Name: Neuron-Macrophage co culturen te activeren van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met Neurite uitgroei activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer een neuron-macrofaag co-cultuurmethode om macrofagen te activeren zodat ze factoren afscheiden die neurietuitgroei bevorderen. Dit protocol gebruikt cAMP en DRG-neuronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit protocol wordt ondersteund door een subsidie van de NRF-2015R1A2A1A01003410 van het ministerie van wetenschap, ICT en de Planning van de toekomst, Republiek Korea.

Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Ajou University School of Medicine.
1. cultuur voorbereiding van gedissocieerde volwassen DRG Neuron
<ol><li>Vóór de oprichting van de cultuur, jas vooraf een 6-well plaat met poly-D-lysine en laminin. Na een 6-well plaat met 0,01% poly-D-lysine bij 37° C gedurende 2 uur of bij 4° C een nacht bebroeden. Vervolgens wassen de plaat twee keer met gedestilleerd water.</li>
	<li>Incubeer de plaat met laminin-oplossing bij een concentratie van 3 µg/mL gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, en daarna wassen de plaat twee keer met gedestilleerd water. Droog de plaat bij kamertemperatuur op zijn minst gedurende 1 uur.</li>
	<li>Een muis in een transparante CO2 kamer aangesloten op een gecomprimeerde CO2 gasfles euthanaseren. De huid over de wervelkolom met een chirurgisch mes incise en de paravertebral spieren bilateraal om bloot van de wervel botten te ontleden. Verwijder de Vertebrale botten zorgvuldig met een smalle-tipped chirurgische rongeur totdat de DRG volledig worden blootgesteld. Opmerking: Volwassen DRG neuronen worden verkregen van volwassen C57BL6 mannelijke muizen leeftijd van 8 weken tot 12 weken oud.</li>
	<li>Verwijder de DRG bilateraal uit de S1 helemaal tot op het niveau van de C1 met behulp van iridectomy schaar en pincet boete-tipped onder een Microscoop ontleden. Probeer te snijden de wortels volledig uit DRG om te minimaliseren van besmetting van cellen van Schwann en fibroblasten.</li>
	<li>Bewaar de ontleed DRG in een 60 mm petrischaal met 5 mL van de koude Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) op ijs totdat alle de DRG worden verzameld. Opmerking: Het is cruciaal voor het ontleden van de DRG zo spoedig mogelijk. De collectie van alle DRG van één muis moet niet langer duren dan 30 min. 30 min na de euthanasie, stoppen met het verzamelen van de DRG en gaat u verder met de volgende stap, zelfs als er nog DRG.</li>
	<li>De DRG overbrengen in een 1,5 mL Eppendorf buis met behulp van een blauwe pipette uiteinde (1000 µL) met een licht-donkerscheiding einde. Verwijder de DMEM na een snelle spin voor enkele seconden met behulp van een mini centrifuge. Voeg 1 mL DMEM met 125 U/mL type XI collagenase en de buis gedurende 90 minuten met een zachte rotatie (35-40 rpm) met behulp van een shaker twister in een incubator 37 ° C te incuberen. Immobiliseren de buis op de verdieping van de Schudbeker met behulp van de tape.</li>
	<li>Negeren collagenase-bevattende DMEM en voeg 1 mL verse DMEM. Wacht tot de drijvende DRG helemaal naar beneden naar de bodem zinken, en verwijder de DMEM met het weefsel puin. Herhaal deze stap wassen ten minste zes keer. Opmerking: Probeer niet te Verwijder het supernatant volledig. Wees voorzichtig niet te verwijderen elke DRG met het supernatant DMEM.</li>
	<li>De DRG overbrengen in een conische tube van 15 mL met behulp van een blauwe pipette uiteinde (1000 µL) met een licht-donkerscheiding einde. Daarna Pipetteer zachtjes op en neer minstens 15 keer gebruik van een blauwe tip (1000 µL) om een homogeen celsuspensie. Vermijd bubbels te maken en proberen niet te raken van de onderkant van conische buis met een pipet tip.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 239 x g gedurende 3 min en zorgvuldig Verwijder het supernatant met zwevend puin. Voeg vervolgens 1 mL van Neurobasal medium aangevuld met B27 (2,0% v/v) en resuspendeer de pellet cel door zachtjes op en neer 5 tot 10 keer pipetteren.</li>
	<li>De celsuspensie passeren door een zeef van 70-µm cel overlay op de top van een conische tube van 50 mL. 2 min wacht, en giet Neurobasal/B-27 medium op de zeef met behulp van een pipet controller.</li>
	<li>Alle verzamelde DRG neuronen (een totaal van ongeveer 2 x 106 DRG neuronen van één muisklik) op twee putjes van 6-well plaat plaat. Deutsche Reichsbahn neuronen van een volwassen muis dekken twee putten in een 6-well-plate. Plaats de plaat dan in een CO2 incubator bij 37 ° C totdat de macrofaag mede culturen.</li>
</ol>2. co cultuur van P secund peritoneale macrofagen op A cel cultuur invoegen
Opmerking: Stellen de co culturen 4 uur na het eerste laagje van de gedissocieerde DRG neuronen
<ol><li>Primaire peritoneale macrofagen zijn bereid uit volwassen C57BL6 mannelijke muizen leeftijd van 8 weken tot 12 weken oud. Een dier in een CO2 kamer euthanaseren. Incise de buikhuid tactvol, bloot het buikvlies en Vermijd het buikvlies om te voorkomen dat een lekkage van vloeistof lavage snijden.</li>
	<li>Het buikvlies met behulp van een injectiespuit met een naald 22G doorprikken en 10 mL ijskoud fosfaatgebufferde salin (PBS) injecteren in de peritoneale holte. Zachtjes masseren het buikvlies voor 1-2 min. Vervolgens trek de naald uit de PBS via de naald punctie site uitstotings en verzamelen de lavage vloeistof in een conische buis van 50 mL. Opmerking: Vóór gebruik, zet de spuit op het ijs om de kou van de PBS.</li>
