s), onthardende (58 ° C, 30 s) en extensie (72 ° C, 1 min). 
		Verbeterde groen Fluorescent proteïne (EGFP) dsRNA inleidingen (5' - 3')- Voorwaartse primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG Omgekeerde primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG 
		Shams dsRNA inleidingen (5' - 3')- Voorwaartse primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT Omgekeerde primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA Opmerking: EGFP dsRNA wordt gebruikt als negatieve controle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gel-zuiveren de polymerase-kettingreactie (PCR)-producten met behulp van een commerciële gel zuivering kit volgens protocol van de fabrikant.</li>
	<li>In vitro transcriptie met behulp van een commercieel product staat voor het transcriberen van de promotor van een T7 volgens protocol van de fabrikant uit te voeren.</li>
	<li>Zuiveren van de dsRNA met behulp van een RNA zuivering kit volgens protocol van de fabrikant en opslaan bij-80 ° C.</li>
	<li>Het beoordelen van de efficiëntie van shams knockdown met behulp van de volgende stappen (1.5.1-1.5.5).
	<ol>
		<li>Graaf de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer en plaat 5 x 105 S2 cellen in elk putje van een 6 goed plaat in 1 mL/goed van Schneiders medium aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS) en 100 U/mL penicilline-streptomycine.</li>
		<li>7.5 µg EGFP- of shams dsRNA toevoegen aan elk putje en Incubeer bij 25 ° C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Oogst de controle (EGFP dsRNA-behandeld) en shams dsRNA-behandelde S2 cellen door zachte pipetteren gevolgd door pillering neer door centrifugeren op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 25 ° C en proces voor RNA isolatie met behulp van een RNA extractie kit volgens protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Het gebruik van een spectrofotometer en proces 100 RNA te kwantificeren ng van RNA voor 1-stap qRT-PCR met commerciële qPCR reagentia en primer/sondes en het volgende PCR thermische profiel: denaturatie (95 ° C, 15 s) en Annealing/uitbreiding (60 ° C, 1 min). Opmerking: Raadpleeg de Tabel van materialen voor informatie over de primer/sonde sets en het instrument voor shams en controle qRT-PCR experimenten in deze studies.</li>
		<li>Bereken de relatieve shams mRNA niveaus met behulp van de 2-ΔΔCT methode16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. beoordeling van de Binding tussen de inkeping Receptor en Trans-liganden
<ol>
	<li>Signaal-ontvangende cellen (S2 cellen uiten de inkeping-receptor) voor te bereiden.
	<ol>
		<li>Handmatig met behulp van een hemocytometer cellen tellen en plaat 5 x 105 S2 en stabiele S2-Notch cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in 1 mL/goed van Schneiders medium aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine. Opmerking: Voor S2-Notch cellen, die zijn beschikbaar van Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), voeg 200 nM methotrexaat in de media. Ter voorbereiding van een stamoplossing van 0.5 mM methotrexaat, eerst voorbereiden een 20 mM methotrexaat oplossing in 250 µL van 1 M NaOH. Daarna Verdun deze oplossing tot 0,5 mM in 1 M fosfaat buffer zoutoplossing en winkel bij-20 ° C. In S2-Notch cellen is uitdrukking van de inkeping proteïne onder de controle van de Drosophila metallothionein promotor in de Bet -vector.</li>
		<li>7.5 µg dsRNA toevoegen aan elk putje en Incubeer bij 25 ° C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Toevoegen van 0.7 mM CuSO4 te induceren van de expressie van Inkeping en Incubeer bij 25 ° C gedurende 3 dagen. Opmerking: CuSO4 wordt gebruikt voor het opwekken van expressie van eiwitten gecontroleerd door de promotor van de metallothionein.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Signaal-verzenden cellen (S2 cel Delta of Serrate liganden uitdrukken) voor te bereiden.
	<ol>
		<li>Graaf de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer en plaat ~ 5 x 106 stabiele S2-Delta of S2-SerrateTom cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in 1 mL/putje van Schneiders medium aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine. Opmerking: Voeg 200 nM methotrexaat voor S2-Delta cellen en 100 µg/mL hygromycin voor S2-SerrateTom cellen in de media. Uitdrukking van Delta en SerrateTom— een tomaat-tagged, functionele versie van Serrate12— is onder Drosophila metallothionein promotor in de Bet -vector.</li>
		<li>Toevoegen van 0.7 mM CuSO4 te induceren van de expressie van liganden en Incubeer bij 25 ° C gedurende 3 uur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Samenvoeging tussen de cellen van het verzenden van het signaal en signaal-ontvangst uit te voeren.
	<ol>
		<li>Oogst van de S2 dsRNA-behandeld (control) en S2-Notch cellen door zachte pipetteren en plaat 2.5 x 10,5 cellen/well in een 24-well plaat na handmatige tellen door hemocytometer.</li>
		<li>5 x 105 stabiele S2-Delta of S2-SerrateTom cellen toevoegen in een totaal volume van 200 µL van Schneiders medium (aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine). Opmerking: Alle S2 cellen behandeling (met inbegrip van de behandeling van de beplating, inductie en dsRNA) onder een kast bioveiligheid moest worden verricht.</li>
