Name: Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer hoe u genetisch-gecodeerde fluorogene sensoren gebruikt voor live-celbeeldvorming van toxische oxidatieve stress. Deze methode biedt hoge specificiteit, gevoeligheid en ruimtelijke resolutie voor toxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Katelyn Lavrich voor hulp bij de proefopzet en manuscript bewerkingen.

1. bereiding van cellen
Opmerking: Deze procedure wordt beschreven op de lentivirale transductie van een vereeuwigd cellijn (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) wil de gewenste verslaggever (roGFP2 of HyPer). Andere lijnen/celtypes en/of methoden van genenoverdracht, met inbegrip van transfectie, kunnen worden gebruikt, zolang zij leiden een niveau van verslaggever expressie voldoende tot te visualiseren van een voldoende aantal cellen per gezichtsveld (gewoonlijk 5-10 cellen) sensor-uiten. Als met behulp van transfectie methoden de procedure moet worden uitgevoerd in de schotel die uiteindelijk zal worden gebruikt voor de analysemethode (bijvoorbeeld de cellen in de dezelfde schotel die zal worden voorgelegd aan de Microscoop transfect). De hieronder beschreven stappen vindt u informatie voor het voorbereiden van de cel transductions moet worden uitgevoerd in een 6-well cel cultuur plaat. Als deze indeling niet een geschikte grootte voor de gewenste toepassing is, kunnen andere schepen worden vervangen.
<ol><li>Cellen groeien tot ongeveer 40-60% samenkomst in normale groeiomstandigheden en media. Opmerking: Deze studie gebruikt de menselijke bronchiale epitheliale cellijn, BEAS-2B, gegroeid in Keratinocyt groeimedium (kg m).</li>
	<li>Vlak voor signaaltransductie, door de media van de groei van de cellen te vervangen door 500 µL van de serum-vrije media met de juiste hoeveelheid virus, zoals berekend door de formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq1.jpg"><ol>
<li>Gebruik voor signaaltransductie van cellen van de BEAS-2B, serumvrij Keratinocyt Basaal medium (KBM) ter vervanging van de kg m groei media tijdens virale incubations. Opmerking: De bovenstaande berekening is voor een enkele transductie van één putje van cellen in een 6-well-indeling. Desgewenst voeren transductions van verschillende putten kunnen worden uitgevoerd door de formule met een vermenigvuldiging van het aantal putten te worden getransduceerde aan te passen. Voor lentivirale transductions, gebruikt u een veelheid van infectie (MOI) tussen 5 en 20. Voor adenovirale transductions, gebruikt u een MOI tussen 100 en 500.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de cellen met de virale mengsel bij 37 ° C gedurende 4 uur, herverdeling van de virale deeltjes in de schotel elke 30 tot 60 min met een korte rockende of wervelende beweging.</li>
	<li>1 mL van de volledige groei media toevoegen aan de schotel en Incubeer bij 37 ° C voor een extra 4-16 h.</li>
	<li>Verwijder alle media en vervangen door nieuwe volledige groei media.</li>
	<li>Blijven groeien en passage van de cellen, zo nodig uit te breiden. Opmerking: Cellen moeten gaan aanzienlijk het uitdrukken van de sensor binnen 12-48 uur. Als een lentivirale vector werd gebruikt voor de signaaltransductie, moet stabiele expressie van de gewenste sensor blijven over passages.</li>
	<li>Voor microscopie gebaseerde evaluaties, zaad-cellen in glazen bodem Microscoop gerechten en groeien tot gewenste samenkomst (≥70 - 80%) voorafgaand aan de beeldvorming. Opmerking: Zaaien dichtheid zal afhangen van de grootte van de schotel, groeitempo op jaarbasis van de cel-lijn wordt gebruikt en het tijdstip van de beoordeling na zaaien. Bijvoorbeeld, zaad 300.000 BEAS-2B cellen in een 35-mm schotel aan opbrengst van ongeveer 70-80% samenvloeiing na 1 dag van groei.</li>
</ol>2. microscopie Set-up
Opmerking: Het protocol die hieronder beschreven wordt uitgevoerd met behulp van een confocal microscoop uitgerust met laserlijnen op 404 en 488 nm. Andere middelen van het maken van de fluorimetrische analyses van de sensoren beschreven binnen dit protocol op hun voorgeschreven excitaties/emissie moeten ook levensvatbare gegevens opleveren. Bovenal kunnen apparatuur instellingen sterk variëren afhankelijk van het type, de leeftijd en de conditie van het instrument wordt gebruikt; Dus, de genoemde waarden voor elke instrument mogelijk niet specifiek zijn voor de apparatuur die wordt gebruikt in andere laboratoria.
<ol><li>Uitvoeren van alle imaging analyse met behulp van milieucontroles te handhaven op een passende temperatuur (bv. 37 ° C), vochtigheid (meestal > 95% relatieve vochtigheid), en/of de concentratie (bijvoorbeeld, 5% CO2) geschikt voor de cellen in de hele gas de duur van het experiment.</li>
