Enzym Assays en Kinetiek
Enzyme kinetics beschrijft de katalytische effecten van enzymen, die biomoleculen zijn die chemische reacties bevorderen die noodzakelijk zijn voor le…
Enzyme kinetics beschrijft de katalytische effecten van enzymen, die biomoleculen zijn die chemische reacties vergemakkelijken die noodzakelijk zijn voor levende organismen. Enzymen werken op moleculen, ook wel substraten genoemd, om producten te vormen. Enzymkinetische parameters worden bepaald via assays die direct of indirect veranderingen in substraat- of productconcentratie in de tijd meten.
Deze video behandelt de basisprincipes van enzymkinetiek (inclusief snelheidsvergelijkingen) en kinetiekmodellen. De concepten die enzymen beheersen, worden ook besproken, gevolgd door een typische colorimetrische assay. De toepassingensectie bespreekt een enzymassay via Förster-resonantie-energieoverdracht (FRET)-analyse, het karakteriseren van extracellulaire enzymactiviteit in het milieu en het onderzoeken van DNA-reparatiekinetiek met behulp van moleculaire sondes.
Enzymen zijn biochemische katalysatoren die essentieel zijn voor het leven. Enzymassays worden gebruikt om de kinetische eigenschappen van enzymatische reacties te bestuderen en de katalytische effecten van enzymen te verduidelijken. Deze video behandelt enzymkinetiek en -assays, bespreekt een algemene procedure en toont enkele toepassingen.
Enzymen zijn eiwitten, of minder vaak RNA's, die op een specifiek reagens werken, aangeduid als het substraat. Een enzym vermindert de activeringsenergie die nodig is om een biochemische reactie te starten, waardoor de reactie sneller verloopt.
Enzymatische reacties kunnen worden opgesplitst in drie elementaire componenten. De eerste is de vorming van het enzym-substraatcomplex, gevormd door de binding van het substraat aan de actieve plaats van het enzym. Het complex kan zich ontbinden in zijn oorspronkelijke bestanddelen. Dit is de tweede elementaire reactie. Of het complex kan het product vormen en het enzym herstellen, de derde elementaire reactie.
De kinetiek van een elementaire reactie wordt gegeven door de elementaire snelheidswet-vergelijking. Snelheidswet-vergelijkingen geven de snelheid in termen van de concentratie van de reagentia en een snelheidsconstante. Elk van de elementaire reacties heeft een individuele snelheidswet-vergelijking, met zijn eigen snelheidsconstante. Deze vergelijkingen kunnen worden gedistilleerd tot een kinetisch model dat bekend staat als de Michaelis-Menten-vergelijking. Dit geeft de reactiesnelheid in termen van de substraatconcentratie; die experimenteel kan worden bepaald. Sommige algemene trends voor enzymreacties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de Michaelis-Menten-vergelijking. Bij hoge substraatconcentratie wordt een verzadigingspunt bereikt, Vmax genoemd. Hier is de snelheid beperkt door de totale enzymconcentratie, en het aantal substraatmoleculen dat een enzym per bepaalde tijd in product omzet, ook bekend als kcat. In Michaelis-Menten-kinetiek is kcat een van de twee constanten die de reactiesnelheid bepalen. De andere constante, KM, staat bekend als de affiniteitsconstante. KM is ook gelijk aan de concentratie waarbij de reactiesnelheid gelijk is aan de helft van Vmax. Een enzym met een hogere affiniteit zal een lagere KM hebben en Vmax sneller bereiken, terwijl een enzym met een lagere affiniteit een hogere KM zal hebben en langer nodig heeft om Vmax te bereiken. Het kennen van kcat en KM maakt het mogelijk om enzymen te vergelijken. Hiervoor gebruiken we een verhouding die enzym-efficiëntie wordt genoemd. Een hogere kcat en lagere KM resulteren in hogere efficiënties, terwijl een lagere kcat en hogere KM resulteert in lagere.
De factoren die worden gebruikt om de enzymkinetiek te verduidelijken, moeten experimenteel worden bepaald. Deze assays worden meestal uitgevoerd door een enzym- en substraatoplossing in een gecontroleerde omgeving te mengen. Waarnemingen worden gedaan door de veranderingen in concentratie van het substraat, product of bijproducten met betrekking tot de tijd te meten.
De verandering in concentratie over tijd wordt gebruikt om de reactiesnelheid te bepalen. Om de kinetiek te bepalen, moeten snelheidsgegevens worden verkregen bij meerdere concentraties. Als een plot van de inverse initiële snelheid versus de inverse initiële concentratie, bekend als de Lineweaver-Burk-plot, lineair is, volgt de reactie de Michaelis-Menten-kinetiek. De helling en het snijpunt van de lijn maken het mogelijk om de kinetische parameters KM en Vmax te bepalen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om kcat en de enzym-efficiëntie te berekenen.
Nu de principes van enzymkinetiek zijn besproken, laten we eens kijken hoe een typische enzymassay wordt uitgevoerd.