		<li>Plaats de plaat op een roteerschudapparaat bij 150 t/min (942.48 rad/min).</li>
		<li>Na 1 minuut, meng de inhoud van elk putje en neem 20 µL uit voor het tellen van het aantal aggregaten.<ol>
			<li>Tegelijkertijd nemen een representatieve afbeelding onder omgekeerde samengestelde microscoop met 10 x vergroting (PLL 10/0.25 doelstelling).</li>
			<li>Handmatig tellen de aggregaten (&#62; 6 cellen) met behulp van een hemocytometer.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Plaats de plaat op een shaker.</li>
		<li>Herhaal de Beeldacquisitie en tellen na 5 min en 15 min van aggregatie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uitvoeren van kwantificering van trans-bindend.
	<ol>
		<li>Bereken het aantal aggregaten per mL tussen cellen van de S2 en S2-Delta of S2-SerrateTom cellen als een achtergrond controle.</li>
		<li>Bereken het aantal aggregaten per mL tussen S2-Inkeping en S2-Delta of S2-SerrateTom cellen (omvang van trans-bindende).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.Evaluatie van de remming van de Binding tussen Inkeping en Trans-liganden door Cis-liganden
<ol>
	<li>Signaal-ontvangende cellen te bereiden.
	<ol>
		<li>Plaat 5 x 105 S2 cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in 1 mL/goed van Schneiders medium aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine.</li>
		<li>7.5 µg dsRNA toevoegen aan elk putje en Incubeer bij 25 ° C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Mede de cellen dsRNA-behandeld met pBluescript en Bet-Notch11 (DGRC) alleen of met Bet-inkeping en Bet-Delta11 transfect (DGRC) of pMT-Serrate17 in totaal De concentratie van het DNA van 2 µg per putje met behulp van een commerciële transfectiereagens volgens protocol van de fabrikant. Opmerking: pBluescript wordt gebruikt als een besturingselement. Mede-transfected cellen zal worden genoemd S2-inkeping &#38; Deltavoorbijgaande of S2-inkeping &#38; Serratevoorbijgaande cellen hierna.</li>
		<li>Incubeer de S2 Transient-transfected cellen bij 25 ° C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Toevoegen van 0.7 mM CuSO4 te induceren van de uitdrukking van de Inkeping en de liganden en Incubeer bij 25 ° C gedurende 3 dagen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Signaal-verzenden cellen bereiden zoals beschreven in punt 2.2.</li>
	<li>Voert aggregatie tussen signaal-verzenden en signaal-ontvangen cellen zoals beschreven in punt 2.3.</li>
	<li>Kwantificeren van de remming van de trans-bindend door cis-liganden.
	<ol>
		<li>Bereken het aantal aggregaten per mL tussen cellen van de S2 en S2-Delta of S2-Serrate cellen als een achtergrond controle.</li>
		<li>Kwantificeren van de omvang van de remming door cis-liganden als volgt.<ol>
			<li>Define A als aantal aggregaten tussen S2-Notchvoorbijgaande en S2-Delta cellen.</li>
			<li>B definiëren zoals het aantal aggregaten tussen S2 cellen transfected Transient samen met inkeping en Delta (S2-inkeping &#38; Deltavoorbijgaande) en S2-Delta cellen.</li>
			<li>Berekenen van relatieve aggregatie C = (B x 100) /A</li>
			<li>Berekenen grootte van remming door cis- ligand (Delta of Serrate) als 100- C. Opmerking: als voorbeeld, als relatieve aggregatie 45%, dan cis-liganden worden beschouwd voor de remming van de trans-bindend met 55%.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li>
<li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li>
<li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li>
<li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li>
<li>Kopan, R., Ilagan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+canonical+Notch+signaling+pathway%3A+unfolding+the+activation+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li>
<li>Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+is+central+to+Delta-Notch+signalling+required+for+Drosophila+wing+vein+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis.</a> Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).</li>
<li>Lee, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547(2013).</li>
<li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723(2017).</li>
<li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-interactions+between+Delta+and+Notch+modulate+neurogenic+signalling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila.</a> Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).</li>
<li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta%2C+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li>
<li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li>
<li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li>
<li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li>
<li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li>
<li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li>
<li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate%2FJagged+and+Delta+family+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflict van belang.

