Name: Hoge resolutie Volume Imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd Microfluidic apparaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer een fluorescerende uitsluitingsmethode voor hoogresolutie volumemeting van neuronen in vitro met submicrometrische axiale resolutie. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van neurietdynamica en groeiconi mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen erkennen ChiLab, materialen en Microsystems laboratorium - Politecnico di Torino - DISAT, in de persoon van Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza en Dr. S L Marasso, voor hun waardevolle hulp bij de procesontwikkeling en fabricage van het apparaat. Wij danken Victor Racine van Quantacell voor discussie en ondersteuning in de beeldverwerking. Wij zijn dankbaar aan Isabelle Grandjean en Manon Chartier uit het dier faciliteit van het Institut Curie voor hun steun voor muizen, en Pablo Vargas en Ana-Maria Lennon (Institut Curie) voor het verstrekken van ons met de LifeAct van GFP-muizen. We zijn dankbaar Olivier Thouvenin uit Institut Langevin en Clotilde Cadart, Larisa Venkova en Matthieu Piel van het Institut Curie - UMR 144, voor hun hulp bij het begrijpen van de fluorescentie uitsluiting methode. Tot slot, wij danken het technologische platform van Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) voor hun steun in microfabrication. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Europese onderzoek Raad Advanced Grant No. 321107 "CellO," PSL Université (SwithNeuroTrails project), ANR Investissement d'Avenir, IPGG Labex en de Equipex.

