Name: Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer een snelle methode voor DNA-extractie uit tumorweefsel met touch imprint cytologie. Deze eenvoudige techniek levert hoogwaardig DNA voor next generation sequencing in kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken alle medische en ondersteunende medewerkers van het ziekenhuis en de patiënten voor toestemming om deel te nemen. Wij danken Gabrielle White Wolf, PhD, van de Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp van dit verslag. Deze studie werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor genoom-onderzoeksproject van de prefectuur Yamanashi (Y.H. en M.O.) en een subsidie van de YASUDA medische Foundation (Y.H.).

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Path+to+Cancer+-+Three+Strikes+and+You%27re+Out%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out.</a> N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).</li>
<li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+genome+atlas+pan-cancer+analysis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The cancer genome atlas pan-cancer analysis project.</a> Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li>
<li>Nagasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+variant+discovery+by+deep+whole-genome+sequencing+of+1%2C070+Japanese+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals.</a> Nat Commun. 6 (8018), (2015).</li>
<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genome+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer genome landscapes.</a> Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).</li>
<li>Zehir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+landscape+of+metastatic+cancer+revealed+from+prospective+clinical+sequencing+of+10%2C000+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients.</a> Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).</li>
<li>Garraway, L. A., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+the+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lessons from the cancer genome.</a> Cell. 53 (1), 17-37 (2013).</li>
<li>Chalkley, R., Hunter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-histone+propinquity+by+aldehyde+fixation+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).</li>
<li>Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixation+on+the+amplification+of+nucleic+acids+from+paraffin-embedded+material+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction.</a> J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).</li>
<li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li>
<li>Adhya, A. K., Mohanty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+touch+imprint+cytology+in+the+preoperative+diagnosis+of+malignancy+in+low+resource+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting.</a> Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).</li>
<li>Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+Imprint+Cytology+and+Frozen-section+Analysis+for+Intraoperative+Evaluation+of+Sentinel+Nodes+in+Early+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer.</a> Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).</li>
<li>Sumiyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+intraoperative+touch+smear+cytology+in+breast-conserving+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery.</a> Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).</li>
<li>Amemiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+imprint+cytology+with+massively+parallel+sequencing+%28TIC-seq%29%3A+a+simple+and+rapid+method+to+snapshot+genetic+alterations+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors.</a> Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).</li>
<li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+multiple+lung+cancers%3A+Discrimination+between+primary+and+metastatic+lung+cancers+by+genomic+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile.</a> Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).</li>
<li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+tumor-derived+DNA+dispersed+in+the+airway+improves+the+diagnostic+accuracy+of+bronchoscopy+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer.</a> Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+and+exome+sequencing+identified+somatic+mutations+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+two+amplicon-based+sequencing+panels+of+different+scales+in+the+detection+of+somatic+mutations+associated+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer.</a> BMC Genomics. 17 (1), 833(2016).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+HER2+V777L+mutation+mediates+resistance+to+trastuzumab+in+a+breast+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient.</a> Med Oncol. 34 (1), 3(2017).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+BRCA1+and+BRCA2+germline+mutations+in+Japanese+population+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).</li>
<li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigene+panel+analysis+identified+germline+mutations+of+DNA+repair+genes+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomic+Med%22%5BJournal%5D)">Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).</li>
<li>Lièvre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutation+status+is+predictive+of+response+to+cetuximab+therapy+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).</li>
<li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+or+Platinum-Pemetrexed+in+EGFR+T790M-Positive+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+rep%22%5BJournal%5D)">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci rep. 13 (3), 3493(2013).</li>
<li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 13 (7), 23(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie presenteerden we een alternatieve methode voor het verkrijgen van tumor DNA uit klinische pathologische monsters met behulp van de TIC. Voorbereiding van het TIC is zeer eenvoudig en minder tijd in vergelijking met FFPE methoden, zonder de behoefte aan speciale instrumenten10nodig heeft. Alle procedures van de TIC-voorbereiding voor DNA-extractie kunnen worden voltooid binnen twee dagen (Figuur 1). Deze methode dus verkort de doorlooptijd voor het uitvo...