Canonieke Notch signalering, hangt af van de interacties tussen de inkeping-receptor en de liganden5. Hoewel de meeste studies over de inkeping pathway overwegen voornamelijk de binding van de Inkeping en liganden in naburige cellen (trans), Inkeping en dezelfde-cel liganden werken, en deze zogenaamde GOS-interacties een remmende rol kunnen spelen in de inkeping signalering van3,4. Om te ontcijferen van de mechanismen die...

Canonieke Notch signalering is een korte afstand van cel naar cel communicatiemechanisme dat fysiek contact van naburige cellen om het faciliteren van de interactie tussen Inkeping receptoren en hun liganden1vereist. Interactie van Inkeping receptor (aanwezig op het oppervlak van signaal-ontvangende cellen) met liganden (aanwezig op het oppervlak van het verzenden van het signaal cellen) initieert Notch signalering en staat bekend als trans-activering2. Aan de andere kant, interactie tussen Inkeping en de liganden in dezelfde cel leidt tot de remming van de inkeping traject en staat bekend als de cis-inhibitie3. Het evenwicht tussen trans- en cis-interacties nodig is om de optimale ligand-afhankelijke Notch signalering van4. Drosophila heeft een inkeping receptor en twee liganden (Delta en Serrate) in tegenstelling tot zoogdieren, die vier Notch receptoren en vijf liganden hebben [1 (JAG1), JAG2, onderdrukking van gekartelde delta-achtige 1 (DLL1), DLL3 en DLL4]5. Deze eenvoud biedt, de Drosophila model het gemak om te ontleden/studie de effecten van pad modifiers over Notch-ligand interacties en vervolgens over de inkeping signalering. In bepaalde contexten tijdens dierlijke ontwikkeling (inclusief vleugel ontwikkeling in Drosophila), zowel cis- en trans-interacties zijn betrokken cell lot1,6 te bereiken goede Notch signalering . Het is belangrijk om te onderscheiden van de gevolgen van Inkeping traject modifiers in de volgende contexten voor cis- en trans-interacties van inkeping met haar liganden.
Onze fractie heeft eerder gerapporteerd dat de toevoeging van een residu van de koolhydraten genaamd xylose aan Drosophila Notch negatief Notch signalering in bepaalde contexten regelt, met inbegrip van vleugel ontwikkeling7. Verlies van shams (het enzym dat xylosylates inkeping) leidt tot een "verlies van vleugel ader" fenotype7. Meer recentelijk, gene dosering experimenten en klonen analyse werden gebruikt om te laten zien dat verlies van shams Delta-gemedieerde Notch geviseerd versterkt. Om te onderscheiden of de verbeterde Notch signalering in shams mutanten een gevolg van de verminderde cis is-inhibitie of toegenomen trans-activering, ectopische overexpressie studies van Inkeping liganden in larvale vleugel imaginaire schijven met het stuurprogramma van de dpp-GAL4 werden uitgevoerd. Deze experimenten geleverd bewijs suggereert dat Shams regelt trans-activering van Inkeping door Delta zonder Notch cis-remming door liganden8. Echter, feed-back verordeningen en effecten van endogene liganden zou compliceren de interpretatie van ectopische overexpressie studies1,6,9.
U lost dit probleem, Drosophila S2 cellen10 werden gebruikt, die voorzien in een systeem eenvoudig in vitro Notch-ligand interactie studies11,12. S2 cellen niet express endogene Notch receptor en Delta ligand11 en een laag niveau van Serrate13, dat heeft geen invloed op de inkeping-ligand aggregatie experimenten8express. Daarom kunnen S2 cellen zijn stabiel of Transient transfected door Inkeping en/of individuele liganden (Delta of Serrate) voor het genereren van cellen die uitsluitend uitdrukking geven aan de receptor inkeping of één van haar liganden, of een combinatie daarvan. Mengen van Inkeping-uiten S2 cellen met ligand-uiten S2 cellen resulteert in de vorming van heterotypic aggregaten gemedieerd door receptor-ligand bindende11,12,14. Kwantificering van de totale vorming biedt een zekere mate van trans-bindend tussen Inkeping en de liganden15 (Figuur 1). Evenzo S2 cellen kunnen mede transfected met inkeping en Delta of Serrate liganden (d.w.z. cis-liganden). CIS-liganden in deze cellen Notch-uiten S2 trekt de binding van inkeping met trans-liganden en resultaat in daalde de totale vorming8,12,14. De relatieve afname van de totale vorming veroorzaakt door cis-liganden biedt een zekere mate van de remmende werking van cis-liganden op binding tussen Inkeping en trans-liganden (Figuur 2). Dienovereenkomstig, cel aggregatie assays werden gebruikt om de onderzoeken van het effect van het verlies van xylosylation op trans- en cis-interacties tussen Inkeping en de liganden.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor cel aggregatie tests gericht op het evalueren van de binding van inkeping met trans-liganden en haar remming door cis-liganden cuvetten van Drosophila S2. Als een voorbeeld, bieden wij de gegevens die ons toegestaan om te bepalen van het effect van de inkeping xylosylation op de binding tussen Inkeping en trans-Delta8. Deze eenvoudige tests bieden een semi-kwantitatieve beoordeling van Inkeping-ligand interacties in vitro en helpen bij het bepalen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de in vivo effecten van Inkeping traject modifiers.

