Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis
21 december 2017
We presenteren een nieuwe aanpak karakteriseren van tumorcellen. We immunofluorescentie gecombineerd met DNA TL -in-situ-hybridisatie te evalueren van cellen gevangen genomen door een functionalized medische draad staat in vivo verrijken CTCs rechtstreeks uit bloed van de patiënt.
Het algemene doel van dit protocol is om immunofluorescentiekleuring te combineren met DNA-fluorescentie in situ hybridisatie op een 3D gefunctionaliseerde draad en om immunofenotype en FISH-signalen op de ondersteuning te identificeren met behulp van een conventionele breedveldfluorescentiemicroscoop. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van secretoire tumorcelkarakterisering te beantwoorden, zoals het identificeren van therapiegerelateerde doelen op circulerende niet-kleincellige longkankercellen. Het grote voordeel van dit protocol is dat het de gelijktijdige identificatie van fenotypische parameters zoals EpCAM-positiviteit en cytosomatische veranderingen zoals ARC-genstatus mogelijk maakt om veronderstelde CTC's te detecteren.
Hoewel deze methode uniek is ontworpen om in situ insuline-kanker CTC-kenmerken te bieden, kan deze ook worden toegepast op het onderzoek van andere kanker zoals borstkanker. We ontwikkelden dit protocol tijdens het hanteren van de draad voor directe immunofenotypering en CTC-detectie. Om meer gegevens te verkrijgen, hebben we een immunofenotyperingsprotocol gecombineerd met een DNA-fluorescentie in situ hybridisatieprotocol.
Het hanteren van de draad is niet eenvoudig, voornamelijk omdat het gefunctionaliseerde uiteinde kwetsbaar is. Een visuele demonstratie zal de lezers helpen de stappen te reproduceren. Om het experiment te beginnen, hersuspendeer de volledige inhoud van een T75-kolf die 80% confluentie heeft in een vijf milliliter vial met behulp van vier milliliters compleet medium.
Verwijder vervolgens de draad uit de glazen verpakking. Dompel het gefunctionaliseerde gouden deel van de draad in de vial, zorg ervoor dat de draadstopper een waterdichte pasvorm heeft voor een vijf milliliter vial. Verzegel de draad met laboratoriumfolie.
Incubeer vervolgens de draad gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een buisrotor. Na de rotatie, spoel de draad drie keer af in eenvoudig PBS-oplossing met behulp van drie verschillende schone vials en wacht tot de draad is opgedroogd. Na het 10 minuten laten drogen van de draad in een afzuigkap, fixeer de cellen door de draad 10 minuten in een 100% acetonoplossing in een vijf milliliter buis te dompelen bij kamertemperatuur.
Zorg ervoor dat er geen spoor van aceton op het gefunctionaliseerde uiteinde is. Laat de draad 5 minuten op kamertemperatuur drogen. Was vervolgens de draad twee keer in eenvoudig PBS in een vijf milliliter buis.
Incubeer de draad in antilichaamverdunningsbuffer. Bereid 150 microliters antilichaammix met een verdunning van monoklonaal primair antilichaam geconjugeerd met fluorochroom en antilichaamverdunningsbuffer zoals gespecificeerd in de datasheet. Gebruik vervolgens een P200 tip om de draad uit de draadstopper te extraheren en voer de draad voorzichtig door het grotere gat van de tip.
Voer het niet-gefunctionaliseerde uiteinde eerst in en trek de draad langzaam door het kleinere gat totdat het gouden deel net voorbij het grotere gat komt. Voeg voorzichtig 150 microliters van de antilichaammix toe aan de tip. Om het risico van bubbelvorming te vermijden, draai de draad voorzichtig totdat het gefunctionaliseerde uiteinde volledig is ondergedompeld.