	<li>Als het gebruik van hoge waarden van relatieve vochtigheid, houden alle oppervlakken die in contact met de bevochtigde sfeer kunnen komen (bv., de doelstelling van de Microscoop) op of iets boven de temperatuur waarbij de luchtvochtigheid wordt gegenereerd om te voorkomen dat condens. Dit kan worden bereikt met het gebruik van een objectieve kachel en/of verwarming tape en een passende kachel-besturingselement.</li>
	<li>Alle onderdelen van de Microscoop inschakelen en instellen van alle nodige materiaal voor sequentiële excitatie op 488 en 404 nm met emissie bij 510 nm. Zorgen dat alle onderdelen van de optische configuratie correct zijn ingesteld voor real-time acquisitie.</li>
	<li>Instellen van een etappe-top milieu kamer te handhaven constante temperatuur bij 37 ° C, 5% CO2 sfeer, en > 95% vochtigheid. Vóór het opstarten Beeldacquisitie, equilibreer het milieu kamer gedurende ten minste 10 minuten na de eerste opzet van alle milieucontrole. Opmerking: Omgevingsomstandigheden kunnen worden geëlimineerd of aangepast afhankelijk van de lengte van het experiment, celtype en blootstelling wordt gebruikt.</li>
	<li>Plaats de schotel van cellen (stap 1.7) op de podium-top binnen het milieu kamer.</li>
	<li>Met de gewenste objectief, zoek het brandvlak van cellen met behulp van het oculair en wit licht en controleer van normale morfologie. Opmerking: Een 1.4 NA 60 X violet-gecorrigeerd, objectief olie-ondergedompeld wordt vaak gebruikt, waarmee identificatie van intracellulaire compartimenten terwijl het maximaliseren van de optische resolutie van de confocal systeem.</li>
	<li>Controleer de fluorescentie-expressie voor de cellen in het gezichtsveld. Doen terwijl het visualiseren van de cellen onder het breed-gebied fluorescentie verlichting met een juiste filter set, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC). Op dit punt, het gebruik van breed-gebied belichting terwijl kijkend door het oculair handiger, is omdat het gemakkelijker om de schotel te selecteren van een gebied van cellen te bestuderen. In het algemeen, kies een gezichtsveld dat ten minste 5 tot 10 cellen die zijn uiting van de sensor, bevat zoals aangegeven door groene fluorescentie.<ol>
<li>Als alternatief, het uitvoeren van deze beoordeling confocally met behulp van laser excitatie bij een golflengte die meest compatibel is met de sensor wordt uitgedrukt (488 nm werkt meestal het beste). Opmerking: Vanwege hun intrinsieke fluorescerende eigenschappen, het zal moeilijker worden om te visualiseren cellen uiten HyPer dan die waarin roGFP2 met behulp van beide FITC of op 488 nm. Het moet nog wel mogelijk om te zien van vaag cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra een gewenste gezichtsveld wordt gevonden, sluit de milieu kamer. Opmerking: Gebruik de behoud van focus functie, vaak beschikbaar op geavanceerde Microscoop stands, ter vergemakkelijking van de handhaving van een stabiele brandvlak tijdens de studie.</li>
	<li>Overname parameters instellen om optimale beoordeling van de sensor van belang over de gewenste blootstellingsperiode. Hieronder volgen aanbevelingen en benaderingen voor de beeldvorming van de confocal van sensor Reacties:<ol>
<li>Aanpassen van de kracht van de laser voor excitatie op 488 nm en emissie bij 510 nm. Kies een laser energieniveau waarmee visualisatie van de cellen en houden dit constant tussen monsters of repliceren gerechten. Opmerking: Deze studie, 12% en 1,5% laser macht werden gebruikt voor de 488 en 404 nm laserlijnen, respectievelijk.</li>
		<li>Gebruik van de confocal besturingselementen van de acquisitie software om ervoor te zorgen dat het geselecteerde brandvlak is geoptimaliseerd voor maximale fluorescentie emissie-intensiteit in het midden van de cellen (z-as) door het scannen van 488 nm terwijl u aanpast het z-vlak. Dit is gemakkelijker gemaakt met behulp van de instelling van een hoge winst tijdens het zoeken naar het z-vlak dat in de meest overbelicht cellen resulteert. Zodra het juiste brandvlak is gebleken, keren de winst naar een instelling die is het meest optimaal voor de fluorescentie van de verslaggever wordt gebruikt zonder oversaturating van de pixels in acht worden genomen. Opmerking: De instellingen van de laser en winst die geschikt zijn voor het vinden en observeren van cellen tijdens experimenten is volledig afhankelijk van de confocal systeem wordt gebruikt. In het algemeen, zodra de cellen in het gezichtsveld gevonden, het wordt aanbevolen dat een minimale hoeveelheid laser stroom gebruikt (gewoonlijk ≤20%), zoals overmatige scannen van cellen met behulp van high-powered laserlicht oxidatieve veranderingen waarneembaar door de sensor veroorzaken.</li>