Volgende generatie sequencing technologie heeft verstrekt onderzoekers aanzienlijke vooruitgang bij het analyseren van de genoominformatie in genetische variaties, Mendelian ziekte, erfelijke aanleg en kanker 1,2,3 . De kanker genoom Atlas (TCGA) en de internationale kanker genoom Consortium (ICGC) hebben de identificatie van genetische wijzigingen in de verschillende soorten gemeenschappelijk kankers4nagestreefd. Honderden essentiële stuurprogramma kankergenen met succes zijn geïdentificeerd, en sommige van deze moleculen worden gericht voor drug ontwikkeling1,5,6.
In de klinische setting, worden FFPE specimens vaak gebruikt voor pathologische diagnose en moleculaire tests voor verschillende ziekten, waaronder kanker. Echter tijdens de fixatie met formaline, DNA-eiwit of DNA-DNA dwarsbinding optreedt en fragmentatie van DNA wordt geïnduceerd. Dus, FFPE DNA-monsters zijn niet altijd geschikt voor genetische analyse vanwege de lage kwaliteit en kwantiteit van DNA7,8,9. Bovendien duurt het enkele dagen te bereiden FFPE specimens en technische vaardigheid nodig is om te nauwkeurig bereiden de secties. Daarom is het wenselijk een eenvoudige en snelle methode voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige intact DNA te ontwikkelen.
Cytologie is een alternatieve methode voor pathologische diagnose. Cytologische monstervoorbereiding is een eenvoudiger, minder duur en sneller benadering in vergelijking met FFPE voorbereiding10. De TIC-techniek is uitgevoerd op sentinel lymfklieren en marginale weefsels van borstkankerpatiënten voor intraoperatieve snelle diagnose voor enkele jaren11,12. Echter, er zijn weinig rapporten die hebben onderzocht of genomic DNA van hoge kwaliteit kan worden geëxtraheerd uit TIC monsters en gebruikt voor volgende genetische analyse. Cytologische exemplaren zijn vaak gekleurd met Papanicolaou (Pap) of Giemsa-kleuring, en we eerder gemeld dat de hoeveelheid en de kwaliteit van DNA geëxtraheerd uit TIC monsters (vooral Giemsa gebeitste monsters) superieur aan monsters van FFPE zijn weefsels13. Vergeleken met Pap vlekken, heeft Giemsa-kleuring een voordeel in vereisen minder verkleurende procedures. In Pap vlekken, nadat de monsters zijn vaste en gekleurd, moeten zij worden gemonteerd met montage medium (bijvoorbeeld, Malinol) voor het monster inhoud, zoals tumorcellen, normale cellen en ontstekingscellen onder een microscoop te onderscheiden. Als het model van de Pap bereid is zonder de stap van de montage, is het bijna onmogelijk te observeren van de cellen onder een Microscoop, omdat het model wordt gedroogd. Ter vergelijking: Giemsa-kleuring kan worden waargenomen in de gedroogde staat, dus de montage stap is niet nodig voor snelle cellulaire evaluatie. Voor microdissection is Giemsa-kleuring geschikter omdat droge exemplaren.
In dit verslag, we voeren een eenvoudige en snelle methode voor het voorbereiden van de TIC exemplaren met Giemsa-kleuring en aantonen dat TIC een betere bron voor DNA in vergelijking met FFPE exemplaren is.

<table><tbody><tr><td>FINE FROST white20 micro slide glass</td><td>Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick A solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick B solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNase P Detection Reagents Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324034</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optical Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>Ion Library TaqMan Quantitation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4468802</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4480442</td><td></td></tr><tr><td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4471250</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chef System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-well Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>Ion 318 Chip Kit v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Wash 2 Bottle kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&trade; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>16-position Magnetic Stand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Optical 96-well Reaction Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Clear Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&trade; AMPure&trade; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol(99.5)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (10M)</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>petit-change</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td><td>Mini centrifuge</td></tr><tr><td>petit-incubator</td><td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>Air incubator</td></tr><tr><td>SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator MediCool</td><td>SANYO</td><td>MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.130</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.260</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER S</td><td>FEATHER</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>Vortex mixer</td></tr><tr><td>Pincette</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microtube</td><td>BIOBIK</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table>

eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige tumor dna uit klinisch-pathologische monsters met behulp van touch impressum cytologie