In deze procedure wordt een colorimetrische assay gedemonstreerd. De eerste stap is het genereren van een standaardcurve, die absorptie correleert met substraatconcentratie. Oplossingen met bekende concentratie worden bereid samen met een controlemonster. Een ontwikkelingsoplossing die reageert met het substraat wordt toegevoegd om een gekleurde verbinding te produceren. Absorptie wordt gemeten en tegen concentratie wordt uitgezet om de standaardcurve te genereren.
Om de assay uit te voeren, wordt een bekende concentratie van substraat bereid samen met de juiste hoeveelheid enzym. Het enzym en het substraat worden gemengd en gedurende een vaste tijdsinterval laten incuberen. pH en temperatuur worden gecontroleerd met bufferoplossingen en verwarmingsblokken. Een dempingsmiddel wordt toegevoegd om de reactie te stoppen. Vervolgens wordt ontwikkelingsoplossing toegevoegd aan de reacties en gemengd. De oplossingen worden vervolgens in cuvettes geplaatst en absorptie wordt gemeten. De hoeveelheid geconsumeerd substraat wordt bepaald door de gemeten absorptie te vergelijken met de standaardcurve. Met behulp van de verzamelde gegevens worden de initiële reactiesnelheden bepaald door concentratie over tijd uit te zetten. Ten slotte, met de snelheidsgegevens en concentratie, wordt de Michaelis-Menten-plot gemaakt. Dit maakt het mogelijk om kinetische eigenschappen voor het enzym te bepalen, zoals turnover-nummer en enzym-efficiëntie.
Nu we een assayprocedure hebben besproken, laten we eens kijken naar andere manieren waarop assays worden uitgevoerd en hun toepassingen.
In deze procedure wordt FRET-analyse gebruikt om de kinetiek van een protease te bestuderen die een peptidebinding van een eiwit hydrolyseert. Deze emissies kunnen worden gemeten, waardoor een continue en kwantitatieve analyse van substraatconsumptie en -productie mogelijk is, wat helpt bij de bepaling van de reactiekinetiek.
Enzymassays kunnen worden gebruikt in de milieuwetenschappen om de niveaus van extracellulaire enzymactiviteit in het milieu te bepalen. Wateren, bodems en sedimenten kunnen uit het milieu worden verzameld en in het laboratorium worden verwerkt. De extracellulaire enzymatische activiteit van deze materialen kan vervolgens worden gekenmerkt met behulp van enzymassays. Dit is een nuttig hulpmiddel om te begrijpen hoe het milieu organisch materiaal verwerkt.
Het DNA-reparatiemechanisme van een cel kan worden geëvalueerd door de kinetiek van enzymen die in de kern worden aangetroffen te bestuderen. De snelheid waarmee een enzym DNA-laesies of schade verwijdert, kan worden gemeten met behulp van fluorescerende moleculaire lichtbakens, die alleen fluoresceren wanneer ze aan unieke DNA-sequenties zijn gebonden. Het niveau van DNA-reparatie kan in realtime worden gemeten door de flu
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the three elementary reactions in an enzymatic reaction?
Enzymatic reactions consist of three elementary steps. First, the enzyme-substrate complex forms when substrate binds to the enzyme's active site. Second, the complex can decompose back into the enzyme and substrate. Third, the complex can form the product while recovering the enzyme for another catalytic cycle.
Q2: How do KM and kcat relate to enzyme efficiency?
Enzyme efficiency is determined by the ratio of kcat to KM. Higher kcat values and lower KM values result in higher enzyme efficiency, meaning the enzyme converts substrate to product more effectively. Conversely, lower kcat and higher KM produce lower efficiency, indicating slower or less effective catalysis.
Q3: What does the Lineweaver-Burk plot reveal about enzyme kinetics?
The Lineweaver-Burk plot graphs inverse initial rate versus inverse substrate concentration. If this plot is linear, the reaction follows Michaelis-Menten kinetics. The slope and intercept of the line allow researchers to determine KM and Vmax, which can then be used to calculate kcat and enzyme efficiency.
Q4: How is a standard curve generated in a colorimetric enzyme assay?
A standard curve is created by preparing substrate solutions of known concentrations along with a control sample. A developer solution is added to each, producing a colored compound proportional to substrate concentration. Absorbance is measured and plotted against concentration, creating a reference curve for determining unknown substrate amounts.
Q5: What is the purpose of the quenching agent in an enzyme assay procedure?
The quenching agent stops the enzymatic reaction at a specific time point, halting substrate conversion to product. This allows researchers to measure the exact amount of substrate consumed during the controlled incubation period, enabling accurate determination of reaction rates at different substrate concentrations.
Q6: How can enzyme assays be applied to environmental science?
Enzyme assays measure extracellular enzyme activity in environmental samples like water, soil, and sediments. By characterizing enzymatic activity in these materials, researchers can understand how the environment processes organic material and assess microbial metabolic capacity in natural ecosystems and environments.
Q7: What advantage does FRET analysis offer for studying enzyme kinetics?
Förster resonance energy transfer analysis enables continuous, real-time monitoring of enzymatic reactions. When a protease hydrolyzes a peptide bond, FRET emissions change measurably, allowing quantitative analysis of substrate consumption and product formation without stopping the reaction, providing more detailed kinetic data.