		<li>Gebruik de winst om te fine-tunen van de fluorescentie van de basislijn. Met roGFP2, tot stand brengen de basislijn in de buurt van de bovengrens (≈ 90% relatieve intensiteit) van het instrument zonder overmatige verzadiging, als deze cellen 510 nm fluorescentie geïnduceerd door 488 nm excitatie verliezen zal wanneer EGSH stijgt. In tegenstelling, de intensiteit van de fluorescentie met 488 nm excitatie moet laag (≈ 10% relatieve intensiteit) op basislijn voor HyPer uiting van cellen, aangezien deze cellen de intensiteit van de fluorescentie 510 nm krijgt wanneer H2O2 wordt gedetecteerd.</li>
		<li>Herhaal stap 2.9.2 en 2.9.3 met excitatie op 404 nm en emissie bij 510 nm. Winst instellingen voor de 404 nm excitatie golflengte zijn tegengesteld aan die worden gebruikt met 488 nm excitatie voor elke sensor (dat wil zeggen, lage basislijn fluorescentie (≈ 10% relatieve intensiteit) bij 404 nm voor de roGFP2, hoge basislijn fluorescentie (≈ 90% relatieve intensiteit) voor de H2 O2 sensor). Opmerking: In het algemeen, de fluorescentie (510 emissie) bij 404 nm excitatie worden aanzienlijk lager ligt dan dat verkrijgbaar met 488 nm excitatie in cellen een relatief kleine excitatie maximale voor beide van deze uiting van zowel roGFP2 en HyPer, als de 404 nm piek is sensoren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. data-acquisitie
<ol><li>Instellen dat de acquisitie software sequentieel prikkelen de twee excitatie golflengten (eerste 488 nm en vervolgens 404 nm) en verzamelen van uitstoot voor zowel op 510 nm bij een vooraf bepaald tijdsinterval in de gewenste lengte van het experiment (bijvoorbeeld vastleggen beelden elke 60 s voor 60 min).<ol>
<li>Als alternatief, verwerven afbeeldingen handmatig voor en na blootstelling als het geschatte tijdstip van wijzigingen in EGSH of H2O2 staan bekend om de xenobioticum wordt getest. Dit kan echter leiden tot een verlies aan temporele resolutie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Minstens 5-10 sensor-uiten cellen selecteert in het veld voor real-time beoordeling van experimentele parameters, en hen vast te stellen als de regio's van belang ("ROIs") om te controleren hun fluorescentie wijzigingen tijdens het experiment. Opmerking: Deze stap is optioneel, en na het experiment kan worden uitgevoerd als directe observatie in real time ongewenste of software beperkingen die voorkomen continue monitoring dat. Afhankelijk van de cel bevolking, kan de selectie van cellen als ROIs uiten sensor een reeks expressie niveaus vertegenwoordigen in cellen.<ol>
<li>Voeg de milieu toxische 9,10-phenanthrenequinone (9,10-PQ) of de waterstof peroxide (H2O2) na een periode van 5-min basislijn voor deze studies.</li>
		<li>Bereiden alle reagentia voor later gebruik in dit protocol.  9,10-PQ in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een concentratie van 15 mM oplossen en verdunnen in basale cel media een 250 µM werkende oplossing opleveren.  Daarnaast bereiden een werkende oplossing van waterstofperoxide in water dat een eindconcentratie van 1mM na injectie zal opleveren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de experimentele parameters zijn gedefinieerd, beginnen de tijd loop-acquisitie. Vast een basislijn periode van minstens 5 min (of 5 gegevenspunten) vóór het opstarten van xenobiotische posities.</li>
	<li>Blootstellen van de cellen aan de veroorzaken onderzocht met behulp van conventionele benaderingen voor in vitro doseren. Bereiden van oplosbare stoffen in water of andere geschikt oplosmiddel en injecteren rechtstreeks in de media.<ol>
<li>Als organische oplosmiddelen (bijv dimethylsulfoxide of ethanol) vereist zijn, houden de eindconcentratie oplosmiddel op of beneden 0,1%. Controleer of dat het oplosmiddel niet een effect op de EGSH of H2O2 productie met de controle van een voertuig in een aparte schaal van cellen produceert.</li>
		<li>Voor verbindingen met lagere oplosbaarheid, toevoegen een mengen stap met behulp van een micropipet bij het protocol na de injectie wordt gemaakt. Pomp gasvormige posities rechtstreeks in het milieu kamer met behulp van de juiste vervoerder gasmengsel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monitor veranderingen in fluorescentie tijdens de periode van blootstelling. Latere injecties desgewenst uitvoeren Neem grote zorg niet te verschuiven van de schotel tijdens injecties, zodat dezelfde cellen worden gevolgd in de loop van de hele tijd terwijl het beeld in de dezelfde brandvlak.</li>
