Enzymatische Cascade reacties voor de synthese van chirale Amino alcoholen van L-lysine
February 16th, 2018
Chirale amino alcoholen zijn veelzijdige moleculen voor gebruik als steigers in de organische synthese. Vanaf L-lysine, synthetiseren we amino alcoholen door een reactie van de enzymatische trapsgewijs combineren diastereoselective C-H oxidatie gekatalyseerd door dioxygenase gevolgd door splitsing van het carbonzuur deel van het overeenkomstige aminozuur van de hydroxyl door een decarboxylase.
Het algemene doel van deze procedure is om chirale amino-alcoholen te synthetiseren en te zuiveren, verbindingen met een breed scala aan toepassingen, van chirale auxiliaires voor organische synthese tot farmaceutische therapie. Dit is een opbrengstmeter om toegang te krijgen tot het chirale aminoalcohol, afgeleid van het natuurlijke aminozuur lysine in twee of drie enzymatische stappen in een procedure in één deel. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn de eenvoud van het protocol en de efficiëntie van de zuiveringsstappen.
De procedure wordt gedemonstreerd door Aurelie Fossey-Jouenne, de technicus van mijn laboratorium. Om de di-hydroxyleerde lysine-afgeleide te synthetiseren, voegt u hepes-buffer, l-lysine, alpaquita-glutaarzuur, natriumascorbaat en meer zout toe aan een 250 ml erlenmeyerkolf. Voeg dan water toe tot een eindvolume van 10 ml, rekening houdend met het volume van de enzymoplossing die moet worden toegevoegd.
Voeg de deoxygenase KD-01 toe tot een eindconcentratie van 0,075 mg per ml. Schud de reactiemengsel bij kamertemperatuur op 300 rpm gedurende de juiste duur. Na het mengen, breng 10mcl van het reactiemengsel over naar een 1,5 ml ependorfbuisje.
Voeg vervolgens natriumbicarbonaatoplossing, ethanol en 2,5 mg per ml DNFB-oplossing in ethanol toe. Sluit de microbuis en schud de oplossing gedurende 1 uur bij 1000 tpm en 65 graden Celsius. Wanneer u klaar bent, gebruikt u een minicentrifuge om de oplossing te laten bezinken.
Dood de reactiemengsel met 10mcl 1M zoutzuur. Vortex de oplossing en gebruik vervolgens een minicentrifuge om deze te laten bezinken. Gebruik een 1 ml-sluierpomp om het mengsel te filteren over een niet-steriele spuitfilter van 4 mm diameter, met een hydrofiele polyvinylideenfluoridemembraan met een doorsnede van 0,22 mcm.
Plaats vervolgens het gederivatiseerde reactiemengselmonster in een HPLC-instrument. Injecteer 10mcl in de C-18-kolom Gebruik een UV-detectie bij 400 nanometer om het product te analyseren. Wanneer de reactiebewaking een voltooide reactie aangeeft, voegt u alfaquita-glutaarzuur, natriumascorbaat en meer zout toe aan de kolf.
Voeg de deoxygenase KD-02 toe tot een geschatte eindconcentratie van 0,5 mg per ml. Berekend op basis van het aanvankelijke reactievolume. Schud het reactiemengsel bij kamertemperatuur op 300 tpm gedurende 18 uur.
Wanneer de reactiebewaking een voltooide reactie aangeeft, voegt u 100mcl van 100 millimolair DTT toe aan het reactiemengsel. Plus 100mcl van 100 millimolair PLP. Voeg gezuiverde decarboxylase Dccpin toe in een geschatte eindconcentratie van 0,5 mg per ml.
Berekend op basis van het aanvankelijke reactievolume. Schud vervolgens het reactiemengsel bij kamertemperatuur op 300 tpm gedurende 18 uur. Zodra de reactie voltooid is, koel het mengsel af door de kolf in een ijsbad te plaatsen.