	<li>Centrifugeer de lavage vloeistof bij 239 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet de cellulaire componenten. Resuspendeer de pellet met 3 mL lysis-buffermengsel van de rode bloedcellen (RBC) gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer dan de celsuspensie weer bij 239 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met 3 mL PBS en centrifugeer de celsuspensie weer als u wilt verwijderen van alle resterende RBC lysis-buffermengsel. Opmerking: Zorg ervoor dat de RBC lysis-buffermengsel volledig is verwijderd. Anders kunnen resterende RBC lysis-buffermengsel giftig is voor de gekweekte macrofagen.</li>
	<li>Resuspendeer de Ingehuld cellen in 1 mL medium Neurobasal/B-27. Plaat de helft van alle verzamelde macrofagen (een totaal van 3 × 10-6 van 6 x 106 cellen) op een cultuur van de cel invoegen met behulp van het effectieve deel van 4.2 cm2, die wordt geplaatst op de top van de waterput van gedissocieerde DRG. Opmerking: Tijdens de periode van co cultuur, macrofagen worden gekweekt in Neurobasal/B-27 neuron kweekmedium. Voldoende voortbestaan van macrofagen onder deze voorwaarde werd bevestigd.</li>
</ol>3. behandeling van Db-Camp en verzameling van Macrophage CM
Opmerking: Beginnen met de behandeling van de db-kamp 4 h na de neuron-macrofaag co culturen.
<ol><li>Voeg 2 µL van 100 µM db-cAMP oplossing aan de neuron-macrofaag co culturen. Voeg een gelijk volume PBS voor een controle-experiment.</li>
	<li>Vul een lege goed met 1 mL macrofaag kweekmedium in de dezelfde 6-well plaat na 24 uur. De cel cultuur invoegen in het neuron-macrofaag co culturen overbrengen in de lege put met macrofaag kweekmedium. Houd de cellen onder de zelfde voorwaarde voor 72 h zonder het wijzigen van het medium. Opmerking: We toevoegen dat alleen 1 mL macrofaag kweekmedium tijdens CM collectie om geconcentreerd CM. Tijdens de CM-collectie, indien nodig, wij toegevoegd meer volledig bedekt de macrofagen binnen het invoegen.</li>
	<li>Centrifugeer de macrofaag CM bij 239 x g gedurende 5 min om de cellulaire componenten te verwijderen na 72 uur. Het supernatant passeren een 0,2-µm filter te verwijderen van alle resterende cellulaire puin. De verzamelde CM bij-70 ° C bewaren tot gebruik.</li>
</ol>4. Neurite uitgroei Assay met verzamelde CM
<ol><li>Vóór de oprichting van een apart volwassen DRG neuron cultuur, jas vooraf de dia van een 8-well kamer volgens dezelfde procedure beschreven in 1.1 en 1.2.</li>
	<li>Gedissocieerde volwassen DRG neuronen in Neurobasal medium aangevuld met B27 verkrijgen met behulp van dezelfde methoden beschreven van 1.3 tot 1.10. Plaat 5 x 104 cellen per putje op de dia die vooraf gecoate 8-well kamer.</li>
	<li>Plaats de kamer dia in een incubator 37 ° C gedurende 2 uur, waardoor de cellen om te koppelen aan de onderkant. Vervang vervolgens het kweekmedium met de ontdooide CM dat is voorverwarmd bij 37 ° C. Opmerking: Wees voorzichtig niet te raken van de onderkant van de dia 8-well kamer bij het verwijderen van het kweekmedium en het toevoegen van de verzamelde CM.</li>
	<li>15 h na het eerste laagje, verwijderen van het medium en de cellen met PBS keer wassen. Vervolgens Breng 200 µL van ijskoude 4% paraformaldehyde-oplossing in de putjes en Incubeer de cellen met de paraformaldehyde-oplossing voor 20 min bij 4 ° C Opmerking: De DRG neuron cultuur voor neurite uitgroei assay moet juist beperkt blijven tot 15u. Onder deze voorwaarde is er geen merkbare neurite uitgroei.</li>
	<li>Spoel driemaal met PBS ijskoud en voer blokkeren met 10% normale geit serum (NGS) met 0,1% Triton-X voor 30 min. Incubeer de vaste cellen met primair antilichaam (anti-Tuj-1) oplossing verdund met 10% NGS (bij een concentratie van 1 µg/mL) voor 4 uur op de kamer temperatuur of 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Spoel driemaal met PBS en vervolgens Incubeer de cellen met secundair antilichaam (geit-anti-muis) oplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Vervolgens spoel tweemaal met PBS en monteren de cultuur dia met een dekglaasje aan (24 × 50 mm) met behulp van montage oplossing.</li>
	<li>Het nemen van beelden met behulp van een fluorescentie Microscoop te visualiseren neurite uitgroei.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
<li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylprednisolone+for+acute+spinal+cord+injury%3A+an+increasingly+philosophical+debate%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate.</a> Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).</li>
<li>Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+CNS+axon+regeneration+by+manipulating+convergent+neuro-immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling.</a> Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).</li>
<li>DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the devil is in the details.</a> J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).</li>
<li>Jin, X., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system repair after injury.</a> J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-derived+factors+stimulate+optic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration.</a> J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncomodulin+is+a+macrophage-derived+signal+for+axon+regeneration+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).</li>
<li>Gensel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+axon+regeneration+with+concurrent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity.</a> J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).</li>
<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende kritische stappen voor de generatie van dit systeem co cultuur. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de muis DRG neuronen en peritoneale macrofagen vers worden bereid en gezond. Wij hebben ervaren verminderde neurite activiteit van de uitgroei van de CM de dissectie van alle de DRG toen meer dan 30 min. Bovendien, de besmetting van bloedbestanddelen in peritoneale macrofagen ook geleid tot een daling van neurite uitgroei activiteit in de CM. Om te ontlokken robuuste neuron-macrofaag interactie ...