	<li>Aan het einde van het experiment, de cellen aan passende controles worden blootgesteld. Toevoegen voor beide genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren, specifieke concentraties van stoffen bekend om te oxideren en deze sensoren in een puntige demonstratie van hun ratiometric reactievermogen verminderen. H2O2 en dithiothreitol (DTT) dienen als passende controles te oxideren en beide sensoren te verminderen. Typisch, een eindconcentratie van 100-1000 µM H2O2, gevolgd door de 1-5 mM dithiothreitol (DTT), kan de gebruiker volledig te oxideren en verminderen van deze sensoren.<ol>
<li>Voor deze studies, 1 mM H2O2 gevolgd door 5 mM DTT te gebruiken om te bepalen van de maximale sensor reactie.</li>
		<li>Wacht ten minste 5 min zodat de sensor te reageren en vervolgens injecteren een reductiemiddel, zoals DTT, te verminderen de senor en terug te sturen naar een niveau van fluorescentie op of in de buurt van de gevestigde basislijn. Opmerking: Het gebruik van besturingselementen in deze stap is cruciaal voor normalisatie, en moet worden uitgevoerd aan het einde van elk experiment om te bepalen van het dynamisch bereik van de sensor in elke cel. Voor roGFP2, kunnen aldrithiol ook worden toegevoegd aan het einde van het experiment. Aldrithiol omzeilt de roGFP2 redox estafette om de sensor direct oxideren. Dit is handig voor het beoordelen van de sensor-functie na xenobiotische blootstelling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. de gegevensanalyse
<ol><li>Als niet reeds, tekent u ROIs rond de cellen die moeten worden geanalyseerd. Gebruik de juiste software voor het meten van de intensiteit van de fluorescentie van elke ROI bij elke golflengte in de tijdsverloop. Zorgen ervoor dat de cellen niet bewoog of de plaat niet tijdens de run verschuiven deed. Opmerking: De oprichting van ROIs is meest eenvoudig te realiseren door het opstellen van een ingesloten gebied die volgt op de TL-expressiepatroon van elke cel. Als u wilt verder helpen bij dit proces, kan een doorvallend licht (of helderveld) beeld van de cellen binnen het gezichtsveld van de gevestigde in inspanningen om celgrenzen te definiëren op de fluorescerende beeld worden bedekt. Echter vereist het gebruik van een doorvallend licht beeld de gebruiker om te vangen een extra kanaal (set van beelden) in de loop van het experiment. U kunt ook integreren bepaalde fabrikanten algoritmen hun beeldbewerkingssoftware waarmee specifieke parameters zoals intensiteit drempels vast te stellen van ROIs in een meer kwantitatieve, minder subjectief, methode.</li>
	<li>De gegevens exporteren naar gewenste analysesoftware (bijvoorbeeld elektronische spreadsheet).</li>
	<li>De reactie van de sensor ratiometric voor elke ROI op elk punt van de tijd met de formules berekenen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56945/56945eq3.jpg">
</li>
	<li>Voor elk punt van tijd, gemiddelden de berekende ratiometric van alle ROIs.</li>
	<li>De waarde van de basislijn, die worden gebruikt voor het normaliseren van de gegevens, door het gemiddelde van de waarden (stap 4.4) van de eerder berekende ratiometric verzameld vóór toevoeging van de xenobioticum (bijvoorbeeld de eerste vijf-tijd punten) te berekenen.</li>
	<li>De waarden van de ratiometric uit stap 4.4 normaliseren door elke waarde door de waarde van de basislijn berekend in 4.5 te delen. Genormaliseerde verhoudingen zal centrum rond een waarde van 1 op de basislijn, terwijl de stijgingen van de EGSH of H2O2 volgende injecties zal leiden tot de ratio te verhogen. Evaluaties van xenobioticum die oxidatieve veranderingen veroorzaken de neiging om de opbrengst van de waarden in een bereik van 3 - 6 keer de waarde van de basislijn.</li>
	<li>Om te helpen bij het vergelijken van reacties binnen en tussen experimenten, express-de genormaliseerde gegevens als een percentage van de maximale sensor reactie door het definiëren van het antwoord op de controle oxidator (bijvoorbeeld 1 mM H2O2) als 100%. Opmerking: Als uiting van gegevens als een percentage van de maximale sensor reactie, het is cruciaal om ervoor te zorgen dat dezelfde concentratie van de controle-oxidant consequent wordt gebruikt in experimenten. Alle gegevens die zijn afgeleid van live-cel imaging analyse is vatbaar voor conventionele paarsgewijse en group-wise statistische analyse worden gekozen ter beoordeling van de onderzoeker.</li>
</ol>