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Het is van cruciaal belang om te bepalen van de vogelgriepvirus status in kanker voor beheer en behandeling van specifieke moleculaire gerichte drugs voor kankerpatiënten. In de klinische setting, worden formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels veel gebruikt voor genetische tests. FFPE DNA is echter over het algemeen beschadigd en gefragmenteerd tijdens het proces van de fixatie met formaline. FFPE DNA is daarom soms niet voldoende voor genetische tests vanwege de lage kwaliteit en kwantiteit van DNA. Hier presenteren we een methode van aanraking Impressum Cytologie (TIC) te verkrijgen van genomic DNA van kankercellen, die onder een microscoop kan worden waargenomen. Cel morfologie en kanker cel nummers kan worden geëvalueerd met behulp van TIC exemplaren. Bovendien kan de extractie van DNA genomic van TIC monsters worden voltooid binnen twee dagen. De totale hoeveelheid en de kwaliteit van TIC DNA verkregen met behulp van deze methode was hoger dan die van FFPE DNA. Deze snelle en eenvoudige methode kunt onderzoekers voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige DNA voor genetische tests (bv, volgende generatie sequentie analyse, digitale PCR en kwantitatieve real-time PCR) en aan het verkorten van de doorlooptijd voor het rapporteren van resultaten.

Figuur 1 toont het hele proces van het voorbereiden van de TIC specimens DNA-extractie. Met name neemt de procedure slechts twee dagen aan de genomic DNA verkrijgen TIC monsters. We geëvalueerd eventuele effecten van tumor opslag vóór de dia verwerking. We vonden dat tumorcellen gekoppeld waren op het glasplaatje weefsel exemplaren werden onmiddellijk aangeraakt op de dia als wanneer weefsels werden gehouden in zoute bevochtigd steriel-gaas voor 1 h (<strong ...

Het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige genomic DNA van tumor weefsels is een essentiële eerste stap voor het analyseren van de genetische veranderingen met behulp van de volgende generatie sequencing. In dit artikel presenteren we een eenvoudige en snelle methode om tumorcellen te verrijken en te verkrijgen intact DNA touch Impressum cytologie specimens.