Een aantal studies hebben getracht te verbeteren CNS axon regeneratie na de verwondingen van het ruggenmerg of de hersenen. Ontstekingsreacties, onvermijdelijk bij de verwondingen in het zenuwstelsel, worden traditioneel verondersteld deel te nemen aan secundaire pathologische processen die leiden tot de schadelijke resultaten1,2. Methylprednisolon waarin kan worden onderdrukt ontstekingsreacties is immers de enige erkende therapie voor acute ruggenmerg letsel3. Echter, meer recente studies hebben aangetoond dat de regeneratie of reparatie van gewonde zenuwstelsel4,5,6door macrofagen, een representatieve inflammatoire celtype, kunnen deelnemen. Bijvoorbeeld Infiltrerend macrofagen na een lens letsel produceren pro-regeneratieve moleculen ter bevordering van de regeneratie van de retinale ganglion neuronen7,8. Daarnaast verhoogd getransplanteerde DRG neuronen axon groei van de regio waar de macrofagen waren geactiveerd door zymosan9. Bovendien, de macrofagen op de site van de laesie kunnen leiden tot een groei-tolerante milieu voor gewonde perifere zenuwen10.
Ons werk ook sterke aanwijzingen dat macrofagen tot de capaciteit van axon regeneratie in aangrenzende neuronen bijdragen kunnen geboden. We hebben aangetoond dat de activering van de macrofagen in de achterwortelganglia, bevatten (DRG) zijn essentieel in de verbeterde regeneratief vermogen van DRG sensorische neuronen na een voorbehandeling perifere zenuwen letsel11. Vergelijkbaar onderzoek werd onafhankelijk gemeld uit een ander laboratorium12. We toonden ook aan dat intraganglionic injectie van dibutyryl cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT (db-kamp), die een bekende molecule is tot vergroting van de capaciteit van axon regeneratie13, de activering van macrofagen veroorzaakt. Het deactiveren van macrofagen afgeschaft de effecten van db-kamp op neurite uitgroei activiteit. Volgende werken geïdentificeerd letsel-geïnduceerde expressie van CCL2 in de neuronen als een signaal aan het stimuleren van macrofagen met een pro-regeneratieve fenotype14,15.
Op basis van de bovengenoemde experimentele resultaten, hebben we een in vitro model lijkt op de moleculaire gebeurtenissen die zich voordoen in de DRG na een conditioneringscycli letsel model11,14opgericht. In dit model wordt db-cAMP toegepast op het neuron-macrofaag co culturen opwekken intercellulaire signalering dat leidt tot de activering van de macrofagen met een pro-regeneratieve fenotype. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen waarmee we kunnen genereren macrofagen die afscheiden van moleculaire factoren ter bevordering van neurite uitgroei (Figuur 1). Deze experimentele model illustreert een concept dat macrofagen kunnen worden gestimuleerd of geïnduceerde ter ondersteuning van axon regeneratie na de verwondingen aan zenuwstelsel. Ons model zal ook nuttig zijn bij het bestuderen van de mechanismen in de intercellulaire signalering die leidt tot de activering van de pro-regeneratieve macrofagen zijn.