<table><tbody><tr><td>BioWhittaker Schneider&rsquo;s Drosophila medium, Modified</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td><td>GE Healthcare lifescience&nbsp;</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 6 well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 24 well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>VWR mini shaker</td><td>Marshell Sceintific</td><td>12520-956</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscrip T7 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision Inverted microscope</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td><td>AmScope</td><td>MU-900</td><td>Beeldverwerving met behulp van ToupView software</td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GenDepot</td><td>F0600-050</td><td></td></tr><tr><td>Methotrexate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>HY068-L6</td><td></td></tr><tr><td>Copper sulphate</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4448-02</td><td></td></tr><tr><td>S2 cells</td><td>Invitrogen</td><td>R69007</td><td></td></tr><tr><td>S2-SerrateTom cells</td><td></td><td></td><td>Gift van R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td></tr><tr><td>S2-Delta cells</td><td>DGRC</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>S2-Notch cells</td><td>DGRC</td><td>154</td><td></td></tr><tr><td>pMT-Delta vector</td><td>DGRC</td><td>1021</td><td>Gift van S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pMT-Serrate vector</td><td></td><td></td><td>Gift van Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td></tr><tr><td>pMT-Notch vector</td><td>DGRC</td><td>1022</td><td>Gift van S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pAc5.1-EGFP</td><td></td><td></td><td>Gift van Hugo Bellen</td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td><td>Applied Biosystem</td><td>1611091</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay voor CG9996 (Shams)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02144576_g1&nbsp;</td><td>met FAM-MGB kleurstof</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay voor CG7939 (RpL32)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02151827_g1</td><td>met FAM-MGB kleurstof</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR systeem</td><td>Applied Biosystem</td><td>4351405</td><td>96-well Blok module</td></tr></tbody></table>

