Visualiseren van Lignification Dynamics in planten met Klik op chemie: Dual Labeling is BLISS!

Het algemene doel van deze dubbele labelingmethode is om actief lignificerende zones van plantweefsels te observeren. In deze workflow wordt de chemische reporterstrategie toegepast met behulp van twee verschillende chemische reporters in een sequentiële combinatie van bio-orthogonale click-chemiereacties. Deze methode kan helpen bij het ontcijferen van belangrijke vragen in het veld van plantenbiologie, zoals het bepalen van welke factoren de ruimtelijke of temporele vorming van lignine binnen planten en wanden reguleren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het exclusief het lignine target dat tijdens metabolische incorporatie wordt geproduceerd. Het onderscheidt het van eventueel reeds aanwezig lignine in het monster. Hoewel we deze methode oorspronkelijk ontwikkelden om lignificatievlaggen te bestuderen, zou het kunnen worden gebruikt bij andere soorten zoals arabidopsis, populier of inderdaad elke andere plant die lignine produceert.

Om deze techniek te presenteren hebben we Clemence Simon, een promovendus die werkt op het snijvlak van chemie en biologie en deze techniek gebruikt om lignificatiedynamica te bestuderen. Bereid eerst een oplossing van 300 microliter chemische reporter met tien micromuller van alkine-getagde G-reporter. En tien micromuller van azide-getagde H-reporter en vloeibaar steriel 1/2 MS-medium.

Vortex de oplossing en breng deze over naar één put van een 48-well plate met behulp van een overdrachtpipet. Bereid een 300 microliter negatieve controle-oplossing met tien micromuller van G en tien micromuller van H en vloeibaar steriel 1/2 MS-medium. Vortex de oplossing en breng deze over naar een tweede put van dezelfde 48-well plate.

Snijd met een schone scheermes het stengel van een twee maanden oude vlasplant op tien centimeter boven het grondniveau. Bereid zorgvuldig 50 vrijhandige transversale dwarsdoorsneden van de stengel met behulp van het scheermes en plaats ze onmiddellijk in een 1/2 MS-medium. Selecteer vervolgens intacte, hele dwarsdoorsneden en verdeel er tien willekeurig in de put gevuld met de chemische reporter-oplossing, zorg ervoor dat het weefsel niet wordt beschadigd.

De dwarsdoorsneden moeten stevig en schoon worden gesneden en de dwarsdoorsnede moet recht zijn. Je hebt een stevige hand en een scherp scheermes nodig om de weefsels intact te houden. Het wordt aangeraden om van tevoren te oefenen.

Nadat je tien intacte dwarsdoorsneden in de negatieve controle-oplossing hebt verdeeld, incubeer de plaat 20 uur in continue licht in een groeikamer bij 20 graden Celsius. Verwijder de volgende dag de monolignal-oplossing in elke put met een micropipet. Voeg 500 microliters 1/2 MS-medium toe aan elke put en roer zachtjes gedurende tien minuten.

Verwijder vervolgens de spoelvloeistof met een micropipet. Bereid een milliliter van een door spanning bevorderde azide-alkine cycloadditie-oplossing. Bevat vijf micromuller van cycloocteen-getagde fluorescente kleurstof en vloeibaar steriel 1/2 MS-medium.

Vortex vervolgens de oplossing. Na de laatste wasstappen van het metabolische incorporatieprotocol, verwijder het 1/2 MS-medium en voeg 300 microliters van de SPAAC-oplossing toe aan elke put met een micropipet. Bescherm de 48-well plate tegen licht door deze in een doos te plaatsen.

Roer vervolgens de plaat een uur in het donker bij kamertemperatuur zachtjes op een mechanische schudler. Was vervolgens elke put vier keer met 1/2 MS-medium zoals eerder beschreven, terwijl de plaat in het donker blijft. Bereid een milliliter koper gekatalyseerde azide alkine cycloadditie-oplossing met natriumascorbinezuur, kopersulfaat en azide-getagde fluorescente kleurstof en vloeibaar steriel 1/2 MS-medium.

Vortex vervolgens de oplossing. Nadat het 1/2 MS-medium is verwijderd, plaats de plaat in een doos en voeg 300 microliters van de CuAAC-oplossing toe aan elke put met een micropipet. Roer de plaat een uur in het donker bij kamertemperatuur zachtjes op een mechanische schudler.

Verwijder de plaat van de mechanische schudler en verwijder de CuAAC-oplossing uit elke put met een micropipet. Voeg vervolgens 500 microliters 1/2 MS-medium toe en roer de plaat tien minuten lang in het donker op een mechanische schudler. Na nog twee keer wassen met 1/2 MS-medium, voeg je 500 microliters van een 7:3 methanol en water-oplossing toe aan elke put.

Roer de plaat een uur in het donker op een mechanische schudler. Verwijder vervolgens de oplossing uit de putten. Voeg vervolgens 500 microliters 1/2 MS-medium toe aan elke put en roer tien minuten lang in het donker.

Nadat dit vier keer is herhaald, bewaar de dwarsdoorsneden in 1/2 MS-medium, beschermd tegen licht. Plaats vijf druppels montagemedium op een glazen microscoopglas. Deponeer vervolgens elke chemisch reporter-getagde dwarsdoorsnede voorzichtig op het glas.

Breng nagellak aan op twee tegenoverliggende zijden van het glas. Bedek het glas met een dekglas, zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn. Verwijder vervolgens overtollig montagemedium met behulp van een papieren handdoek.

Zegel vervolgens het monster aan alle vier de zijden met nagellak. Nadat de nagellak droog is, bewaar de glazen op vier graden Celsius in het donker tot observatie onder een confocale microscoop. Plantendelen hebben de neiging om knapperig te worden wanneer ze drogen.

Zorg ervoor dat ze altijd in oplossing worden bewaard en dat de dekglazen aan alle kanten met nagellak worden verzegeld. Het verhoogt de houdbaarheid van de gemonteerde glazen. Plaats het monstersteekje op de microscooptafel onder het objectiefglas.

Observeer en draai het monster om de gewenste regio van het plantenweefsel te identificeren. Selecteer vervolgens het meest fluorescente vlak in de Z-as. Pas de versterking, offset en laservermogen aan om de optimale signaalverdeling over het hele grijstintenbereik voor elke kanaal te bere