Methoden voor Staging pop perioden en meting van de pigmentatie van de vleugel van Drosophila guttifera

Het algemene doel van dit experiment is om poppenperioden te bepalen en de vleugelpigmentatie van Drosophila guttifera te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het veld van evolutionaire ontwikkelingsbiologie, zoals hoe pigmentatiepatronen zich ontwikkelen in Drosophila. Het grote voordeel van deze techniek is dat we gedetailleerde informatie kunnen verkrijgen over de morfologische ontwikkeling en het pigmentatieproces.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de morfologische ontwikkeling en het pigmentatieproces van Drosophila guttifera, kan deze worden toegepast op andere Drosophila-soorten. Om met de verwijdering van het popparium te beginnen, bevestig een stuk dubbelzijdig plakband op een stuk keukenpapier. Plaats een pop op het dubbelzijdige plakband, met de ventrale zijde naar boven.

Lokaliseer de ruimte tussen de voorzijde van het popparium en de interne pop. Grijp en verwijder het popparium rond deze opening met behulp van een pincet. En leg de voorzijde van het hoofd van de pop bloot.

Steek de punt van een pincet door deze parallel te bewegen aan de voor-achter-as. Til de punt van het pincet op om lokaal het popparium te breken. Herhaal deze actie totdat de breuk het achterste deel van het popparium bereikt.

Zorg ervoor dat er een opening ontstaat tussen het popparium en de poppenpoten. En breek de ventrale zijde van het popparium terwijl u schade aan de interne pop minimaliseert. Nadat u het popparium zoveel mogelijk hebt gebroken, haalt u de pop eruit met een fijne verfkwast.

Plaats de pop op een stukje tissuepapier dat is bevochtigd met ddH2O en in een plastic petrischaal. Maak onmiddellijk foto's, omdat de blootgestelde pop kwetsbaar is en gemakkelijk uitdroogt. Ga verder met de beeldvoorbereiding en verwijder het voorste deel van het popparium met behulp van een pincet.

Haal de pop eruit en plaats deze in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS, in een plastic petrischaal. Knip vervolgens de basale verbinding van een vleugel door. Aangezien de vleugel is opgevouwen, plaatst u deze in een plastic petrischaal gevuld met ddH2O om deze uit te rekken door osmotische druk.

Verzamel eenmaal per 10 minuten pas uitgekomen volwassenen uit een voorraadbestand. Verdoofd een vlieg met behulp van een CO2-verdovingspad. Bevestig de verdoving door onbeweeglijkheid en knip de basale verbinding van een vleugel door.

Druppel 10 microliter PBS op een glasplaat. Plaats de vleugel in de druppel. En dek de druppel af met een dekglas.

Schakel vervolgens het licht van de stereomicroscoop in en stel het in op maximaal. Stel het objectief op 11,5x en stel de diafragma op de meest open staat. Schakel vervolgens de camera in en stel de camera in.

Concentreer u op het monster door de scherpstelknop van de microscoop te bewegen. Druk op de sluiterknop van de afstandsbedieningseenheid om een ​​afbeelding te maken. Maak een afbeelding van de vleugel, met een campaniform sensillum in het midden, waarbij het distale deel van de vleugel aan de linkerkant en het binnenste deel van de vleugel aan de bovenkant is gepositioneerd.

Open een afbeelding met een campaniform sensillum-stip in het midden. Klik op Afbeelding, Type 1, 8-bits, om de afbeelding om te zetten in een 8-bits afbeelding. Klik op rechthoek in de gebiedselectietools en teken een rechthoek.

Stel de rechterkant van de rechthoek in zodat deze zich rechts van de campaniform sensillum-stip bevindt. Klik op Bewerken, Selectie, Toevoegen aan beheerder en controleer vervolgens de kolom Alles weergeven. Klik vervolgens op hoekgereedschap in de lijnselectietools.

Teken de eerste lijn op de achterste lijn van de derde lengteader. Stel de linkereindpunten van de lijn op het hoekpunt van de eerder getekende rechthoek. Teken de tweede lijn aan de bovenkant van de rechthoek.

Druk op de M-toets om de hoek tussen de twee lijnen te meten die in deze stap zijn getrokken. Klik op het venster van de afbeelding op het scherm van de computer. Klik op Bewerken, Selectie, Toevoegen aan beheerder.

Klik op rechthoek in de gebiedselectietools en teken een rechthoek van ongeveer 1/9de van de grootte van het beeldvenster. Klik op Bewerken, Selectie, Roteren. Schrijf de mingraden van de eerder gemeten hoek in de kolom Hoek en klik op OK om de in deze stap getekende rechthoek te roteren.

Verplaats de getekende rechthoek met behulp van de pijltoetsen en stel het eindpunt van de achterste lijn van de tweede lengteader aan de linkerkant van de rechthoek. En de onderkant van de rechthoek, bevestigen aan de achterste lijn van de derde lengteader. Bevestig dat er een loodrechte lijn van het eindpunt van de tweede lengteader tot de achterste lijn van de derde lengteader is getrokken.

Definieer het voetpunt van de loodrechte lijn als punt A.Noteer de X-coördinaat en de Y-coördinaat van punt A, geïndiceerd onder gebiedselectietools wanneer u de cursor op punt A plaatst.Open de afbeelding met punt A in het midden. Klik op Afbeelding, Type, 8-bits, om de afbeelding om te zetten in een 8-bits afbeelding. Klik op rechthoek in de gebiedselectietools en teken een rechthoek van ongeveer 1/9de van de grootte van het beeldvenster.

Klik op Bewerken, Selectie, Specificeren. Vink de kolom Ovaal en Gecentreerd aan. Schrijf 100 pixels in de kolommen breedte en hoogte.

Schrijf de X-coördinaten van punt A in de X-coördinatenkolom en schrijf de Y-coördinaten van punt A in de Y-coördinatenkolom, klik vervolgens op OK. Klik vervolgens op Analyseren en Meten. Als de kalibratie al is voltooid, worden OD's weergegeven in de kolom Gemiddelde. Door de gegevens van meerdere stadia te vergelijken, bleek dat stadium P12 het tijdstip van het begin van de pigmentatie is en dat de pigmentatie 12 uur na het uitkomen is voltooid.

Na de ontwikkeling biedt deze techniek onderzoekers op het gebied van evolutionaire ontwikkelingsbiologie een manier