cel aggregatie testen om te evalueren van de binding van de drosophila inkeping met trans-liganden en haar remming door cis-liganden

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Inkeping signalering is een evolutionair geconserveerde cel-cel communicatiesysteem gebruikt in grote lijnen in dierlijke ontwikkeling en volwassen onderhoud. Interactie van de inkeping receptor met liganden van naburige cellen induceert activering van de signalering pathway (trans-activering), terwijl de interactie met liganden van dezelfde cel remt signalering (cis-remming). Evenwicht tussen trans-activering en cis-inhibitie helpt optimale gehalte aan Notch signalering in sommige contexten tijdens dierlijke ontwikkeling. Vanwege de overlappende domeinen van de expressie van Inkeping en de liganden in veel celtypen en het bestaan van mechanismen voor feedback, bestudeert de effecten van een bepaalde posttranslationele wijziging op trans- versus cis-interacties van Inkeping en de liganden in vivo is moeilijk. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van Drosophila S2 cellen in cel-aggregatie testen om te beoordelen van de effecten van neerhalend een inkeping traject modifier op de binding van uitsparing aan elke ligand in trans en cis. S2 cellen stabiel of Transient transfected met een inkeping-uiten vector worden gemengd met cellen uiten van elke inkeping ligand (S2-Delta of S2-Serrate). Trans-binding tussen de receptor en de liganden resulteert in de vorming van heterotypic cel aggregaten en wordt afgemeten aan het aantal aggregaten per mL samengesteld uit &#62; 6 cellen. Om te onderzoeken het remmende effect van cis-liganden, S2 cellen mede uiting van Inkeping en elke ligand worden vermengd met S2-Delta of S2-Serrate cellen en het aantal aggregaten is gekwantificeerd zoals hierboven beschreven. De relatieve daling in het aantal aggregaten als gevolg van de aanwezigheid van cis-liganden biedt een zekere mate van cis-ligand-gemedieerde remming van de trans-bindend. Deze eenvoudige tests kunnen semi-kwantitatieve gegevens over de gevolgen van genetische of farmacologische manipulaties op de binding van uitsparing aan de liganden, en kunnen helpen bij het ontcijferen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de in vivo effecten van dergelijke manipulaties op Notch signalering.

Onze observaties in vivo gesuggereerd dat verlies van de xylosyltransferase gen shams resultaten in de winst van de inkeping signalering wijten aan Delta-gemedieerde trans toegenomen-activering van Inkeping zonder het cis-remming van Inkeping door liganden8. Om te testen dit begrip, werden in vitro cel aggregatie tests uitgevoerd. Eerst, shams expressie in S2 cellen werd neergehaald met behulp van shams...

Complexiteit van in-vivo systemen maakt het moeilijk om te onderscheiden tussen de activering en de remming van de inkeping receptor door trans- en GOS-liganden, respectievelijk. Hier presenteren we een protocol op basis van in vitro cel-aggregatie testen voor kwalitatieve en semi-kwantitatieve evaluatie van de binding van Drosophila uitsparing aan trans-liganden vs cis-liganden.