Het onderzoek beschreven in dit artikel is herzien door de nationale gezondheid en milieu effecten Research Laboratory, US Environmental Protection Agency, en goedgekeurd voor publicatie. De inhoud van dit artikel mag niet worden uitgelegd te vertegenwoordigen Agentschap beleid, noch vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik.

Het gebruik van roGFP2 en HyPer bij de opsporing van wijzigingen in de intracellulaire EGSH en H2O2, respectievelijk, is goed beschreven in de vorige fysiologische en toxicologische studies 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Het pro...

De term "oxidatieve stress" wordt vaak aangehaald als een mechanisme in de toxicologie, maar is zelden deze term specifiek beschreven. Oxidatieve stress kan verwijzen naar verschillende intracellulaire processen, met inbegrip van de generatie van reactieve zuurstof soorten, schade veroorzaakt door vrije radicalen, de oxidatie van antioxidant moleculen, en zelfs de activering van specifieke signalering cascades stroomt. Een breed scala van milieucontaminanten1,2 en farmaceutische agenten3,4 zijn gedocumenteerd te induceren oxidatieve stress door beide directe actie van de xenobiotische compound zelf5 ,6 of subsidiair door productie van oxidant soorten als onderdeel van een cellulaire respons7,8,9,10. Het is daarom van groot belang in de toxicologie nauwkeurig observeren en karakteriseren van de oxidatieve processen die leiden tot negatieve resultaten. Conventionele methodes voor het meten van oxidatieve stress betrekken identificatie van geoxideerde biomoleculen11,12,13,14,15 of antioxidanten16 ,17,18,19,20, of directe meting van reactieve soorten zelf21,22,23, 24. Deze methoden vereisen echter meestal cellulaire ontwrichting, die vaak verbruikt het monster, elimineert ruimtelijke resolutie, en introduceert potentieel artefacten25. De ontwikkeling van meer gevoelige en specifieke methoden voor de detectie van oxidant soorten en markers voor oxidatieve stress geldt in grote lijnen voor het onderzoek van de schadelijke effecten van xenobiotische blootstelling.
Live-cel microscopie met behulp van een nieuwe generatie van genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor de monitoring van de intracellulaire redox-status van levende cellen. Deze sensoren worden meestal uitgedrukt met behulp van een vector onder de controle van een virale promotor die wordt ingevoerd via transfectie of transductie methodologieën. Hoge expressie efficiëntie zijn niet nodig, aangezien de cellen uiten de fluorescerende sensor kunnen gemakkelijk worden visueel geïdentificeerd. Voor de beoordeling van het toxicologische, kunnen cellen uiten deze sensoren worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie als ze worden blootgesteld aan xenobiotische verbindingen in real-time. Deze proefopzet toelaat herhaalde metingen in dezelfde cel, waardoor de gevestigde basislijn van elke cel om op te treden als haar eigen controle. De hoge temporele resolutie geboden door live-cel imaging is geschikt voor het opsporen van oxidatieve gebeurtenissen, met name degenen die bescheiden in omvang of aard van voorbijgaande aard zijn. Naast het feit dat zowel de specifieke als de gevoelige naar hun doel-moleculen, kan de fluorescentie van enkele van deze sensoren worden opgewekt met behulp van twee golflengten van licht. Dit verschijnsel kan de fluorescerende uitstoot moet worden uitgedrukt als een ratio die het mogelijk het onderscheidingsvermogen van signaal veranderingen geassocieerd met authentieke sensor reacties van die veroorzaakt door artefacten zoals variaties in cel dikte, expressie van de sensor, lamp maakt intensiteit, photobleaching en gevoeligheid van de detector fluorescentie26. Een ander voordeel van het gebruik van fluorogenic sensoren is dat ze kunnen worden gericht aan specifieke cellulaire compartimenten, een mate van ruimtelijke resolutie die is ongeëvenaard door conventionele methoden25,26,27.
Een grote familie van genetisch-gecodeerde sensoren op basis van groen fluorescent proteïne (GFP) zijn ontwikkeld en gekenmerkt verslag over een breed scala van fysiologische markers, inclusief pH, temperatuur, concentraties van de calcium en de verhouding van de ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Opgenomen onder deze zijn de sensoren van de glutathion redox potentiële (EGSH) en waterstof peroxide (H2O2). Terwijl deze sensoren werden ontwikkeld voor toepassingen in redox biologie en fysiologie, zijn ze ook aangepast om te studeren xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. In het bijzonder beschrijft het hier geschetste protocol het gebruik van de roGFP2 van de sensor EGSH en de H2O2 sensor HyPer.
roGFP2 rapporteert over het redoxpotentiaal van intracellulaire verminderde en geoxideerd glutathion (GSH/GSSG) via een redox-Relais met glutathion peroxidase (GPx), glutaredoxin (Grx) en glutathionreductase (GR) (Figuur 1)25, 32 , 33. Glutathion is de overheersende cellulaire antioxidant molecule en vooral in zijn gereduceerde vorm (GSH) in millimolar concentraties in het cytosol25,34aanwezig is. Terwijl EGSH is niet gekoppeld aan een functionele uitkomst, wordt dat herkend als een belangrijke indicator voor de status van de intracellulaire oxidatieve34. Een relatief kleine stijging van de concentratie van GSSG leidt tot een toename in EGSH , die kan worden opgespoord door roGFP2. Even belangrijk, toezicht op EGSH met behulp van roGFP2 tijdens xenobiotische belichtingen kan potentieel onthullen veel over het werkingsmechanisme op verschillende punten in de redox-estafette en bijbehorende studierichtingen, zoals de pentose fosfaat shunt (Figuur 1 )35. De tweede sensor hier besproken, HyPer, is een intracellulair H2O2 sonde afgeleid van het inbrengen van gele fluorescerende eiwit (YFP) in het regelgevend domein van bacteriële H2O2-gevoelige transcriptie factor OxyR136. Hoewel het is eerder beschouwd als een schadelijke reactieve zuurstof tussenliggende, wordt H2O2 steeds meer erkend als een belangrijk intracellulaire signalering molecuul onder fysiologische omstandigheden37, 38, suggereren dat niet-herkende rollen voor H2O2 in de toxicologie ook bestaan. Bijvoorbeeld, zou overtollige H2O2 -geïnduceerd door een xenobiotische blootstelling een voorloper van disregulatie in cellulaire signalering of een verschuiving in de Bioenergetica.
Beide sensoren genetisch-gecodeerde fluorogenic geuit in verschillende bestaande cellijnen, met inbegrip van de menselijke epidermoïde carcinoom cellijn A431 en de menselijke bronchiale epitheliale cellijn BEAS-2B, te observeren veranderingen in EGSH en H2 O2 in reactie op een verscheidenheid van toxicologische risico's. Het gaat hierbij om verontreinigende gassen (ozon35), oplosbare onderdelen van zwevende deeltjes (1,2 Naftochinon39,40 en zink41) en nikkel nanodeeltjes (niet-gepubliceerde gegevens). Deze studies zijn slechts een klein gedeelte van de mogelijke toepassingen van deze twee sensoren. Theoretisch, kan elk celtype die kan ontvangen en het uiten van het DNA van deze sensoren via conventionele moleculaire biologietechnieken worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van xenobiotica verdacht te veranderen de cellulaire oxidatieve toestand. Tot op heden, heeft een of meer van deze sensoren geuit in diverse prokaryoten en eukaryoten, met inbegrip van verschillende zoogdieren, plant, bacteriële en gist cel typen25,26,36,,42. De uitlezing voor zowel EGSH en H2O2 sensoren is een verandering in de intensiteit van de fluorescentie uitgezonden bij 510 nm na excitatie met 488 en 404 nm licht. Deze methode is zeer aanpasbaar op fluorimetrische platforms, waaronder verschillende soorten van de microscopie (confocale en breed-gebied) en de lezers van de plaat. De methode die hier wordt gepresenteerd zorgt voor gevoelige en specifieke waarneming van intracellulaire EGSH en H2O2 in in vitro toxicologische systemen.