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Het algemene doel van dit protocol is om hoogwaardig tumor-DNA uit klinische monsters te verkrijgen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in fundamenteel en klinisch onderzoek, zoals kankeronderzoek, diagnose en beslissingen over behandeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we tumor-DNA eenvoudiger en sneller kunnen verkrijgen dan met eerdere methoden.Om het protocol te beginnen, raak met behandschoende handen het tumoroppervlak van een eerder voorbereide en geresecite weefsel meerdere keren aan op een normale glazen plaat. Controleer visueel of het aangeraakte gebied meer dan 80% van de glazen plaat bedekt. Druk licht de normale glazen plaat tegen een Polyethyleen Naftalaat of PEN membraanplaat en wrijf deze twee tot drie keer voorzichtig met behandschoende handen.Controleer visueel of de cellen zijn overgebracht van de normale glazen plaat naar de PEN membraanplaat. Laat zowel de glazen als PEN membraanplaten vijf minuten op kamertemperatuur drogen. Na het drogen, kleurt u de normale glazen plaat voor directe cytologische onderzoek.Dompel de glazen platen gedurende vijf seconden in fixeervloeistof en kleurt vervolgens met Giemsa kleuring oplossing gedurende 15 seconden. Beoordeel en screen de tumor inhoud en cellulariteit op de normale glazen plaat volledig met een microscoop voor snelle beoordeling. Evalueer tumorcellen op basis van verschillende criteria.Als het monster tumor cellulariteit van meer dan 60% vertoont door snel microscopisch onderzoek van de vorige sectie, snijd de tumor-geraakte film van de PEN membraanplaten voor DNA-extractie met een mes en behandschoende handen. Breng de gesneden film over naar een steriele microcentrifugebuis met een pincet en behandschoende handen. Bewaar de film-bevattende microcentrifugebuis op vier graden Celsius tot DNA-extractie.Open de software en plan de uitvoeringsconditie en stel de uitvoeringsparameter in de software in. Klik op het plan-tabblad en selecteer sjabloon, selecteer vervolgens de juiste uitvoeringsmethode. Selecteer de toepassing en techniektype en klik op volgende.Selecteer het instrument, monstervoorbereidingskit, bibliotheekkittype, sjabloonkit, sequencingkit, basiskalibratiemodus, chiptype, controlesequentie en barcodeset en klik op volgende. Selecteer plugins en klik op volgende. Selecteer project en klik op volgende.Selecteer vervolgens standaard referentie en BED-bestanden van het doelgebied. Typ de monsternaam, selecteer de barcode en klik op plan uitvoeren. Voer vervolgens de sjabloonvoorbereiding en chipbelasting uit in een geautomatiseerd instrument volgens de instructies van de fabrikant.Ontdooi de reagentencartridge bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten voor gebruik. Verdun de onverdunde bibliotheek met nuclease-vrij water volgens de bibliotheekconcentratie berekend in stap 6.8 en maak 20 picomolare bibliotheken. Bereid een gepoolde bibliotheek voor sequencing voor en bewaar deze op ijs.Voeg 25 microliters van de gepoolde bibliotheek toe aan de bodem van de monsterbuis met een 100 microliter pipette. Schakel de stroom in en open de deksel van het geautomatiseerde instrument. Plaats de sequencing chip, chip adapter, verrijkingscartridge, tipcartridge, PCR plaat, PCR frame seal, herstelbuisje, oplossingscartridge en reagentencartridge op de juiste positie van het geautomatiseerde instrument.Rak setup uitvoeren en stap voor stap aan op het scherm. Sluit het deksel en tik start controleren op het scherm. Na het dek scanproces, tik op volgende.Controleer de inhoud van het display, sjabloontype, chip ID, monster ID, chiptype, plannen. Stel de tijd in en tik op OK. Nadat het laden van de chip is voltooid, tik op volgende en open het deksel. Haal de sequencing chip uit de chip adapter met behandschoende handen.Plaats de chip in de chipcontainer, wikkel deze af met parafilm en bewaar de chip op vier graden Celsius tot de sequencing reactie. Verwijder vervolgens de verrijkingscartridge, PCR plaat, PCR frame seal, herstelbuisje, oplossingscartridge en reagentencartridge van de juiste positie van het geautomatiseerde instrument met behandschoende handen. Breng een lege tipcartridge over naar de afvaltip positie van het geautomatiseerde instrument met behandschoende handen.Tik op volgende en sluit het deksel. Tik vervolgens op start en reinig het geautomatiseerde instrument met ultraviolette stralen gedurende vier minuten. Los een natriumchloriet tablet op in 1.000 milliliter ultrapuur water en filter de oplossing met een 0.22 micron filter.Zodra het sequencing instrument is opgewarmd, tik op schoon en volgende op het scherm van het sequencing instrument. Reinig het sequencing instrument met 250 milliliter gefilterde gesteriliseerde natriumchlorietoplossing, vervolgens 250 milliliter ultrapuur water. Tik vervolgens op initialiseren en selecteer de juiste sequencing kit op het scherm.Installeer een grijze vervoerder met behandschoende handen. Initialiseer het sequencing instrument met de spoelvloeistof, de pH aanpassingsoplossing en de pH standaardoplossing. Voeg vervolgens 20 microliter DATP, DGTP, DCTP en DTTP nucleotiden toe in 50 milliliter buisjes met een 100 microliter pipette.Installeer een grijze vervoerder op de juiste locatie met behandschoende handen. Laad de 50 milliliter buis en schroef deze op het sequencing instrument. Selecteer volgende op het scherm om de initialisatie stap te starten.Na het voltooien van de initialisatie stap, tik op uitvoeren op het scherm en selecteer het juiste bibliotheekvoorbereidingsinstrument. Scan de tweedimensionale barcode van de chip. Plaats de sequencing chip op de juiste positie.Sluit de chipklem en het instrumentendeksel en tik op chip controleren, volgende en OK op het scherm om de sequencing uitvoering te starten. Na de sequencing reactie, draag de gegevens over en voer de gegevensanalyse pijplijn uit op de sequencing server. De absolute DNA hoeveelheden en de RQ waarde, een indicator van de degradatieniveau van genomisch DNA, tonen aan dat een hogere DNA opbrengst wordt bereikt met behulp van de TIC specimens vergeleken met de FFPE specimens.Bovendien waren de RQ waarden van de TIC DNA significant hoger vergeleken met die van de FFPE DNA over verschillende tumortypes. APC Q1367* werd geïdentificeerd in zowel FFPE als TIC DNA geëxtraheerd uit site één en APC S135