<table><tbody><tr><td>Cell culture insert transparante PET-membraan 0,4&mu;m poriëngrootte</td><td>Corning, Falcon</td><td>353090</td><td>Transparante PET-membraan met 0,4-&mu;m poriëngrootte, voor 6-well plate</td></tr><tr><td>70-&mu;m nylon cel-strainer</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>8-well kweekschuif</td><td>Biocoat</td><td>354632</td><td>met een uniforme toepassing van Poly-D-Lysine</td></tr><tr><td>Rode bloedcel lyse buffer</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase van Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Bevat 1% glutamax en 1% peniciline-streptomycine</td></tr><tr><td>B-27 supplement, serumvrij</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>extracellulaire oplossing</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 3', 5'-cyclisch monofosfaat, N6,O2'-dibutyryl-, natriumzout</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10% Normaal Geitenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chemical and Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anti &beta; III tubuline (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Muis monoklonaal antilichaam</td></tr><tr><td>Geiten anti-Muis IgG (H+L) secundair antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cel kweek CO2 incubator</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie stereomicroscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Twist shaker</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Tabelcentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>16021-14</td><td>Roestvrij staal, 14cm, gebogen, enkele gewrichtsactie</td></tr><tr><td>Fijne schaar - Tungsten Carbide &amp; ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14558-11</td><td>scherp, gekarteld</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0,07 x 0,04mm, gebogen</td></tr><tr><td>Vannas Veerschaar</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>15000-00</td><td>recht, 3mm snijkant, scherp</td></tr><tr><td>Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge</td><td>Artisan Technology Group</td><td>DW-41</td><td>Input Voltage: 115VAC</td></tr></tbody></table>

neuron-macrophage co culturen te activeren van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