<ol><li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-size+maintenance%3A+universal+strategy+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li>
<li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li>
<li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+spike+accompanies+the+action+potential+in+Mammalian+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A mechanical spike accompanies the action potential in Mammalian nerve terminals.</a> Biophys J. 92 (9), 3122-3129 (2007).</li>
<li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hypertrophy+in+Asymptomatic+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hypertrophy in Asymptomatic Alzheimer Disease.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (6), 578-589 (2008).</li>
<li>Cheli, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Deletion+of+the+L-Type+Calcium+Channel+Cav1.+2+in+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+Affects+Postnatal+Myelination+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditional Deletion of the L-Type Calcium Channel Cav1. 2 in Oligodendrocyte Progenitor Cells Affects Postnatal Myelination in Mice.</a> J Neurosci. 36 (42), 10853-10869 (2016).</li>
<li>Kneynsberg, A., Collier, T. J., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+semi-quantitative+measurements+of+axonal+degeneration+in+tissue+and+primary+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and semi-quantitative measurements of axonal degeneration in tissue and primary neuron cultures.</a> J Neurosci Methods. 266, 32-41 (2016).</li>
<li>Fouquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+axial+resolution+in+confocal+microscopy+with+new+high+refractive+index+mounting+media%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li>
<li>Aguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+dynamics+of+dividing+cells+imaged+by+lattice+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane dynamics of dividing cells imaged by lattice light-sheet microscopy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3418-3435 (2016).</li>
<li>Roland, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid-induced+actomyosin+contractility+shapes+neuronal+morphology+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid-induced actomyosin contractility shapes neuronal morphology and growth.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Chen, J., Xue, C., Zhao, Y., Chen, D., Wu, M. H., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+impedance+flow+cytometry+enabling+high-throughput+single-cell+electrical+property+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microfluidic impedance flow cytometry enabling high-throughput single-cell electrical property characterization.</a> Int J Mol Sci. 16 (5), 9804-9830 (2015).</li>
<li>Bottier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+measurement+of+the+height+and+volume+of+migrating+cells+by+a+novel+fluorescence+microscopy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dynamic measurement of the height and volume of migrating cells by a novel fluorescence microscopy technique.</a> Lab Chip. 11, 3855-3863 (2011).</li>
<li>Cadart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+eXclusion+Measurement+of+volume+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence eXclusion Measurement of volume in live cells.</a> Methods Cell Biol. 139, 103-120 (2017).</li>
<li>Marasso, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2053-1591/3/6/065001/pdf">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001(2016).</li>
<li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931706000670">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li>
<li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Götz, J., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+support+cultures+of+hippocampal+and+substantia+nigra+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons.</a> Nat. Protoc. 4 (1), 78-85 (2008).</li>
<li>abcam. Counting cells using a hemocytometer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2017).</li>
<li>ImageJ. Getting intensity values from single ROI. Image Intensity Processing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Image_Intensity_Processing">https://imagej.net/Image_Intensity_Processing</a> (2017).</li>
<li>ImageJ. 19. Tools. ImageJ User Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html ">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-19.html </a> (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Volume beeldvorming van neuronen vormt een uitdaging voor de FXm techniek als gevolg van de lange en dunne extensies van deze cellen. Dit protocol beschrijft varianten van hetzelfde type van microfluidic apparaat gewijd aan neuron imaging.
Naast de aspecten van microfluidic ontwerp, de keuze van de doelstelling is van fundamenteel belang voor fluorescentie uitsluiting beeldvorming en impliceert een trade-off tussen laterale resolutie en de helderheid van de afbeelding. In 13 is gebleken dat een hoge nb leidt tot een diepte van de focus kleiner is dan de hoogte van de kamer niet schadelijk voor de precisie van de volumemeting van het was als imaging werd uitgevoerd bij focus en een voldoende marge tussen de omtrek van het object van i overblijft nterest en de grenzen van het oppervlak van de integratie. Echter, het gebruik van een kamer veel hoger dan de diepte van de focus schaadt de beeldhelderheid als gevolg van foton diffusie, welke worden de randen van de objecten van belang. De fabricage van een hoge kamer van 3 µm verminderd deze laterale vervaging en mits uitzonderlijk goed gedefinieerde fluorescerende uitsluiting beelden zelfs met behulp van hoge nb (0.8) 40 X doelstellingen te visualiseren van neuronale takken met hoge zijdelingse resolutie.
Chip montage is een cruciale stap, met name in het geval van 3 µm hoge kamers, maar voorzichtig manipulatie zoals beschreven in punt 4.1.2 vermijdt het instorten van het dak. De hoge oppervlakte volumeverhouding geassocieerd met deze dunne kamers kwestie ook de van de stabiliteit van Dextran concentratie na verloop van tijd. Wij hebben gecontroleerd dat de oppervlakte absorptie van de Dextran na één nacht van incubatie verwaarloosbaar was: na het vervangen van Dextran door PBS, was het verschil in intensiteit tussen de pijler en de achtergrond ongeveer 1 per 1000 van het contrast van de eerste intensiteit tussen deze twee regio's in het bijzijn van Dextran. Opmerking dat neuronen op de bodem dekglaasje aan zowel op het PDMS dak houden kunnen. Dit effect verdwijnt wanneer met behulp van patroon coverslips (dat wil zeggen wanneer we niet zelfklevende moleculen in de vergaderzaal van het PDMS broeden doen), als de coating is dan ook strikt gelokaliseerd op de bodem van de kamer.
Afgezien van hun uitdagende morfologie, neuronen zijn eerder geschikt voor FXm wijten aan het feit dat een van de belangrijkste beperking van de methode, d.w.z. dextran endocytose, zeer beperkt is in deze cellen. We kiezen een 10 kDa formulering te onderdrukken in de lange bereik (uren) verschijnselen zichtbaar endocytose.
Kortom, is de conceptuele eenvoud van FXm gecompenseerd door een aantal experimentele problemen die zijn opgelost door het huidige protocol, zoals nanometric PDMS ruwheid en Micrometrische kamer hoogte of achtergrondcorrectie om te corrigeren voor de oneffenheden van het PDMS plafond tussen pijlers. Echter, het gebruik van een nauwe microfluidic kamer te beperken van het fluorescerende medium levert een paar specifieke beperkingen zoals de noodzaak van steun de pijlers, die het effectieve oppervlak beschikbaar voor cel adhesie, of de noodzaak verlaagt om het soma uitsluiten van de centrale kamer te observeren van neuronale extensies met de hoogste helderheid, die de regio's van de cel die toegankelijk zijn voor hoge resolutie observatie beperkt. Een mogelijke evolutie van deze methode zou zijn om zich te ontdoen van deze fysieke opsluiting, worden vervangen door een optische. De nieuwe ontwikkeling van lichte blad microscopie kan gecombineerd worden voordelig met FXm in de toekomst.