Verzegel het gat van de tip en wikkel laboratoriumfolie rond het gat. Incubeer de draad verticaal gedurende een nacht in het donker bij vier graden Celsius. Op de tweede dag, blokkeer de antilichaamincubatie door de draad twee keer in eenvoudig PBS te wassen.
Plaats de draad opnieuw in zijn draadstopper. Drie uur voor het DNA-FISH-protocol, stel de hybridisatieoven in op 75 graden Celsius en stel de droogteoven in op 37 graden Celsius. Koel de 0,4-voudige SSC-oplossing af tot vier graden Celsius.
Was de draad drie keer in ijskoud 0,4-voudig SSC-oplossing. Droog de draad 10 minuten in het donker onder de afzuigkapkast. Na 10 minuten, vortex en draai de sonde gedurende vijf seconden.
Laat 10 microliters van de sonde vallen in glazen microbuisjes en bedek ze vervolgens met laboratoriumfolie. Wikkel de microbuisjes in droog absorberend papier. Plaats ze in een 50 milliliter buis en draai ze kort door.
Plaats de gedrooide draad voorzichtig in het microbuisje en steek de draadstopper erdoor. Verzegel de draadstopper vervolgens met rubbercement. Plaats de draad in een donkere vochtige kamer in de hybridisatieoven gedurende acht minuten bij 75 graden Celsius om volledige DNA-denaturatie te verkrijgen.
Na acht minuten, verplaats de vochtige kamer naar een droogteoven bij 37 graden Celsius voor een nacht. Plaats de schuifkleuringsvat met 0,4-voudig SSC-oplossing in een waterbad ingesteld op 72 graden Celsius. Controleer de temperatuur van de 0,4-voudig SSC-oplossing totdat deze 72 plus of min één graad Celsius bereikt.
Bereid vervolgens twee glazen bekers voor. Een met tweevoudig SSC plus 0,05% Tween-oplossing en de tweede met gedistilleerd water. Verwijder de vochtige kamer voor de droogteoven.
Gebruik pincetten om voorzichtig het rubbercement van de draadstopper te verwijderen en trek het niet-gecoate uiteinde van de draad door de eindstopper, zorg ervoor dat u het gefunctionaliseerde uiteinde niet beschadigt. Dompel de draad twee minuten in de 0,4-voudig SSC-oplossing bij 72 graden Celsius. Was de draad 30 seconden in tweevoudig SSC plus 0,05% Tween-oplossing bij kamertemperatuur.
Was vervolgens de draad in gedistilleerd water bij kamertemperatuur. Droog de draad 10 minuten in het donker onder de afzuigkap. Incubeer het gefunctionaliseerde uiteinde van de draad met eerder bereide DAPI-oplossing in een tweedubbele milliliterbuis.
Spoel de draad twee keer af in eenvoudig PBS en laat de draad drogen. Plaats de draad in de draadhanger en voer voorzichtig het gefunctionaliseerde uiteinde in via het invoerpunt van de speciale houder totdat het uiteinde overeenkomt met het koppelpunt. Plaats de special
Overzicht
Deze studie introduceert een nieuwe methode voor het karakteriseren van tumorcellen door immunofluorescence te integreren met DNA fluorescent in situ hybridisatie (FISH). De benadering maakt gebruik van een functionele medische draad om circulerende tumorcellen (CTCs) direct uit het bloed van patiënten te verrijken, wat de identificatie van belangrijke immunofenotypische en genetische markers vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Oncologie
- Celbiologie
- Diagnostische methoden
Achtergrond
- Karakterisering van circulerende tumorcellen is cruciaal voor kankerdiagnose en -behandeling.
- Huidige methoden hebben vaak niet de mogelijkheid om meerdere parameters gelijktijdig te beoordelen.
- Deze studie heeft tot doel de detectie en analyse van CTC's bij niet-kleincellige longkanker te verbeteren.
- Het protocol kan ook worden aangepast voor andere kankertypen, zoals borstkanker.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen dat immunofluorescence en DNA-FISH combineert voor CTC karakterisering.