<table><tbody><tr><td>roGFP2 Plasmid</td><td>University of Oregon</td><td>N/A</td><td>Generous gift of S.J. Remington</td></tr><tr><td>HyPer Plasmid</td><td>Evrogen</td><td>FP941</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>9,10-Phenanthrenequinone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156507</td><td></td></tr><tr><td>Black Wall Glass Bottomed Dishes</td><td>Ted Pella</td><td>14029-20</td><td></td></tr><tr><td>BEAS-2B cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>192151</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Office Suite</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR Imaging Software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1si Confocal Imaging System</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve stress met behulp van genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

Hoewel oxidatieve stress een vaak geciteerde toxicologische mechanisme is, conventionele methoden te bestuderen, lijden aan een aantal tekortkomingen, met inbegrip van de vernietiging van het monster, invoering van potentiële artefacten, en een gebrek aan specificiteit voor de reactieve betrokken soort. Dus, is er een huidige behoefte op het gebied van toxicologie aan niet-destructieve, gevoelige en specifieke methoden die kunnen worden gebruikt om te observeren en te kwantificeren van intracellulaire redox verstoringen, beter bekend als oxidatieve stress. Hier presenteren we een methode voor het gebruik van twee genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren, roGFP2 en HyPer, om te wonen-cel beeldvormende onderzoeken te observeren xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve reacties worden gebruikt. roGFP2 equilibrates met de glutathion redox potentiële (EGSH), terwijl HyPer direct detecteert waterstof peroxide (H2O2). Beide sensoren kunnen worden uitgedrukt in verschillende celtypen via transfectie of signaaltransductie, en kunnen op specifieke cellulaire compartimenten worden gericht. Bovenal biedt live-cel microscopie met behulp van deze sensoren hoge ruimtelijke en temporele resolutie thats niet mogelijk met behulp van conventionele methoden. Wijzigingen in de intensiteit van de fluorescentie op 510 nm fungeert als de uitlezing voor beide genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren als opeenvolgend opgewonden door 404 bewaakt nm en 488 nm licht. Deze eigenschap maakt beide sensoren ratiometric, elimineren van gemeenschappelijke microscopie artefacten en corrigeren voor verschillen in sensor expressie tussen cellen. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid van fluorimetrische platforms geschikt voor spannende en verzamelen emissies bij de voorgeschreven golflengten, waardoor het geschikt is voor gebruik met confocal beeldvormingssystemen, conventionele breed-gebied microscopie en plaat lezers. Beide sensoren genetisch-gecodeerde fluorogenic zijn gebruikt in een verscheidenheid van celtypes en toxicologisch onderzoek cellulaire EGSH en H2O2 generatie in realtime te volgen. Hier geschetst is een gestandaardiseerde methode die is sterk aan te passen op celtypes en fluorimetrische platforms voor de toepassing van roGFP2 en HyPer bij live-cel toxicologische beoordeling van oxidatieve stress.

