Hoge resolutie Volume Imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd Microfluidic apparaten

Het algemene doel van deze procedure is om volledige veldmeting van in vitro neuronal volume mogelijk te maken met submicrometrische axiale resolutie die nodig is voor de analyse van neurites in dynamische structuren die betrokken zijn bij neuronaal groei. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van cellulaire neurowetenschap te beantwoorden over de dynamiek van volumeveranderingen op de subsidiale schaal tijdens de niet-groei of axon degeneratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze submicrometrische axiale resolutie biedt in combinatie met volledige pasvormobservatie en tijdschaal tot uren of dagen.

Om de procedure te starten, ontvorm de PDMS-blok onder een chemische kap door isopropanol erop te gieten. Plaats het vervolgens op de roestvrijstalen werktafel van de kap. Snijd rond de siliconen wafer en ontvorm de PDMS replica.

Snij vervolgens rond de chip en laat een marge van twee millimeter achter met een scalpel of scheermes. Pers de inlaat door de 1,5 millimeter diameter puncher stevig in en activeer deze om het gat van de inlaat te snijden en te kerven. Doe hetzelfde in de vier specifieke zones van de chip waar vloeistof zal worden geïnjecteerd.

Vervolgens, reinig de chip door het plakband op de gemicrostructureerde kant te plakken en te pellen. Sprenkel isopropanol aan beide kanten. Droog vervolgens de chip met geperste stikstof met behulp van een luchtblazer.

Bij deze procedure, plaats elke dekglas op een spin-coater in een schone kamer omgeving. Breng een druppel van de positieve fotoresist aan om ongeveer 75% van het dekglas te bedekken en spin-coat bij 4000 tpm gedurende 30 seconden om een einddepautik van 0,45 micrometer te bereiken. Plaats de dekglazen op een hotplate met een oppervlaktetemperatuur van 115 graden Celsius gedurende één minuut.

Gebruik een maskeraligner om elke dekglas bloot te stellen aan een golflengte van 435 nanometer door het specifieke masker volgens de fabricant parameters. Bereid vervolgens twee glazen kristallisatie schotels voor, een bevat de ontwikkelaar zonder verdunning, de andere bevat gedeïoniseerd water. Dompel de dekglazen één voor één in de ontwikkelaar gedurende één minuut terwijl u het kristallisatie schaal continu en voorzichtig roert.

Dompel vervolgens de wafer gedurende ongeveer vijf seconden in gedeïoniseerd water. Breng de wafer over naar een absorberend papier en droog het met geperste stikstof met behulp van een luchtblazer. Plaats zowel de PDMS-chip als het glazen schaal waarop deze zal worden gebonden in de plasmakamer voor oppervlakte activering.

Plaats vervolgens een druppel water op een rechthoekige dikke microscoopglasplaat en plak het dekglas op de glasplaat door capillariteit. Markeer onder een microscoop de locatie van de fotoresist strepen aan de achterkant van de glasplaat. Plaats het gepaterde glazen dekglas op de maskerhouder van de maskeraligner.

Vertrouw op de gemaakte markering om de fotoresist referentie objecten te centreren. Om de optische contrast te verhogen, plaats een siliciumwafer onder de PDMS-chip. De siliciumwafer moet stevig bevestigd blijven op de klemklem tijdens het aflijningsproces.

Plaats vervolgens de PDMS-chip op de mobiele substraathouder van de maskeraligner. Vervolgens, til de klemklem voldoende op om zowel de chip als de array van fotoresist strepen op het dekglas te visualiseren terwijl u achter de mechanische contact blijft. Voer aflijning uit en bereik mechanische contact tussen de chip en het dekglas door de klemklem op te tillen tot het oppervlak van PDMS pilaren het glazen dekglas raakt.

Verlaag daarna de klemklem. Verwijder het dekglas dat aan de chip is gebonden van de maskerhouder. Plaats vervolgens het apparaat in een 35 millimeter Petri schotel en breng alles over naar de oven gedurende vijf tot tien minuten om de bindingssterkte te verhogen.

Dertig minuten na het binden, plaats een tiendre microliter pipettip gevuld met PLO-oplossing bij de inlaat. Laad vervolgens de vloeistof totdat een druppel erbovenop ontstaat. Herhaal dezelfde handeling bij de uitlaat en reservoirs.

Voeg vervolgens PBS toe in de Petri schotel rond de chip. Verzegeld de Petri schotel met een paraffine film en incubeer op kamertemperatuur gedurende minimaal vijf uur. Druk vervolgens een tiendre microliter puntkegel lichtjes in elke injectieopening en zuig het overtollige vloeistof op.

Vervang vervolgens PLO en het PBS rond de chip door het kweekmedium. Plaats vervolgens de chip in de incubator die is gereguleerd op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot neuronen zaaien met een minimale incubatietijd van vijf uur. Bij deze procedure, zuig het kweekmedium van de chip.

Verzamel twee tot drie microliter van de vers opgeschorte celoplossing en injecteer deze bij de inlaat. Herhaal onmiddellijk dezelfde handeling bij de uitlaat. Injecteer ongeveer hetzelfde volume kweekmedium in elke reservoir.

Observeer de chip snel onder de microscoop om de dichtheid van de cellen te controleren. De orde van grootte van de optimale celdichtheid komt overeen met ongeveer vijf tot tien cellen binnen de vierkante oppervlakte begrensd door vier pilaren. Herhaal de procedure van injectie van 0,5 tot 1 microliter celsuspensie om de beoogde celdichtheid te bereiken.

Voor beeldvorming, vervang het kweekmedium met het beeldvormingsmedium. Plaats vervolgens de chip onder een epifluorescentiemicroscoop. Verzamel beelden van cellen van enkele tot meerdere opeenvolgende beelden in geval van time-lapse experimenten.

Hier getoond zijn de representatieve observaties van een kalibratie fotoresist streep en neuronen. Hogere vergroting beelden en dwarsdoorsneden van deze objecten worden aan de rechterkant weergegeven. De representatieve neurites en een centrale kamer van drie micrometer hoog worden hier getoond.

Het volume van de neurite snede kan worden berekend als functie van de neurite breedte. En hier zijn de representatieve groeikegels en een centrale kamer van drie micrometer hoog. Hun substructuren komen duidelijk naar voren uit een optische achtergrondruis van ongeveer 20 nanometer.

Time-lapse observaties van levende act neuronen