De precieze kennis van cellulaire volume heeft verhoogde aandacht getrokken in het afgelopen jaar, gedreven door de kwestie van de cel grootte homeostase in eencellige micro-organismen 1 , en meer in het algemeen in mitotische cellen 2. De vraag van cel volume is echter relevant ook voor post mitotische cellen, waarvoor neuronen een paradigmatische voorbeeld vormen.
Volume is inderdaad een belangrijke handtekening van fysiologische en pathologische gebeurtenissen op verschillende schalen en tijdstippen in neuronale leven, van voorbijgaande axonale vervorming geassocieerd met elektrische activiteit (milliseconde schaal) 3 tot en met de onomkeerbare neuronale zwelling die zich voordoen tijdens de asymptomatische fase van neurodegeneratieve ziekten (jaren bij de mens) 4. Echter, de grootste volumeverandering gebeurt in een tussentijdse tijdschaal voor dagen of weken (afhankelijk van het beschouwde organisme) tijdens de neuronale groei. De uitgebreide en complexe morfologie van neuronen aanleiding tot veelvouden kwesties, waaronder de regulering van de celgrootte. Axonale lengte en diameter zijn inderdaad strak gereguleerde in vivo, met waarden die specifiek zijn voor elke neuronale type 5,6.
Deze kwesties, complexe aan te pakken in vivo, kunnen ook worden behandeld in een vereenvoudigde manier in vitro. In dat streven, een methode die is gewijd aan de volumemeting snel genoeg groeidynamiek (d.w.z. binnen een tijdschaal van minuten) en compatibel met observatie over uren of dagen te volgen is vereist. Verschillende methoden zijn ontwikkeld in de jaren voor een directe of indirecte toegang tot cellulaire volume in vitro. Cel wederopbouw van confocal beeldvorming is een van hen, maar deze methode houdt labeling en herhaalde blootstelling aan licht terwijl een beperkte axiale resolutie van ongeveer 500 nm 7wordt weergegeven. Merk op dat deze twee laatste nadelen gedeeltelijk worden overwonnen door een meer verfijnd en recente methode met de naam lattice licht vel microscopie 8. Atomic Force microscopie is gebruikte 9 maar deze scanmethode gebruikt is door essentie traag en saai. Bovendien is het fysiek contact dat het vereist met de cel kan interfereren met de meting gezien de extreme zachtheid van neuronen 10. Indirecte methode met behulp van impedantie of resonantie hebben gewerkt voor andere cel typen 11, maar zijn niet voldoende voor uitgebreid zelfklevende cellen zoals neuronen.
Een van de meest veelbelovende methoden is gebaseerd op de maatregel van het uitgesloten volume van cellen in een nauwe kamer gevuld met een fluorescente kleurstof. De fluorescentie uitsluiting methode (ITA) is eenvoudig in het principe, want het vereist geen etikettering, en is geschikt voor optische beeldvorming van de snelle, op lange termijn van cel populaties met een potentieel sub optische axiale resolutie. Meer precies, hangt de resolutie in z af van de intensiteit van de maximale fluorescentie in de cultuur-zaal (dat wil zeggen regio verstoken van cellen) gedeeld door het dynamisch bereik van de camera, hoewel verschillende bronnen van geluidshinder deze uiteindelijke resolutie beperken. Deze methode is zeer krachtig te volgen van de omvang van de migratie Adherente cellen 12 of studeren volumeverandering tijdens de mitose van zoogdiercellen, zoals grondig beschreven in 13. Neuronen vormen echter een methodologische uitdaging voor FXm overwegen hun uitgebreide restanten in sub Micrometrische processen.
Wij presenteren hier een methode die leidt tot de fabricage van soepele FXm kamers tot met hoge precisie het volume en hoogte van neuronale takken en dynamische structuren die betrokken zijn bij de neuronale groei als de groei kegels.
Kamers moeten soortgelijke hoogten dan het object om te meten om te optimaliseren axiale resolutie. Daarom ontwierpen wij verschillende FXm apparaten gekenmerkt door centrale meting kamers van drie verschillende hoogtes. De dunste (3 µm in hoogte) is gewijd aan neurite meting: deze lage hoogte sluit soma, die in de in de omgeving van 15 µm hoge tussenliggende bedwelmingsruimte blijven. Dikkere midden kamers (10 en 12 µm) zijn voldoende hoog te volgen de hele celgroei. Het apparaat bevat ook twee reservoirs, gelegen aan weerszijden van de centrale kamer. Vier injectie gaten (IH) dus ten uitvoer worden gelegd en worden aangewezen als volgt: de inlaat en uitlaat dienen in te voeren van de cellulaire schorsingen in de chip, overwegende dat de twee anderen feed de reservoirs.
We hebben de eerste verzonnen kalibratie coverslips voor hoogte metingen met behulp van fotoresist structuren van de bekende meetkunde. We hebben vervolgens gratis groeiende neuronen, maar ook morfologisch beperkte neuronen beeld in micropatterns van hechting.