Het gebruik van roGFP2 en HyPer bij de opsporing van wijzigingen in EGSH en intracellulaire H2O2 geweest goed beschreven eerder25,36,,42,43 en hier wordt gedemonstreerd. Confocale beelden van cellen uiten van roGFP2 op de basislijn en de volgende toevoeging van H2O2 en DTT zijn afgebeeld in <strong class="xf...

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Het algemene doel van deze methodologie is het gebruik van genetisch gecodeerde redoxsensoren vast te stellen voor de specifieke beoordeling van door toxicanten geïnduceerde verstoringen in redoxhomeostase. Door de belangrijke beperkingen van conventionele benaderingen te overwinnen die worden gebruikt bij oxidatieve stress, zal deze methode helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen met betrekking tot toxicologische oxidatieve stress. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoge mate van specificiteit en gevoeligheid combineert met ongeëvenaarde spacio-temporele resolutie om toxicologische oxidatieve stress in levende cellen te onderzoeken.Voer alle beeldanalyse uit met behulp van een confocale microscoop uitgerust met laserlijnen bij 404 en 488 nanometer, en omgevingscontroles om een geschikte temperatuur, vochtigheid en/of gasconcentratie te handhaven die geschikt is voor de cellen gedurende de hele duur van het experiment. Als u hoge waarden van relatieve luchtvochtigheid gebruikt, gebruik dan een objectiefverwarmer en/of verwarmingstape om alle oppervlakken die mogelijk in contact kunnen komen met de bevochtigde atmosfeer op of iets boven de temperatuur te houden waarbij de luchtvochtigheid wordt gegenereerd om condens te voorkomen. Schakel alle microscoopcomponenten in en stel al het benodigde apparatuur in voor sequentiële excitatie bij 488 en 404 nanometer met emissie bij 510 nanometer.Zorg ervoor dat alle componenten van de optische configuratie geschikt zijn ingesteld voor realtime acquisitie. Stel een omgevingskamer op het podium in om een constante temperatuur van 37 graden Celsius, 5% CO2-atmosfeer en meer dan 95% vochtigheid te handhaven. Voordat u begint met het verwerven van beelden, brengt u de omgevingskamer gedurende ten minste 10 minuten in evenwicht na de eerste instelling van alle omgevingscontroles.Plaats de schotel met cellen op het podium binnen de omgevingskamer. Zoek met de gewenste objectieflens het brandvlak van de cellen met behulp van het oculaire en wit licht en zorg voor normale morfologie. Een 60 X violet gecorrigeerde olie-geïmpregneerde objectieflens met een numerieke apertuur van 1,4 wordt vaak gebruikt, wat identificatie van intracellulaire compartimenten mogelijk maakt terwijl de optische resolutie van het confocale systeem wordt gemaximaliseerd.Controleer de fluorescentie-expressie van de cellen in het gezichtsveld terwijl u de cellen visualiseert onder breedveldfluorescentie-verlichting met een geschikt filterset zoals flourescian-isothioanaat of FITC. Op dit punt is het handiger om breedveldverlichting te gebruiken terwijl u door het oculaire kijkt, omdat het gemakkelijker is om de schotel te verplaatsen om een ​​veld met cellen te selecteren om te bestuderen. Zodra een gewenst gezichtsveld is gevonden, sluit u de omgevingskamer.Gebruik de functie voor het handhaven van de focus om het handhaven van een stabiel brandvlak gedurende het hele onderzoek te vergemakkelijken. Stel vervolgens de acquisitieparameters in om een optimale beoordeling van de sensor van belang te garanderen gedurende de gewenste blootstellingsperiode. Om dit te doen, pas de laservermogen voor excitatie bij 488 nanometer en emissie bij 510 nanometer aan.Kies een laservermogensniveau dat visualisatie van de cellen mogelijk maakt en houd dit constant tussen monsters of replicaatkommen. Gebruik de confocale controles van de acquisitiesoftware om ervoor te zorgen dat het geselecteerde brandvlak is geoptimaliseerd voor maximale fluorescemisie-intensiteit in het centrum van de cellen door te scannen bij 488 nanometer terwijl u de Z-plane aanpast. Gebruik een hoge versterkingsinstelling terwijl u de Z-plane aanpast met de meest overbelichte cellen.Zodra het juiste brandvlak is gevonden, brengt u de versterking terug naar een instelling die het meest optimaal is voor de fluorescentie van de gebruikte reporter zonder de pixels die worden waargenomen te oversatureren. Gebruik vervolgens de versterking om de baselinefluorescentie te verfijnen. Met roGFP2 stelt u de baseline in de buurt van de bovengrens van het instrument in zonder oververzadiging, omdat deze cellen 510 nanometer fluorescentie zullen verliezen die wordt geïnduceerd door 488 nanometer excitatie wanneer de glutathionredoxpotentiaal toeneemt.Herhaal deze stappen met excitatie bij 404 nanometer en emissie bij 510 nanometer. De versterkingsinstellingen voor de excitatiegolflengte van 404 nanometer zijn tegengesteld aan die welke worden gebruikt met 488 nanometer excitatie voor elke sensor. Over het algemeen zal de fluorescentie van de 404 nanometer-excitatie aanzienlijk lager zijn dan dat welke verkrijgbaar is met de 488 nanometer-excitatie in cellen die roGFP2 tot expressie brengen, aangezien een 404 nanometer-piek een relatief kleine excitatiemaximum is voor deze sensor.Stel de acquisitiesoftware in om de twee excitatiegolflengten sequentieel te exciteren en emissie voor beide te verzamelen bij 510 nanometer en op een vooraf bepaald tijdsinterval gedurende de gewenste lengte van het experiment. Kies voor realtime beoordeling van experimentele parameters ten minste vijf tot tien sensor-expresserende cellen in het veld en stel deze vast als gebieden van belang om hun fluorescentiewijzigingen tijdens het experiment te bewaken. Los vervolgens de omgevingstoxicant, 9, 10-PQ op in dimethylsulfoxide tot een concentratie van 15 millimolair op.Verdun het opgeloste toxicant in basaal-celmedium tot een werkoplossing van 250 micromolair voor een uiteindelijke concentratie van 25 micromolair. Bereid bovendien een werkoplossing van waterstofperoxide voor voor later gebruik in dit protocol. Zodra de experimentele parameters zijn gedefinieerd, begint u met de tijdsverloopacquisitie.Stel een basisperiode van ten minste vijf minuten in voordat u begint met xenobiotische blootstellingen. Blootstel de cellen aan het onderzochte toxicant met behulp van conventionele benaderingen voor in-vitro dosering. Bewaak veranderingen in fluorescentie gedurende de blootstellingsperiode.Voer vervolgens injecties uit zoals nodig. Wees voorzichtig om de schotel tijdens injecties niet te verschuiven, zodat dezelfde cellen gedurende het hele tijdsverloop worden gevolgd terwijl ze in hetzelfde brandvlak worden geïmagerd. Aan het einde van het experiment blootstelt u de cellen aan de juiste controles om roGFP2 volledig te oxideren en te reduceren.Het to