Voeg voorzichtig 0,25 ml 6 molair HCl toe en schud het koude reactiemengsel voorzichtig tijdens de toevoeging. Breng nu het zure mengsel over in een 50 ml centrifugeerbuisje met conische bodem, met behulp van een glazen pasteurgeerbuis. Centrifugeer het mengsel bij 1.680 keer de zwaartekracht en 4 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Na centrifugatie, brengt u het supernatant over in een 250 ml ronde bodemkolf. Voeg vervolgens 10 ml gedeïoniseerd water toe aan de centrifugeerbuis met het pellet. Vortex om het pellet opnieuw te suspenderen.
Na het centrifugeren van het monster, brengt u het supernatant over in de ronde bodemkolf met het eerste supernatant. Bevriest de verzamelde supernatanten door de kolf in vloeibare stikstof te dompelen met constant handzwenken. Breng de kolf onmiddellijk naar een vriesdroger op tafel om te voorkomen dat het materiaal ontdooit.
Nadat het vriesdrogen is voltooid, verwijdert u de kolf uit de vriesdroger en voert u de zuiveringsstappen uit. Voor de biokatalytische decarboxylering van mono-hydroxyl L-lysines vertoonde de DC van S Rhumerentium activiteit voor alle mono-hydroxy lysines. Waarbij de beste conversie werd waargenomen voor de drie en vijf derivaten van de corresponderende chirale hydroxy-diamine.
Zoals verwacht, bleek Dccpin het meest geschikt voor de decarboxylering van 4R-hydroxy-L-lysine 2. Onder standaard reactieomstandigheden was de omzetting van 3S-hydroxy-L-lysine 1 in zijn gedecarboxyleerd tegenhanger 5 met DCcpin laag. En er werd geen activiteit waargenomen voor 5R-hydroxy-L-lysine.
Voor de biokatalytische decarboxylering van dehydroxy-L-lysines werd alleen 3R, 4R, dihydroxy-L-lysine 3 kwantitatief omgezet in de corresponderende dihydroxy-diamine 7 onder de standaard reactieomstandigheden. De omzetting van 45-dihydroxy-L-lysine 8 was matig, maar werd verbeterd door de enzymlading te verhogen. Noch PLP-DC was actief voor 35-dihydroxy-L-Lysine 9.
De enzymatische cascadereacties die kwantitatieve omzetting vertoonden, zoals bepaald door HPLC-bewaking, zijn met succes opgeschaald. De amino-alcoholen werden gezuiverd uit complexe enzymatische reactiemengsels en uitstekende opbrengsten werden gekenmerkt door NMR. Zodra deze enzymatische cascadesynthese en daaropvolgende zuivering is beheerst, kan deze in 48 uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat goede oxygenatie van de reactie belangrijk is voor de dioxygenatiereacties. Evenals een zorgvuldige bewaking, om ervoor te zorgen dat alle lysine is verbruikt voordat de dicarboxidase wordt toegevoegd. Het belangrijkste nadeel van dit protocol is de beperkte gesubsidieerde bereiken van het dioxygenase- en decarboxylase-enzym.
Niettemin kan biochatalitische synthese van verschillende amino-alcohol
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt de synthese en zuivering van chirale amino alcoholen afgeleid van L-lysine via een enzymatische cascadereactie. De procedure benadrukt de eenvoud en efficiëntie van de methode, waardoor deze geschikt is voor verschillende toepassingen in organische synthese en farmaceutische therapie.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Organische Chemie
- Biochemie
- Enzymatische Reacties
Achtergrond
- Chirale amino alcoholen zijn belangrijke skeletten in organische synthese.
- Ze hebben toepassingen in farmaceutische therapie.
- De synthese omvat het gebruik van natuurlijke aminozuren als uitgangsmaterialen.
- De methode streeft ernaar de syntheseproces te vereenvoudigen met behoud van hoge opbrengsten.
Doel van Studie
- Chirale amino alcoholen synthetiseren uit L-lysine.
- Een efficiënt zuiveringsproces demonstreren.
- Een eenvoudig protocol voor onderzoekers bieden.
Gebruikte Methoden
- Enzymatische cascadereactie die C-H oxidatie en decarboxylering combineert.