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Voor DRIE uitvoeren</td></tr><tr><td>MJB4 mask aligner</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 fotolitografie</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Mask aligner</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Fotolitografie geassocieerd met DRIE</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 37 &deg;C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Oven tussen 65 en 80 &deg;C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mechanical profilometer</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>Optical profilometer</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>Diameter 200 mm</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath sonicator</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>Volume van het bad: 0,8 liter</td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>Masks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>Aanvullende gegevens</td></tr><tr><td>Su8 Mask 1</td><td></td><td></td><td>Aanvullende gegevens</td></tr><tr><td>Su8 Mask 2</td><td></td><td></td><td>Aanvullende gegevens</td></tr><tr><td>Su8 Mask 3</td><td></td><td></td><td>Aanvullende gegevens</td></tr><tr><td>S1805 kalibratie strepen</td><td></td><td></td><td>Aanvullende gegevens</td></tr><tr><td>Klein laboratoriumapparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm gatjesponser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (US referentie)</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel of scheermes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9" Roestvrijstalen platte spatel met lepel</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>Om PDMS te ontvormen</td></tr><tr><td>Top Lip Wafer Handling</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>FST</td><td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td><td>Om glazen dekglasjes te manipuleren</td></tr><tr><td>Substraten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliconen wafer</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm glazen dekglasjes</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>Fotoresistors en ontwikkelaars</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 positieve fotoresistor</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Voor DRIE proces, dikte 1,8 &micro;m</td></tr><tr><td>AZ 351B ontwikkelaar</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Om positieve AZ 1518 fotoresistor te ontwikkelen</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA ontwikkelaar</td><td>Technic</td><td></td><td>Om SU-8 negatieve fotoresistor te ontwikkelen</td></tr><tr><td>Microposit S1805 resist</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Positieve fotoresistor gebruikt om 0,5&micro;m hoge structuren te verkrijgen</td></tr><tr><td>MF 26A ontwikkelaar</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Om positieve S1805 fotoresistor te ontwikkelen</td></tr><tr><td>Laboratoriumconsumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weggeef plastic pijpje 3 mL</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 Petri schotels</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>20 mL spuit</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Transparante plakband</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vierkante doekjes</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>Kunststof paraffine film</td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilaan</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS en uithardingsmiddel Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>poly-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluut</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99,8%</td></tr><tr><td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilaan</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML</td><td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>azijnzuur</td><td>Sigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10kW geconjugeerd met Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absoprtion bij 488 nm</td></tr><tr><td>Dextran 10kW geconjugeerd met Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absoprtion bij 647 nm</td></tr><tr><td>Kweekmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal zonder fenolrood</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Software</

hoge resolutie volume imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd microfluidic apparaten

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van neuronen op verschillende tijdschema's. Neuronen zijn vrij uniek cellen met betrekking tot hun uitgebreide vertakte morphologies en dus verschillende methodologische uitdagingen voor volumemeting te verhogen. In het bijzondere geval van de in vitro neuronale groei dient de gekozen methodologie sub Micrometrische axiale resolutie gecombineerd met full-veld Opmerking over tijdschema's van minuten tot uren of dagen. In tegenstelling tot andere methoden zoals cel vorm wederopbouw met behulp van de confocal imaging, elektrisch gebaseerde metingen of Atomic Force microscopie, heeft de onlangs ontwikkelde fluorescentie uitsluiting methode (ITA) het potentieel om te voldoen aan deze uitdagingen. Echter, hoewel ze eenvoudig zijn principieel, uitvoering van een hoge resolutie FXm voor neuronen vereist meerdere aanpassingen en een speciale methodologie. Hier presenteren we een methode gebaseerd op de combinatie van fluorescentie uitsluiting, lage-ruwheid meerdere compartimenten microfluidic apparaten, en tot slot micropatterning om in vitro metingen van lokale neuronale volume. De hoge resolutie geboden door het apparaat konden we voor het meten van het lokale volume van neuronale processen (neurites) en het volume van sommige specifieke structuren die betrokken zijn bij de neuronale groei, zoals groei kegels (GCs).

