Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om een preklinisch muismodel te ontwikkelen om de rol van extracellulaire blaasjes-gemedieerde communicatie tussen tumor en mesenchymale stamcellen te bestuderen. Deze methode kan helpen om verschillende belangrijke vragen in het gebied van kankerbiologie te beantwoorden, zoals hoe tumor en mesenchymale stamcellen communiceren door middel van extracellulaire blaasjes, en of dit de kankerprogressie ondersteunt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om de rol van adaptatie van mesenchymale stamcellen door kanker EV's te bestuderen, op de progressie en metastasevorming in vivo.

De implicatie van deze procedure strekt zich uit tot onze behandeling van kanker, omdat we GSA kunnen gebruiken om EV-communicatie en androgeensignalering te verstoren om kankerprogressie te remmen. Naast het verschaffen van inzichten in de EV-gemedieerde communicatie in osteosarcoom, kan deze methode ook worden toegepast op vele andere kankersoorten. Inderdaad, beenmerg afgeleid van de mesenchymale stamcellen worden gemakkelijk gerekruteerd naar meer locaties waar ze zich kunnen differentiëren in kankerondersteunende cellen.

Begin met het zaaien van acht flessen van 175 vierkante centimeter met elk 3 miljoen 143B cellen. Kweek de cellen met EV-vrij medium gedurende 36 tot 48 uur. Wanneer de cellen 80 tot 90% conflueert zijn, verzamel de supernatanten van de acht flessen voor EV-isolatie.

Gebruik vervolgens differentiële centrifugatie om alle cellen en celresten uit het supernatant te verwijderen. Dit bestaat uit herhaalde centrifugaties bij vier graden Celsius, met maximale acceleratie en deceleratie. Verzamel na elke centrifugatiestap het supernatant, en laat een milliliter van het supernatant in de centrifugeerbuis achter.

Laad nu een vooraf geklaard supernatant in ultracentrifugebuizen op 38,5 milliliter per buis. Gebruik vervolgens een ultracentrifuge bij 70.000g gedurende één uur, met een langzame stop en bij vier graden Celsius om de EV's te isoleren. Verwijder na de ultracentrifugering voorzichtig het supernatant, waarbij ongeveer één milliliter achterblijft.

Resuspendeer vervolgens de EV-bevattende pellets in het resterende volume. Verzamel alle suspensies. En was de gepoolde suspensies met PBS.

Vul de buis tot 38,5 milliliter. Herhaal vervolgens de ultracentrifugeringscyclus, maar gebruik geen stop. De rotor zou na ongeveer een uur moeten stoppen met draaien.

Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren, en laat 100 tot 200 microliter oplossing achter. Resuspendeer ten slotte het EV-pellet en pas het eindvolume aan tot 200 microliter met PBS. De EV's kunnen vervolgens worden gekarakteriseerd door TEM, gelabeld met kleurstoffen voor opname-experimenten, of worden gebruikt om mesenchymale stamcellen te onderwijzen voor in vivo-experimenten.

Het is cruciaal dat de primaire MSC's op de juiste celdichtheid zijn voordat ze worden blootgesteld aan kanker EV's. De cel moet ongeveer 70% conflueert zijn om een optimale cel-EV-verhouding te bereiken en ook overgroei tijdens educatieperioden te voorkomen. Dit experiment gebruikt geacclimatiseerde volwassen Athymische Nude-Foxn1nu muizen.

Een dag voor de chirurgische procedure, bied paracetamol via het drinkwater. Op de dag van de chirurgie, bereid 143B cellen voor op 200.000 per microliter in PBS. 20 minuten voor de chirurgie, geef het dier buprenorfine.

Net voor de anesthesie, vul een 10 microliter spuit met de geconcentreerde 143B cellen. Na bevestiging van goede anesthesie en het aanbrengen van oogzalf, plaats het dier op zijn rug met zijn achterste poten richting de operator. Bevestig vervolgens een anesthesiemasker aan het dier.

Buig vervolgens het linkerknie en veeg de huid schoon met drie wisselende scrubs van 70% ethanol en povidon-jodium, en breng vervolgens 2% lidocaine aan als lokaal verdovingsmiddel. Maak nu een kleine insnijding in de huid net onder de knie om de tibia bloot te leggen. Maak vervolgens met een microtwistboor van 0,8 millimeter een gaatje in de tibia, ongeveer 2 millimeter onder de knie.

Vermijd het boren door beide tibia cortices. Injecteer vervolgens langzaam één microliter cellen in het gat gedurende ongeveer vijf seconden. Sluit vervolgens het gat met een druppel weefsellijm om terugstroming van de suspensie te voorkomen.

Voltooi de operatie door de huid te sluiten met hechtingen en een druppel weefsellijm. Laat het dier herstellen met verwarming en behandel het met paracetamol gedurende 24 uur. Twee dagen later, gebruik een 0,5 millimeter insulinesyringe om de MSC's in de staartader te injecteren.

Juiste toediening tijdens een staartvene-injectie kan visueel worden bevestigd. Als er een wit gebied verschijnt, of als u weerstand ondervindt, injecteer dan opnieuw op een gebied boven de vorige injectieplaats. Volg vervolgens twee keer per week de tumorgroei met behulp van bioluminescentie.

Injecteer de muizen met D-luciferine via een insulinesyringe en meet 10 minuten later de fotonflux gegenereerd door de tumorcellen met behulp van een beeldvormingssysteem. Wanneer de tumordiameter van een dier groter wordt dan 15 millimeter, of zijn gewichtsverlies 15% overschrijdt, euthaniseer het dier en verzamel alle relevante weefsels. 10 minuten voor de euthanasie, injecteer D-luciferine, zoals eerder gedaan voorafgaand aan de beeldvorming.

Na euthanasie, verzamel de longen, lever, milt en nieren, met behulp van gesteriliseerde schaar en pincetten. Was het bloed van de organen met behulp van PBS, en schik ze op een petrischaaltje voor beeldvorming. Gebruik een bioluminescentiebeeldvormingssysteem om beide kanten van de organen te documenteren.

Zodra de beelden zijn genomen, fixeer de organen onmiddellijk voor toekomstige histologische analyse. Gebruik eenvoudig manuele drempelbepaling om de fotodocumenten te verwerken, en tel het aantal knobbeltjes in elke foto. Zorg ervoor dat u dezelfde drempel gebruikt voor elke foto, en documenteer de weefsels van elke kant, vooral de longen.

Na decalcificatie van de muizentibia, ga verder met dehydratie en paraffine-inbedding. Gebruik vervolgens een microtoom om zes-micron paraffine