- Gebruik van hepes buffer en natriumascorbaat in het reactiemengsel.
- Zuiveringsstappen ontworpen voor efficiëntie.
- Demonstratie door een laboratoriumtechnicus.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle synthese van di-hydroxyleerde lysinederivaten.
- Hoge opbrengsten van chirale amino alcoholen bereikt.
- Protocol toonde eenvoud in uitvoering.
- Mogelijke toepassingen in verschillende vakgebieden benadrukt.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare benadering voor de synthese van chirale amino alcoholen.
- Efficiëntie en eenvoud maken het geschikt voor bredere toepassingen.
- Toekomstig onderzoek kan mogelijk extra toepassingen van gesynthetiseerde verbindingen verkennen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This enzymatic cascade method enables efficient synthesis of chiral amino alcohols from L-lysine, offering a biocatalytic alternative to multi-step organic synthesis. It supports early-stage target validation by providing optically enriched scaffolds for medicinal chemistry exploration. The protocol’s simplicity and high yields facilitate rapid access to structurally diverse compounds for hit-to-lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chiral amino alcohol scaffolds as potential bioactive motifs in drug discovery.
- Operational Value: Provides stereochemically defined building blocks from a natural amino acid precursor.
- Predictive Value: Supports structure-activity relationship studies through access to enantiomerically enriched compounds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, HPLC-monitored outputs for reaction progression and intermediate tracking.
- Operational Value: Uses DNFB derivatization and SPE purification to enable reproducible compound isolation.
- Assay Readiness: Delivers purified amino alcohols suitable for downstream screening or biochemical profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Produces chiral amino alcohols with retained stereocenters, relevant for exploring CNS-targeted or enzyme-inhibitor scaffolds.
- Operational Value: Scales to semipreparative levels (93%->95% yield) enabling sufficient material for preliminary pharmacological testing.
- Translational Continuity: Connects enzymatic synthesis to potential pharmaceutical applications via established chiral auxiliary utility.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling lead identification through rapid generation of chiral intermediates from lysine.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing access to modified lysine derivatives with defined regiochemistry and stereochemistry.
- Screening: Enables compound preparation via HPLC-monitored reactions and SPE purification for consistent input to screening cascades.
- Analytics: Relies on HPLC-UV detection at 400 nm post-DNFB derivatization for quantitative monitoring of oxidation and decarboxylation steps.
- Translational Research: Generates scaffolds with pharmaceutical relevance as chiral auxiliaries and potential therapeutic motifs.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular enzymatic cascade platform adaptable to other amino acid derivatives via enzyme substitution.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in synthesizing chiral β/γ-hydroxy amino acids via enzymatic regio- and diastereocontrol.
- Operational Value: Combines two difficult oxidations and a decarboxylation in a one-pot protocol with simple quenching and filtration steps.
- Strategic Value: Lowers synthesis burden and timelines (48 h) compared to conventional multi-step routes, accelerating medicinal chemistry cycles.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chiral scaffolds by providing reliable access to enantiomerically enriched intermediates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic reaction setup, including buffer preparation and enzyme handling (KD-01, KD-02, Dccpin).
- Depends on instrumentation for HPLC monitoring and freeze-drying for sample preservation.
- Necessitates standardization of DNFB derivatization, quenching, and centrifugation protocols across batches.
- Involves adaptation considerations for enzyme specificity, as activity varies with hydroxylation pattern (e.g., 3S-, 5R-hydroxy lysines show low/no conversion).
- Limited by enzyme availability and substrate scope, particularly for dioxygenase and PLP-dependent decarboxylase variants.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Semi-preparative One-pot Biocatalytic Reaction, Reaction Monitoring, and Product Analysis
3:17
Semi-preparative One-pot Biocatalytic Reaction: Second and Third Steps
6:01
Results: Investigation of Pyridoxal Phosphate Dependent Decarboxylase (PLP DC) Activities towards Hydroxy Lysine Derivatives
7:56
Conclusion