Er zijn sterke aanwijzingen dat macrofagen het herstel of de reparatie van gewonde zenuwstelsel kunnen deelnemen. Hier beschrijven we een protocol waarin macrofagen zijn aangezet te produceren geconditioneerd medium (CM), dat neurite uitgroei bevordert. Volwassen achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen zijn acuut losgekoppeld en verguld. Nadat de neuronen stabiel vastgemaakt zijn, zijn peritoneale macrofagen mede gekweekte op een cel cultuur invoegen die op hetzelfde goed worden bedekt. Dibutyryl die cyclisch AMP (db-cAMP) wordt toegepast op de co culturen gedurende 24 uur, waarna de celcultuur invoegen waarin de macrofagen wordt verplaatst naar een ander goed voor het verzamelen van CM voor 72 uur. De CM vanaf de co culturen behandeld met db-cAMP, wanneer toegepast op een afzonderlijke volwassen DRG neuron cultuur, vertoont robuuste neurite uitgroei activiteit. De CM verkregen uit de db-kamp-testgroep culturen die bestaat uit één celtype alleen, DRG neuron of peritoneale macrofaag, deed niet neurite uitgroei activiteit vertonen. Dit geeft aan dat de interactie tussen neuronen en macrofagen is onmisbaar voor de activatie van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit in CM. Dus zullen onze co cultuur paradigma ook nuttig zijn te onderzoeken intercellulaire signalering in de neuron-macrofaag interactie te stimuleren de macrofagen te worden begiftigd met een pro-regeneratieve fenotype.

We beschrijven een protocol dat macrofagen staat afscheidende moleculaire factoren met neurite uitgroei activiteit kan genereren. De macrofaag CM verkregen uit de co culturen behandeld met db-cAMP resulteerde in robuuste neurite uitgroei wanneer toegepast op een apart DRG neuron cultuur (figuur 2A). In vergelijking, deed CM verkregen van de PBS-behandelde co culturen niet neurite uitgroei induceren in onze 15-h cultuur duur (figuur 2B</st...

Het huidige protocol presenteert experimentele procedures ter stimulering van gekweekte macrofagen te worden begiftigd met capaciteit om moleculaire factoren ter bevordering van de uitgroei van de neurite vrij te geven. Behandeling van kamp tot de neuron-macrofaag co culturen induceert de macrofagen produceren geconditioneerde medium dat sterke neurite uitgroei activiteit bezit.

Neuron-Macrophage co culturen te activeren van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met Neurite uitgroei activiteit