imaging-approaches-to-assessments-toxicological-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een screening methode om oxidatieve cellulaire omgevingen te detecteren is het meten van de oxidatie van CM-H2DCFDA. Zodra geoxideerd in een cel, CM-H2DCFDA veranderingen ten opzichte van niet-fluorescerende in een fluorescerende verbinding. Deze verandering in fluorescentie wordt gemeten door middel van flowcytometrie en geeft het aantal cellen in een oxidatieve omgeving.

Screening Assay voor oxidatieve stress in een Feline astrocyten cellijn, G355-5

This video describes the technique of visualizing oxidative stress in cultured organoids. This work helps in understanding the level of oxidative stress due to ROS accumulation in the various cell types present in an organoid after treatment with different ROS modulators.

Fluorescent Probe Imaging Assay: A Technique to Visualize Oxidative Stress in the Reactive Oxygen Species Inducer-Treated Cultured Intestinal Organoid Cells

This video demonstrates a flow cytometry assay to quantify the ROS levels in 3D intestinal organoids obtained from GFP-expressing transgenic mice. This method provides an in vitro experimental model to investigate the efficacy of test compounds on ROS production.

Flow Cytometry Assay to Quantify Oxidative Stress: An Assay to Quantify Reactive Oxygen Species in Intestinal Organoids Using Fluorogenic Probes

Hier rapporteren we een protocol om oxidatieve stress in levende zebravisembryo's te meten. Deze procedure maakt de detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) mogelijk in zowel volledige embryoweefsels als enkele-celpopulaties. Dit protocol zal zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses mogelijk maken.

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo&#39;s

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.

Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Leer hoe u genetisch-gecodeerde fluorogene sensoren gebruikt voor live-celbeeldvorming van toxische oxidatieve stress. Deze methode biedt hoge specificiteit, gevoeligheid en ruimtelijke resolutie voor toxicologisch onderzoek.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren (Video) | JoVE Journal

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

Meer video's verkennen