- Om therapie-gerelateerde doelen op CTC's te identificeren.
- Om het begrip van tumorcelbiologie te verbeteren door gelijktijdige analyse van fenotypische en genetische kenmerken.
Gebruikte methoden
- Functionele draad voor het vangen van CTC's uit bloedmonsters.
- Immunofluorescence kleuring om het immunofenotype te beoordelen.
- DNA-FISH om genetische afwijkingen te analyseren.
- Microscopie voor beeldvorming en dataverwerving.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van CTC's met specifieke immunofenotypische markers.
- Detectie van genetische afwijkingen geassocieerd met tumorkarakteristieken.
- Aangetoonde haalbaarheid van de methode voor verschillende kankertypen.
- Protocol maakt reproduceerbaarheid en gebruiksgemak in laboratoriumomgevingen mogelijk.
Conclusies
- De gecombineerde immunofluorescence en DNA-FISH methode is effectief voor CTC karakterisering.
- Deze benadering kan inzichten bieden in tumorbiologie en behandelingsdoelen.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot andere maligniteiten buiten longkanker.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method addresses the critical challenge of rare circulating tumor cell (CTC) detection by enabling high-volume blood sampling and simultaneous phenotypic and genetic analysis. By integrating immunofluorescence and DNA FISH on a 3D functionalized wire, it provides a scalable approach for CTC enrichment and characterization directly from peripheral blood. The workflow supports early discovery efforts by delivering multiplexed data on cell surface markers and chromosomal alterations, informing target validation and patient stratification strategies in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic targets through simultaneous detection of EpCAM positivity and ALK gene translocation in captured CTCs.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by correlating phenotypic markers with cytogenetic alterations in a single workflow.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing multiplexed data on putative CTCs for hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by capturing CTCs from large blood volumes (1.5–3 L) via 30-minute wire incubation.
- Reproducibility: Standardizes CTC isolation and immuno-DNA FISH processing on a 3D support, enabling consistent phenotypic and genetic readouts.
- Quantitative Output: Generates measurable immunofluorescence and FISH signals detectable via conventional widefield fluorescence microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated feasibility in NSCLC cell lines (NCI-H3122 and NCI-H1975) for EpCAM and ALK status, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking CTC phenotype to genotype in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in CTC characterization by co-localizing protein expression and gene status on individual cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, offering a reusable capability for CTC analysis across oncology indications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling simultaneous phenotypic and genetic profiling of rare CTC populations.
- Screening: Delivers assay-ready CTC samples with standardized isolation and staining protocols for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts (EpCAM intensity, ALK FISH signals) that allow comparative analysis across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant CTC characterization in NSCLC models.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform technology adaptable to multiple cancer types (e.g., breast cancer) and diverse antibody/FISH probe combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CTC biomarker studies by reducing mechanistic ambiguity through correlated phenotyping and genotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via a wire-based system compatible with conventional microscopy and standard reagents.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering multiparametric CTC data that inform target specificity and patient selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on CTC phenotype-genotype concordance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, DNA FISH, and delicate handling of functionalized wire tips to prevent damage.
- Depends on access to a conventional widefield fluorescence microscope with appropriate filter sets for DAPI, FITC, and Cy3/Cy5 equivalents.
- Necessitates cross-team standardization of wire preparation, incubation, and imaging protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to different cancer types or alternative phenotypic/genetic markers.
- Includes practical limitations such as the fragility of the wire’s functionalized tip and the need for hazardous material precautions (acetone, ovens).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Immuno-DNA FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) on Wire
2:35
Fixation, Permeabilization, and Immunofluorescence
4:25
3D DNA FISH Day 2
6:08
3D DNA FISH Day 3
7:51
3D Microscope Observation and Analysis
9:01
Results: No Interference Bewteen Immunofluorescence and DNA FISH Signals
9:38
Conclusion
