Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

Het algemene doel van deze epifluorescente intravitale videomicroscopie, of IVM-protocol van bloedvaten is om leukocyt rollende en adhesie in gecorrodeerde slagaders te visualiseren en kwantificeren bij Angiotensin II-geïnduceerde hypertensie bij muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in de pathologie van vasculaire disfunctie en arteriële hypertensie, zoals het mechanisme van interactie tussen leukocyten en in het bijzonder de lysosome en positieve cellen, en het vaatwerk. Het grote voordeel van deze techniek is dat we de in vivo interacties tussen circulerende bloedcellen en het vasculaire begrip kunnen zien.

Bereid een mannelijke muis voor op een operatie na zeven dagen angiotensine twee-behandeling met een osmatische pomp volgens het tekstprotokol. Breng een oftalmische zalf aan over de ogen om ze tijdens de procedure te beschermen. Plaats het verdoofde dier in dorsale recumbance op een chirurgische plaat van 39 graden Celsius en steek een rectale sonde in om de temperatuur te handhaven.

Gebruik een wattenstaafje om ontharingscreme in de nek te verspreiden en in te wrijven tot het haar begint uit te vallen. Gebruik vervolgens na nog eens 2 minuten een spatel om de haren en crème te verwijderen. Desinfecteer vervolgens de huid met een alcoholische huidantisepticum.

Maak vervolgens onder een stereo-microscoop een longitudinale insnijding van 1 tot 1,5 cm in de huid van de nek, 1 cm van de luchtpijp. Maak vervolgens 2 loodrechte insnijdingen aan beide uiteinden van de eerste insnijding. Verwijder voorzichtig het weefsel net onder de huid en verwijder het stuk huid dat de linkerhalsslagader en de luchtpijp bedekt.

Gebruik vervolgens twee gebogen pincetten om de sublinguale en submaxillaire gecorrodeerde klieren voorzichtig te isoleren van de zone van belang. Zorg ervoor dat je de klieren niet snijdt of beschadigt, positioneer ze zodat ze de beste toegang tot de halsslagader en gecorrodeerde vaten mogelijk maken. Gebruik vervolgens dunne pincetten om de halsslagader te isoleren, steek dunne pincetten tussen het vat en het omliggende weefsel en open en sluit het instrument langzaam om de ader voorzichtig van het weefsel te bevrijden.

Zodra de halsslagader volledig schoon is, plaats de pincetten onder het vat en plaats twee 10 cm lange 7-0 naden eronder. Bind twee knopen om de naad dicht te maken in de richting van het hoofd en met de tweede naad, bereid een knoop voor, maar sluit deze niet. Houd nu met een pincet in de ene hand de katheter gevuld met 37 graden Celsius steriele zoutoplossing vast en maak met de andere hand met een schaar of een gebogen 26 gauge naald een kleine insnijding in het vat.

Breng de katheter in de halsslagader in en sluit de knoop twee keer. Sluit vervolgens de naad dicht in de richting van het hoofd over de katheter om een volledige immobilisatie te garanderen. Gebruik dunne gebogen pincetten om het gebied te dissecteren dat de luchtpijp bedekt om de gecorrodeerde slagaders te isoleren en voor te bereiden.

Zodra de gecorrodeerde vaten vrij zijn van omliggend weefsel, verwijder de vegaszenuw van het vat zonder het door te snijden, door de dunne pincetten langzaam te sluiten en te openen, indien nodig, om de zenuw voorzichtig te mobiliseren. Zodra beide slagaders volledig schoon zijn, plaats de pincetten onder de eerste gecorrodeerde slagader en plaats, terwijl u ervoor zorgt dat het vat niet te veel wordt uitgerekt, een kleine zwarte 3 mm bij 2,5 cm plastic vathouder onder het vat. Zorg ervoor dat de vathouder op zijn plaats is en dat er bloedstroom aanwezig is.

Om het vat niet te rekken, zou de hand van de operator zich zo min mogelijk moeten bewegen met een enkele beweging van de eerste pincet om de gecorrodeerde slagader te isoleren en de hulp van de tweede pincet om een gat onder het vat te maken. Wanneer de vathouder correct is gepositioneerd, plaats de tweede slagader over het apparaat. Als de muis niet direct onder de microscoop wordt geplaatst, plaats de klieren terug over de luchtpijp en breng 37 graden Celsius steriele zoutoplossing aan om uitdroging van het gebied te voorkomen.

Bereid in een 1 mL-spuiten een 1-4 verdunning in steriele zoutoplossing van een ontdooid 2 mg per mL oplossing van acridine-oranje. Bescherm de spuit tegen licht. Om metingen uit te voeren, plaats de muis onder een snelwerkende, groothoekfluorescentiemicroscoop met een lange afstand condenser en een 10x water-immersie objectief met een monochromator, een bundelsplitser en een CCD-camera.

Verkrijg beelden in real-time door het objectief in het midden van de gecorrodeerde slagader op het endotheeloppervlak te richten. Injecteer langzaam 50 mL acridine-oranje. Stel vervolgens de software in om 100 beelden op te nemen, met een belichtingstijd van 120 milliseconden per foto.

Neem vier video's op per gecorrodeerde slagader op verschillende locaties op de slagader voor elke video. Als het fluorescerende signaal afneemt, injecteer nog eens 50 mL acridine-oranje. Om verschillende omstandigheden te testen, injecteer de acridine-oranje rechtstreeks in de laterale staartader als er geen halsslagaderkatheter werd ingebracht en voer dezelfde beeldacquisitie uit.

Neem als controle fluorescentiemetingen op van niet geïnjecteerde lys-Mcre-positieve, IRG-positieve muizen. Kwantificeer de rollende en adhesiecellen in een 200 micron bij 250 micron rechthoekige weergave die in het midden van het vat voor elke video wordt weergegeven, met een snelheid van 10 beelden per seconde. Tel de rollende en adhesiecellen.

Adhesiecellen worden gedefinieerd als cellen die zich niet bewegen of losmaken van het endotheel binnen de 10 seconden durende video. Om de kwantificering te vereenvoudigen, verwijdert u het kanaal met de rode fluorescentie en gebruikt u alleen de groene fluorescentie om rollende en adhesieve cellen te tellen. In deze studie werden de gecorrodeerde vaten van lys-mCre positieve, IRG-positieve muizen geïnfuseerd met angiotensine 2, waargenome