Het resultaat van het proces van fabricage beschreven in de punten 1 en 2 wordt geïllustreerd door de beelden van figuur 1A-1B en de curve van Figuur 1 c. De tabel van Figuur 1 d bevat de ruwheid waarden van twee verschillende representatieve gebieden van de PDMS-chip, dat wil zeggen in het midden en de 20 µm hoge volgende tussenliggende kamer. Een afname van de ruwheid met een factor van ongeveer 7 is verkregen met behulp van geëtste Si wafer in plaats van SU-8 fotoresist. Vervolgens, FXm werd eerst toegepast op een fotoresist streep van bekende meetkunde (figuur 2A) binnen een hoge kamer van 10 µm. Na de beeldverwerking en intensiteit naar hoogte conversie (Zie de grafiek van figuur 2B), FXm profielen uitgevoerd op dwarsdoorsneden langs deze streep (figuur 2C) bieden de gewenste hoogte profielen (figuur 2D). Figuur 2D geeft een vergelijking tussen profielen met behulp van mechanische profilometry en FXm methoden verkregen. Deze profielen, met inbegrip van rand en plateau waarde, zijn zeer vergelijkbaar, het valideren van de methode. De verstrooiing van FXm gegevens is niet representatief zijn voor de uiteindelijke resolutie van de methode, zoals nader beoordeeld in Figuur 3 en 4 van de figuur, maar resultaten uit de lage intensiteit gebruikt om te voorkomen dat een mogelijk effect van de zeer zwak auto-fluorescentie van de fotoresist in het GFP-kanaal.
Vervolgens zien we neurites in 3 µm en hoge kamers van 10 µm (Figuur 3). De standaarddeviatie van de achtergrondgeluiden is ongeveer 18 nm na intensiteit hoogte conversie en achtergrond correctie. Deze waarde is iets hoger dan de fysieke ruwheid van PDMS oppervlakken gegoten op silicium oppervlakken (12 nm, zie de tabel met Figuur 1 d) maar veel lager dan de ruwheid gemeten op PDMS van SU-8 mallen verkregen. Deze resultaten wijzen op de toegevoegde waarde van boren van waterputten in silicium wafers in plaats van het openen van gaten in de SU-8 fotoresist te werpen pijlers. Dergelijke lage waarde kan een hoog signaal / ruisverhouding en zeer heldere beelden in volume zoals weergegeven in figuur 3A. Als een voorbeeld van de gegevens die uit dergelijke beelden kunnen worden opgehaald, berekend we de hoeveelheid 1.6 µm (d.w.z. 10 pixels) breed neurite slice (Zie de grafiek van figuur 3B). In een eerste benadering met behulp van een lineaire vlaag van deze gegevens geeft een hoogtewaarde gemiddelde neurite van ongeveer 400 nm, moet worden vergeleken met bijvoorbeeld de 500 nm axonale diameter in 10 dagen oude pups binnen het corpus callosum 5 gevonden. Wij ook FXm gecombineerd met micropatterns wrijvingscoëfficiënt bestaande uit serieel abutted 2 µm en 6 µm brede strepen van 30 µm in lengte. Ons doel was het bestuderen van de invloed van de breedte van de neurite op de 3D-vorm. Figuur 3 c toont een 3D-weergave in valse kleuren van een afbeelding van de hele neuron verkregen in een hoge kamer van 10 µm. Neurites zaaien 2 µm en 6 µm brede strepen, overwegende dat het soma zich op het uiteinde van de grootste streep bevindt. Hoogte profielen opgesteld in drie verschillende doorsneden. In samenhang met de grafiek weergegeven in figuur 3A, het oppervlak geïntegreerd over de verhoging van de dwarsdoorsneden met de breedte van de neurite (figuur 3D).
We ook gericht op groei kegel (GC) 3D-structuren. Figuur 4 A-B toont twee verschillende GC profielen verkregen in een 3 µm hoge kamer, die wijzen op hun vertakte sub structuur. Daarnaast hebben we uitgevoerd time-lapse experimenten te volgen de dynamiek van het volume van GCs in een 12 µm hoge kamer. Figuur 4C geeft een cyclus van krimpen en reactivering van een bepaalde GC binnen een tijdsbestek van enkele tientallen minuten. Dankzij het gebruik van GFP-lifeact muizen, groei kegels waren gelokaliseerd in de golflengte van de emissie GFP (510 nm) van hun hoge actine-concentratie. Het oppervlak bij de golflengte geïdentificeerd werd gebruikt om te integreren over de dextran emissie golflengte op 647 nm voor het berekenen van de omvang van de GC. Figuur 4 d bevat ten slotte de verdeling van de omvang van de GC op verschillende tijdstippen en de locatie op drie verschillende neuronen, gecentreerd op een waarde van ongeveer 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figuur 1: FXm PDMS chambers. (A) de regelingen voor de vier verschillende hoofdstappen van microfabrication leiden tot de definitieve mal. De locatie van de inlaat, de uitlaat en de stuwmeren worden aangegeven. Schaal bars: 1 mm. (B) beeld van de kamer van de PDMS FXm verkregen met behulp van een optische profilometer. Dit beeld toont de centrale kamer met 3 rijen van 10 µm hoge pilaren en de tussenliggende kamers van 20, 50 en 90 µm in hoogte. Schaal bar: 500 µm. (C) transversale weergave van de chip langs de twee stippellijnen getekend in (B). Geel/goud: dwarsdoorsnede langs pijlers, blauw: doorsnede tussen pijlers. (D) betekenen de waarden van de ruwheid van het PDMS gemeten op 50 × 50 µm2 gebieden gegoten op silicium en op de 20 µm hoge SU-8 tussenliggende kamer (Zie pijlen voor de locatie van deze gebieden). Gemiddelde waarden werden verkregen van de metingen van drie verschillende gebieden. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figuur 2: kalibratie van FXm methode met behulp van een fotoresist streep als het object belangenverstrengeling. (A) GFP-fluorescentie foto genomen in een hoge kamer van 10 µm gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm bij 1 mg/mL. (B: achtergrond, P: pijler). Observatie met een droge 40 X NA 0.8 doelstelling. Schaal bar: 50 µm. (B) lineaire kalibratie recht verkregen van de gemiddelde intensiteit van de twee gekleurde rechthoeken weergegeven in A. (C) fluorescentie intensiteit profiel verkregen op het niveau van de blauwe, onderbroken lijn weergegeven in (A), overschrijding van de fotoresist streep (0,45 µm hoge positieve fotoresist). (D) de vergelijking van de profielen verkregen mechanische profilometer (zwarte stippen) en FXm na intensiteit naar hoogte conversie van de gegevens van (B) (blauwe stippen). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figuur 3: Neurite volume imaging. (A) Neurite zich uitstrekt in de centrale 3 µm hoge kamer van soma bevindt zich in de volgende 15 µm tussenliggende zaal. Imaging uitgevoerd met behulp van 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm en een 40 X, NA 0,8 droog doelstelling. Verzonken vlak van de verkregen na het gebruik van de achtergrond reductie routine hoogtepunten, de twee neurites en gekozen uitzetten in de grafiek aan de rechterkant. Schaal bars: 30 µm. (B) Neurite segment volume als een functie van de breedte van de neurite verkregen uit de 22 profielen (gemiddeld op 10 pixels, dat wil zeggen op een 1.6 µm "neurite slice") weergegeven in (A). De ononderbroken lijn vertegenwoordigt een lineaire vlaag van helling 0.4 µm passeren door de oorsprong. (C) valse kleurenafbeelding van een patroon neuron op een zelfklevende stripe gemaakt van opeenvolgende 2 µm en 6 µm breed stompen (vertegenwoordigd in wit). Metingen zijn verricht in een 10 µm hoge kamer gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 647 nm en het gebruik van een 40 x NA 0.8 droog doelstelling. (D) hoogte profielen overeenkomt met de gekleurde streepjeslijnen weergegeven in (C), houden het zelfde kleur code. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figuur 4: statische en dynamische groei kegel imaging. (A-B) Groei Kegel hoogte profielen verkregen in een 3 µm hoge kamer na intensiteit naar hoogte conversie langs de gele lijnen in gekoppelde afbeeldingen weergegeven. Observatie uitgevoerd met behulp van een opvulling met 10.000 MW dextran absorberende op 488 nm en een 40 X, NA 0,8 droog doelstelling. (C) hele neuron imaging in een 12 µm hoge kamer gevuld met 10.000 MW dextran absorberende op 647 nm. Waarnemingen zijn gedaan in twee fluorescerende kanalen: GFP voor groei kegel lokalisatie (gele stippellijnen) en CY5 voor het berekenen van de omvang van de GC van fluorescentie uitsluiting. Het oppervlak opgenomen door gele stippellijnen werd gebruikt voor het berekenen van de omvang van de GC. De grafiek toont de variatie van GC volume over tijd, en de bijbehorende morphologies in zowel GFP en CY5 kanalen op twee verschillende tijdstippen vertegenwoordiger. Alle gegevens zijn verkregen met behulp van een 40 x NA 0.8 droog doelstelling iedere 3 min. schaal bars: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>1:8 µm laag maskeren</td>
			<td>Masker 2:30 µm laag</td>
			<td>Masker 3:40 µm laag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 toeren per minuut</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zachte bak</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blootstelling energie</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposure bak</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ontwikkeling</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harde bak (optioneel)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 12 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 20, 50 en 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Maskeren van 1:10 µm laag</td>
			<td>Masker 2:30 µm laag</td>
			<td>Masker 3:40 µm laag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zachte bak</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blootstelling energie</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposure bak</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 6 min. @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ontwikkeling</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harde bak (optioneel)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 10 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 20, 50 en 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Maskeren van 1:12 µm laag</td>
			<td>Masker 2:32 µm laag</td>
			<td>Masker 3:40 µm laag</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-8 type</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
			<td>30 s @ 2500 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 rpm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zachte bak</td>
			<td>3 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Belichtingstijd</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post-exposure bak</td>
			<td>4 min @ 95 ° C</td>
			<td>1 min @ 65 ° C + 5 min @ 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min. @ 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ontwikkeling</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harde bak (optioneel)</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
			<td>3-5 min @ 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: fotolithografie stappen uitgevoerd om te bouwen van een apparaat met een centrale kamer van 3 μm in hoogte. Hoogten van de tussenliggende kamers: 18, 50 en 90 µm.
Aanvullende gegevens 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Schematische weergave van de maskers gebruikt voor het fabriceren van het PDMS apparaat (DRIE masker en maskers 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 2: bestand "masks_neuron_volume_chips.dxf". Elektronische bestanden, waardoor de DRIE masker en maskers 1-3 te fabriceren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". Elektronische bestanden, waardoor het masker gebruikt voor de fotolithografie van fotoresist strepen fabriceren. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 4: bestand conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 5: bestand importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Volume is een belangrijke parameter over fysiologische en pathologische eigenschappen van cellen. Beschrijven we een fluorescerende uitsluiting methode waardoor volledige-veld meting van in vitro neuronale volume met sub Micrometrische axiale resolutie die nodig zijn voor de analyse van neurites en dynamische structuren geïmpliceerd in neuronale groei.