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Het algemene doel van deze aggregatietest is om de binding van de Notch-receptor met trans-liganden en de remming ervan door cis-liganden te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een belangrijke vraag: Hoe zullen genetische of farmacologische factoren de binding van de Notch-receptor met zijn ligand beïnvloeden en de signalering wijzigen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de trans- en cis-binding van de Notch-receptor met zijn ligand te evalueren.Interessant is dat dit gebeurt zonder de overlappende effecten van endogene liganden. Begin de beoordeling door signaalontvangende cellen te centrifugeren en ze opnieuw te suspenderen in Schneider's Medium. Tel de cellen handmatig met behulp van een hemacytometer.Plaats vijf maal 10 tot de vijfde S2 en stabiele S2-Notch cellen in elke put van een zes-putsplaat, in één milliliter per put van Schneider's Medium. Voeg vervolgens 7,5 microgram dubbelstrengs RNA toe aan elke put en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 25 graden Celsius. Voeg 0,7 millimolair kopersulfaat toe om de expressie van Notch te induceren en incubeer de cellen gedurende drie dagen bij 25 graden Celsius.Na

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In this video, we demonstrate the technique to measure transcellular interactions between synaptic cell adhesion molecules through the HEK cell aggregation assay. In this assay, an equal number of HEK cells expressing a desired presynaptic cell adhesion molecule and a fluorescent protein are mixed with HEK cells expressing a post-synaptic cell adhesion molecule and another fluorescent protein. The interaction between the cell adhesion molecules forces the cells to aggregate, which can be...

Cell Aggregation Assay to Detect Trans Interactions between Cell Adhesion Molecules

This video demonstrates the visualization of protein-protein interactions at the Drosophila neuromuscular junction (NMJ) using Proximity Ligation Assay (PLA). After isolating the body walls, interacting proteins are probed with primary antibodies and PLA-conjugated secondary antibodies. The proximity of the interacting proteins facilitates the ligation of probes with connector oligonucleotides, forming circular DNA, which is then amplified by rolling circle amplification. Fluorescent probes...

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila Larvae Using a Proximity Ligation Assay

Technieken om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de afscheiding van HIV-1 Nef in exosomes ontleden worden beschreven. Specifieke korte peptiden afgeleid van Nef en eiwit transfectie werden uitgebuit om de structuur, functie, en bindende partners van Nef's Secretion Wijziging Region bepalen. Deze procedures hebben algemene belang in veel mechanistische studies.

Peptide-gebaseerde identificatie van functionele Motieven en hun bindingspartners

Drosophila is beroemd om zijn krachtige genetische manipulatie, maar niet voor de geschiktheid van diepgaande biochemische analyse. Hier presenteren wij een-TAP gebaseerde procedure tot interactie partners van een eiwit van belang te identificeren van de vlieg hersenen. Deze procedure kan mogelijk leiden tot nieuwe wegen van onderzoek.

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de intrinsieke adhesieve eigenschappen van vermeende celadhesiemoleculen.  Het uitgescheiden, epatoom-getagde ectodomein van een celadhesiemolecuul wordt gevangen uit het kweekmedium op kleine, uniforme functionele kralen.  Deze kralen kunnen vervolgens onmiddellijk worden gebruikt in eenvoudige kralagomaggregatie-assays.

Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen

Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.

Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in Drosophila Embryo's

Hier beschrijven we een test van de contractility met behulp van Drosophila S2R + cellen. De toepassing van een exogene ligand, gevouwen gastrulatie (Fog), leidt tot het activeren van de mist signalering traject en mobiele contractility. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken van de regulering van cellulaire contractility eiwitten in de mist signalering traject.

Een cel-gebaseerde Assay te onderzoeken niet-spier Myosin II Contractility via de gevouwen-gastrulatie signalering traject in Drosophila S2R + cellen

Presenteren we een methode voor het analyseren van de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke oestrogeen receptor Alfa ligand-bindend domein dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride assay.

Opsporen van de Ligand-bindend domein dimerisatie activiteit van oestrogeen Receptor-Alpha met behulp van de zoogdieren twee-hybride Assay

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Leer celaggregatie-assays om de binding van Drosophila Notch-receptor met trans-liganden en remming door cis-liganden te evalueren. Deze methode helpt bij het bestuderen van genetische en farmacologische effecten op Notch-signalering.

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden (Video) | JoVE Journal

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Meer video's verkennen