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Het algemene doel van deze procedure is om macrofagen te genereren die moleculaire factoren kunnen afscheiden die de groei van neuriten bevorderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe neuronen en macrofagen met elkaar interageren om het pro-regeneratieve macrofagefenotype te activeren en uitstekende regeneratie te bevorderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat we cyclisch AMP gebruiken, een adenosine serummolecuul, dat een veel fysiologischer enzym is dan die gebruikt in eerdere studies om macrofagen met het pro-regeneratieve fenotype te stimuleren.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ontdekten dat macrofaagactivering essentieel is voor het verbeteren van de groeicapaciteit van axonen en dat deze uitstekende neuronen kunnen produceren na voorzorgsmaatregelen bij permanente lobletsel. Voordat u de cultuur opzet, bedekt u een zes-putjesplaat met poly-D Lysine en laminine. Bewaar vervolgens de zes-putjesplaat met 0,01 poly-D Lysine gedurende twee uur bij 37 graden Celsius of gedurende de nacht bij vier graden Celsius.Was daarna de plaat twee keer met gedestilleerd water. Bewaar vervolgens de plaat met laminine-oplossing met een concentratie van drie microgram per milliliter gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Was daarna de plaat twee keer met gedestilleerd water en laat de plaat bij kamertemperatuur minimaal een uur drogen.Nu snijdt u de huid boven de wervelkolom van een geëuthaniseerde muis met een chirurgisch mes en verwijdert u de paren van wervelspieren bilateraal om de wervelbotten bloot te leggen. Verwijder de wervelbotten zorgvuldig met een smal spits chirurgisch rongeur totdat de DRG volledig bloot liggen. Verwijder onder een dissectiemicroscoop de DRG bilateraal van S1 tot aan het C1-niveau met behulp van iridectomie schaar en fijnpuntige pincetten.Breng de DRG over naar een 1,5 milliliter eppendorfbuis met behulp van een blauwe pipettetip met een afgesneden uiteinde. Verwijder vervolgens DMEM na een snelle spin gedurende enkele seconden met behulp van een minicentrifuge. Voeg een milliliter DMEM toe met 125 eenheden per milliliter type 11 collagene en bewaar de buis gedurende 90 minuten met een zachte rotatie met behulp van een twister shaker bij 37 graden Celsius.Gooi daarna de collageenase bevattende DMEM weg en voeg een milliliter verse DMEM toe. Breng de DRG over naar een 15 milliliter conische buis met behulp van een blauwe pipettetip met een afgesneden uiteinde. Pipetteer vervolgens minimaal 15 keer voorzichtig op en neer om een homogene celsuspensie te maken.Centrifugeer de buis gedurende drie minuten bij 239 G en gooi voorzichtig de supernatant met drijvend puin weg. Voeg een milliliter neurobasal medium toe, aangevuld met B27, en schud de celpellet voorzichtig op en neer met behulp van een pipetteerder, vijf tot tien keer. Laat vervolgens de celsuspensie door een celsifter met een opening van 70 micrometer lopen, die op een 50 milliliter conische buis is geplaatst.Plaats vervolgens alle verzamelde DRG-neuronen op twee putjes van de zes-putjesplaat. Om primaire peritoneale macrofagen van een volwassen muis te bereiden, snijdt u voorzichtig de buikhuid in om het peritoneum bloot te leggen en vermijdt u het snijden van het peritoneum om lekkage van lavagesuiv te voorkomen. Prik vervolgens het peritoneum met een spuit met een naald van 22 gauge en injecteer 10 milliliter ijskoud PBS in de buikholte.Masseer voorzichtig het peritoneum gedurende één tot twee minuten. Trek vervolgens de naald uit en pers het PBS uit door de plaats waar de naald is geprikt en verzamel de lavagesuiv in een 50 milliliter conische buis. Centrifugeer vervolgens de lavagesuiv gedurende 10 minuten bij 239 g bij vier graden Celsius om de cellulaire componenten te bezinken.Resuspendeer vervolgens de pellet met drie milliliter rode bloedcel lysebuffer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie opnieuw gedurende 10 minuten bij 239 g bij vier graden Celsius. Resuspendeer de bezonken cellen in één milliliter neurobasal B27 medium.Breng de helft van alle verzamelde macrofagen op een celcultuurinsert met een effectief oppervlak van 4,2 vierkante centimeter aan, die op de put met gedissocieerde DRG is geplaatst. Voeg vier uur nadat de neuronmacrofagen zijn geco-cultiveerd twee microliter 100 micromolair DB cyclisch AMP-oplossing toe aan de neuronmacrofagen co-cultuur. Na 24 uur vult u een lege put met één milliliter macrofagencultuurmedium in dezelfde zes-putjesplaat.Breng de celcultuurinsert in de neuronmacrofagen co-cultuur over naar de lege put met macrofagencultuurmedium. Centrifugeer na 72 uur het macrofagen geconditioneerde medium gedurende vijf minuten bij 239 keer g om de cellulaire componenten te verwijderen. Laat de supernatant door een 0,2 micrometer filter lopen om eventuele resterende cellulaire resten te verwijderen.In deze procedure bedekt u een acht-putjeskamerschijfpje met poly-D lycine en laminine. Verkrijg vervolgens de gedissocieerde volwassen DRG-neuronen en neurobasal medium, aangevuld met B27, met behulp van dezelfde methoden zoals eerder beschreven. Breng vijf keer 10 tot de vier cellen per put aan op een vooraf bedekt acht-putjeskamerschijfpje.Plaats vervolgens het kamerschijfpje in een incubator van 37 graden Celsius gedurende twee uur om de cellen aan de bodem te laten hechten. Vervolgens vervangt u het kweekmedium met het ontdooide, geconditioneerde medium dat is voorverwarmd bij 37 graden Celsius. Verwijder 15 uur na het aanleggen van de eerste kweek het medium en was de cellen met PBS eenmaal, voeg vervolgens 200 microliter ijskoud, 4% paraformaldehyde-oplossing toe aan de putten en bewaar de cellen met de paraformaldehyde-oplossing gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Bewaar vervolgens de gefixeerde cellen met primaire antilichaamoplossing verdund met 10% normaal geitenserum gedurende vier uur bij kamertemperatuur of gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Nee