simple-rapid-method-to-obtain-high-quality-tumor-dna-from-clinical

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Circulerende tumorcellen worden geïsoleerd uit het bloed van patiënten met kanker kan brengen zonder dat cellulaire schade. Isolatie van tumorcellen vindt plaats via een bimoleculaire oppervlak van E-selectine naast antilichamen tegen epitheliale markers. Een nanobuis coating bevordert specifiek kankercellen hechting resulteert in een hoge capture zuiverheden.

Snelle Isolatie van Viable circulerende tumorcellen van de patiënt Blood Samples

Dit protocol beschrijft qPCR-detectie van cytomegalovirus in formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed biopsieweefsel, wat snel, gevoelig, specifiek is en nuttig voor het interpreteren van twijfelachtige hematoxyline en eosine of immunohistochemische kleuringspatronen.

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

Hier beschrijven we een optimale en efficiënte verwijdering strategie voor het verzamelen van onderhavige bio-deeltjes "raken DNA" monsters, tezamen met een verbeterde amplificatieprotocol waarbij in één stap 5 gl micro-volume lysis / STR amplificatie, het herstel van mogelijk short tandem repeat (STR) profielen van de bio-deeltje donor (en).

Verbeterde Genetische analyse van Single Human Bioparticles Hersteld door vereenvoudigd Micromanipulatie uit Forensisch &#39;Touch-DNA&#39; Evidence

Dit manuscript beschrijft klinische protocollen voor twee next-generation sequencing panelen. Het ene paneel onderzoekt hematologische maligniteiten, terwijl het andere paneel zich richt op genen die vaak gemutaeerd zijn in solide tumoren. Moleculaire classificatie van drivermutaties in humane maligniteiten biedt waardevolle prognostische en voorspellende informatie.

Next Generation Sequencing voor de detectie van beroep Mutaties in vaste en vloeibare Tumoren

Kutane tumoren worden vaak weggegooid na Mohs micrografische chirurgie. Hier wordt een protocol beschreven dat klinisch ondersteunend personeel effectief kan verwerken en opslaan van huidkanker ( bv. Plaveiselcelcarcinoom, basale celcarcinoom en melanoom) monsters voor stroomafwaartse laboratoriumtoepassingen zonder in te grijpen bij klinische operaties.

Oprichting van een Biorepository op een kliniek

We presenteren een nieuwe aanpak karakteriseren van tumorcellen. We immunofluorescentie gecombineerd met DNA TL -in-situ-hybridisatie te evalueren van cellen gevangen genomen door een functionalized medische draad staat in vivo verrijken CTCs rechtstreeks uit bloed van de patiënt.

Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Dit artikel beschrijft een methode voor het identificeren van klonale en subclonale veranderingen tussen verschillende specimens van een bepaalde patiënt. Hoewel de hier beschreven experimenten gericht zijn op een specifiek tumor type, is de aanpak algemeen toepasbaar op andere vaste tumoren.

Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering

De karakterisering van circulerende tumorcellen (Ctc's) is een populair onderwerp in translationeel onderzoek. Dit protocol beschrijft een semiautomatische immunofluorescentie (IF)-test voor PD-L1-karakterisering en inventarisatie van Ctc's in niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-patiënt monsters.

Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Dit protocol presenteert een methode om het percentage tumorgehalte van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefselmonsters te verhogen.

Tumorinhoud verbeteren door tumormacrodissectie

Leer een snelle methode voor DNA-extractie uit tumorweefsel met touch imprint cytologie. Deze eenvoudige techniek levert hoogwaardig DNA voor next generation sequencing in kankeronderzoek.

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie (Video) | JoVE Journal

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

Meer video's verkennen