Hoge resolutie Volume Imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd Microfluidic apparaten

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

Het algemene doel van deze procedure is om volledige veldmeting van in vitro neuronal volume mogelijk te maken met submicrometrische axiale resolutie die nodig is voor de analyse van neurites in dynamische structuren die betrokken zijn bij neuronaal groei. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van cellulaire neurowetenschap te beantwoorden over de dynamiek van volumeveranderingen op de subsidiale schaal tijdens de niet-groei of axon degeneratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze submicrometrische axiale resolutie biedt in combinatie met volledige pasvormobservatie en tijdschaal tot uren of dagen.Om de procedure te starten, ontvorm de PDMS-blok onder een chemische kap door isopropanol erop te gieten. Plaats het vervolgens op de roestvrijstalen werktafel van de kap. Snijd rond de siliconen wafer en ontvorm de PDMS replica.Snij vervolgens rond de chip en laat een marge van twee millimeter achter met een scalpel of scheermes. Pers de inlaat door de 1,5 millimeter diameter puncher stevig in en activeer deze om het gat van de inlaat te snijden en te kerven. Doe hetzelfde in de vier specifieke zones van de chip waar vloeistof zal worden geïnjecteerd.Vervolgens, reinig de chip door het plakband op de gemicrostructureerde kant te plakken en te pellen. Sprenkel isopropanol aan beide kanten. Droog vervolgens de chip met geperste stikstof met behulp van een luchtblazer.Bij deze procedure, plaats elke dekglas op een spin-coater in een schone kamer omgeving. Breng een druppel van de positieve fotoresist aan om ongeveer 75% van het dekglas te bedekken en spin-coat bij 4000 tpm gedurende 30 seconden om een einddepautik van 0,45 micrometer te bereiken. Plaats de dekglazen op een hotplate met een oppervlaktetemperatuur van 115 graden Celsius gedurende één minuut.Gebruik een maskeraligner om elke dekglas bloot te stellen aan een golflengte van 435 nanometer door het specifieke masker volgens de fabricant parameters. Bereid vervolgens twee glazen kristallisatie schotels voor, een bevat de ontwikkelaar zonder verdunning, de andere bevat gedeïoniseerd water. Dompel de dekglazen één voor één in de ontwikkelaar gedurende één minuut terwijl u het kristallisatie schaal continu en voorzichtig roert.Dompel vervolgens de wafer gedurende ongeveer vijf seconden in gedeïoniseerd water. Breng de wafer over naar een absorberend papier en droog het met geperste stikstof met behulp van een luchtblazer. Plaats zowel de PDMS-chip als het glazen schaal waarop deze zal worden gebonden in de plasmakamer voor oppervlakte activering.Plaats vervolgens een druppel water op een rechthoekige dikke microscoopglasplaat en plak het dekglas op de glasplaat door capillariteit. Markeer onder een microscoop de locatie van de fotoresist strepen aan de achterkant van de glasplaat. Plaats het gepaterde glazen dekglas op de maskerhouder van de maskeraligner.Vertrouw op de gemaakte markering om de fotoresist referentie objecten te centreren. Om de optische contrast te verhogen, plaats een siliciumwafer onder de PDMS-chip. De siliciumwafer moet stevig bevestigd blijven op de klemklem tijdens het aflijningsproces.Plaats vervolgens de PDMS-chip op de mobiele substraathouder van de maskeraligner. Vervolgens, til de klemklem voldoende op om zowel de chip als de array van fotoresist strepen op het dekglas te visualiseren terwijl u achter de mechanische contact blijft. Voer aflijning uit en bereik mechanische contact tussen de chip en het dekglas door de klemklem op te tillen tot het oppervlak van PDMS pilaren het glazen dekglas raakt.Verlaag daarna de klemklem. Verwijder het dekglas dat aan de chip is gebonden van de maskerhouder. Plaats vervolgens het apparaat in een 35 millimeter Petri schotel en breng alles over naar de oven gedurende vijf tot tien minuten om de bindingssterkte te verhogen.Dertig minuten na het binden, plaats een tiendre microliter pipettip gevuld met PLO-oplossing bij de inlaat. Laad vervolgens de vloeistof totdat een druppel erbovenop ontstaat. Herhaal dezelfde handeling bij de uitlaat en reservoirs.Voeg vervolgens PBS toe in de Petri schotel rond de chip. Verzegeld de Petri schotel met een paraffine film en incubeer op kamertemperatuur gedurende minimaal vijf uur. Druk vervolgens een tiendre microliter puntkegel lichtjes in elke injectieopening en zuig het overtollige vloeistof op.Vervang vervolgens PLO en het PBS rond de chip door het kweekmedium. Plaats vervolgens de chip in de incubator die is gereguleerd op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot neuronen zaaien met een minimale incubatietijd van vijf uur. Bij deze procedure, zuig het kweekmedium van de chip.Verzamel twee tot drie microliter van de vers opgeschorte celoplossing en injecteer deze bij de inlaat. Herhaal onmiddellijk dezelfde handeling bij de uitlaat. Injecteer ongeveer hetzelfde volume kweekmedium in elke reservoir.Observeer de chip snel onder de microscoop om de dichtheid van de cellen te controleren. De orde van grootte van de optimale celdichtheid komt overeen met ongeveer vijf tot tien cellen binnen de vierkante oppervlakte begrensd door vier pilaren. Herhaal de procedure van injectie van 0,5 tot 1 microliter celsuspensie om de beoogde celdichtheid te bereiken.Voor beeldvorming, vervang het kweekmedium met het beeldvormingsmedium. Plaats vervolgens de chip onder een epifluorescentiemicroscoop. Verzamel beelden van cellen van enkele tot meerdere opeenvolgende beelden in geval van time-lapse experimenten.Hier getoond zijn de representatieve observaties van een kalibratie fotoresist streep en neuronen. Hogere vergroting beelden en dwarsdoorsneden van deze objecten worden aan de rechterkant weergegeven. De representatieve neurites en een centrale kamer van drie micrometer hoog worden hier getoond.Het volume van de neurite snede kan worden berekend als functie van de neurite breedte. En hier zijn de representatieve groeikegels en een centrale kamer van drie micrometer hoog. Hun substructuren komen duidelijk naar voren uit een optische achtergrondruis van ongeveer 20 nanometer.Time-lapse observaties van levende act neuronen