neuron-macrophage-co-cultures-to-activate-macrophages-secreting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We ontwikkelden een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie onderzoek. Het platform is in staat het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel en werd vervaardigd met behulp van een nieuw ontwikkelde macro / micro hybrid fabricage methode.

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

This video shows the co-culturing of murine dorsal root ganglion neurons and macrophages. Neurons are seeded on a coated plate, while macrophages are collected from an euthanized mouse, treated, and added to the culture insert. Treatment with db-cAMP activates neurons and prompts macrophages to adopt a pro-regenerative phenotype to support neuronal outgrowth.

Developing a Neuron and Macrophage Coculture In Vitro

This video demonstrates an assay for promoting the growth of neuron projections known as neurite outgrowth using the macrophage-conditioned medium. Co-culture neurons and macrophages with cAMP and harvest the macrophage-derived conditioned medium. Growing the neurons with the conditioned medium promotes neurite outgrowths. These outgrowths are fluorescently labeled and visualized using a fluorescence microscope.

Using a Macrophage Conditioned Medium to Promote Neuron Extensions

This video demonstrates the establishment of a co-culture of human induced neurons (iNs) and induced oligodendrocyte precursor cells (iOPCs). iNs are mixed with iOPCs in a co-culture and then incubated to support the maturation of both iNs into neurons and iOPCs into oligodendrocytes. Neurons form synaptic connections with other neurons and oligodendrocytes, while oligodendrocytes develop myelin sheaths around the neurons' axons.

A Co-culture Method to Model Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Bij meercellige organismen veroorzaken uitgescheiden oplosbare factoren reacties van verschillende celtypen als gevolg van paracriene signalering. Co-cultuursystemen bieden een eenvoudige manier om de veranderingen aan te brengen die worden veroorzaakt door uitgescheiden oplosbare factoren in de afwezigheid van cel-celcontact.

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.

Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt

We beschrijven de isolatie, dispersie en beplating van tandheelkundige pulp (DP) primaire cellen met trigeminale (TG) neuronen gekweekt bovenop bovenliggende transwell filters. Cellulaire reacties van DP-cellen kunnen worden geanalyseerd met immunofluorescentie of RNA/eiwitanalyse. Immunofluorescentie van neuronale markers met confocale microscopie maakt de analyse van neurite outgrowth reacties mogelijk.

Een co-cultuur methode om Neurite Outgrowth studie in reactie op tandheelkundige pulp paracrine signalen

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Leer een neuron-macrofaag co-cultuurmethode om macrofagen te activeren zodat ze factoren afscheiden die neurietuitgroei bevorderen. Dit protocol gebruikt cAMP en DRG-neuronen.

Neuron-Macrophage co culturen te activeren van macrofagen afscheidende moleculaire factoren met Neurite uitgroei activiteit

Meer video's verkennen