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.

Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om de afbeelding fluorescent gelabelde cellen in semi-dikke hersenen plakken. Door de vaststelling van, snijden, en optisch clearing hersenweefsel beschrijven we hoe standaard epifluorescerende of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om individuele cellen en neuronale netwerken binnen intact zenuwweefsel te visualiseren.

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Retrograde transport van fluorescente kleurstof labelt een sub-populatie van neuronen op basis van anatomische projectie. Gelabelde axons kunnen visueel worden...

Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em&gt; In vivo</em

Een beeldvormende techniek voor de monitoring van membraanpotentiaal verandert met sub-micrometer ruimtelijke en minder dan een milliseconde tijdsresolutie wordt beschreven. De techniek is gebaseerd op laser-excitatie van voltage-sensitieve kleurstoffen, maakt metingen van signalen in de axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines.

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles' movement.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

We beschrijven hoe de uitvoering fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM)-gebaseerde studies van blaasjes in vaste, gekweekte neuronen. Belangrijke onderdelen van ons protocol etiket voorzien blaasjes met photoconvertible hersenschimmen, het verzamelen van een klein aantal RAW-afbeeldingen met een super-resolutie microscopie-systeem, en de verwerking van de ruwe beelden op de foto om een ​​super-resolutie te produceren.

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Hier presenteren we een microscopie gebaseerde protocol voor hoge resolutie beeldvorming en een drie-dimensionale reconstructie van de muis neurovasculaire eenheid en bloed - hersen barrière met behulp van vrij zwevende secties van de hersenen. Deze methode zorgt voor de visualisatie, analyse en kwantificering van intracellulaire organellen op de BBB.

Hoge resolutie Confocal beeldvorming van de bloed - hersen barrière: Imaging, 3D reconstructie en kwantificering van Transcytosis

Dit protocol beschrijft het gebruik van plastic fiches om cultuur en grendelen primaire lymfkliertest neuronen. Deze chips zijn voorgemonteerd, gebruiksvriendelijke en compatibel met hoge resolutie, levend, en fluorescentie beeldvorming. Dit protocol wordt beschreven hoe plaat rat hippocampal neuronen binnen deze chips en uitvoeren van fluidic isolatie, axotomy en immunokleuring.

Gebruik van vooraf geassembleerde kunststof Microfluidic Chips voor primaire lymfkliertest neuronen compartimentering

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Wanneer geïntegreerd met een kopplaat en een optisch ontwerp dat compatibel is met zowel enkelvoudige als twee-fotonmicroscopen, biedt de microprismalens een aanzienlijk voordeel bij het meten van neurale reacties in een verticale kolom onder verschillende omstandigheden, waaronder goed gecontroleerde experimenten in hoofdvaste toestanden of natuurlijke gedragstaken bij vrij bewegende dieren.

Langetermijnbeeldvorming van geïdentificeerde neurale populaties met behulp van microprisma's in vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren

Leer een fluorescerende uitsluitingsmethode voor hoogresolutie volumemeting van neuronen in vitro met submicrometrische axiale resolutie. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van neurietdynamica en groeiconi mogelijk.

Hoge resolutie Volume Imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd Microfluidic apparaten (Video) | JoVE Journal

Hoge resolutie Volume Imaging van neuronen met de uitsluiting van het gebruik van fluorescentie methode en gewijd Microfluidic apparaten

Meer video's verkennen