Isolatie en karakterisatie van neutrofiele afkomstige deeltjes voor functionele Studies

Het algemene doel van dit protocol is om neutrofiel-afgeleide microdeeltjes te isoleren en te karakteriseren voor functionele studies. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de rol van exo-celvesikels, of microdeeltjes, in cel-cel communicatie in verschillende fysiologische processen, waaronder kanker, ontsteking en wondgenezing. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het relatief snel is, kosteneffectief is en dat het de evaluatie van de fenotypische samenstelling van microdeeltjes, of microvesikels, in functionele activa mogelijk maakt.

De procedure wordt gedemonstreerd door Ariel Finkielsztein, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium, en Joseph Lee, een bachelorstudent in mijn laboratorium. Voor dichtheidsgradiëntscheiding van muis-beenmerg polymorf-nucleaire, of PMN-cellen, plaatst u eerst langzaam drie milliliter versbereide, kamertemperatuur, 1,077 gram per milliliter oplossing over drie milliliter versbereide, kamertemperatuur, 1,119 gram per milliliter dichtheidsoplossing in één 15 milliliter conische buis per beenmergcellenmonster. Breng vervolgens één milliliter vers geïsoleerde beenmergcellen in ijskoud PBS aan op de bovenste dichtheidsgradiëntlaag van elke buis en scheid de cellen door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugering.

Aan het einde van de scheiding, verwijdert u voorzichtig de mononucleaire cellagen op de grensvlakken tussen de PBS en de bovenste dichtheidsgradiëntlagen in elke buis zonder de PMN-banden te verstoren. Gebruik een overdrachtspijp om de PMN-lagen in één nieuwe 15 milliliter buis per monster te verzamelen en breng het eindvolume in elke buis op 15 milliliter met 0,1 micron doorlaatgrootte gefilterd PBS. Pellet de PMN's door centrifugatie, gevolgd door een tweede centrifugatie in twee milliliter vers gefilterd PBS per buis.

Suspeneer vervolgens de pellets in één milliliter vers gefilterd PBS voor het tellen. Na het tellen, centrifugeer de cellen opnieuw en suspensieer het pellet in 100 microliter 0,1 micron doorlaatgrootte gefilterd HBSS, aangevuld met de stimulans van belang per 10 miljoen cellen. Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Aan het einde van de stimulatie, verzamel de cellen door centrifugatie en breng de celvrije supernatanten over in één nieuwe, 1,5 milliliter microcentrifugebuis per monster. Centrifugeer de supernatanten om eventueel celresten te verwijderen en breng de opgeruimde supernatanten over in nieuwe ultracentrifugebuizen, centrifugeer vervolgens de supernatanten en bewaar de gepelletiseerde microdeeltjes in paraffineverzegelde ultracentrifugebuizen bij 80 graden Celsius tot verdere experimentele analyse. Om de microdeeltjes in de muizencolon toe te dienen, plaatst u eerst een volledig verdovde muis in de rugligging en gebruikt u biopsieklemmers en een endoscoop uitgerust met een hoge resolutie camera om drie tot vijf oppervlakkige wonden langs de dorsale zijde van de colon te genereren.

Breng de muis terug in zijn kooi met monitoring tot volledige herstel. 24 uur later, gebruikt u de endoscoop om beelden van de toegebrachte wonden onder narcose te verkrijgen. Gebruik vervolgens een op colonoscopie gebaseerd micro-injectiesysteem om een experimenteel volume PMN-microdeeltjes, opgehangen in 100 microliter HBSS, direct in elke wondplaats toe te dienen.

De grootteheterogeniteit van de PMN-microdeeltjes kan worden beoordeeld door de microdeeltjes te vergelijken met bekende grootte flowcytometrie kralen. Zoals gedemonstreerd, kan de expressie van eiwitten van belang door de microdeeltjes ook worden onderzocht door flowcytometrie. In dit experiment werd de expressie van belangrijke inflammatoire en anti-inflammatoire moleculen door activator-gestimuleerde PMN-afgeleide microdeeltjes beoordeeld door immunoblotting.

De effecten van PMN-microdeeltjes op de genezing van epitheelcellen kunnen worden gemonitord door beeldverwerving van met schraapsels gewonde epitheellaagjes op vooraf bepaalde tijdstippen in vitro, evenals na biopsieklemmers wonden in vivo. Eenmaal beheerst, kunnen PMN-afgeleide microdeeltjes binnen vier uur worden geïsoleerd, als de techniek correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de PMN voorafgaand aan stimulatie op ijs moet worden bewaard om voortijdige activering en verlies van microdeeltjes te voorkomen.

Na voltooiing van deze procedure kunnen flowcytometrie, immunoblotting en real-time proliferatiereactietechnieken worden gebruikt om de microdeeltjesinhoud te definiëren, onder verschillende stimulatoire omstandigheden, of van verschillende oorsprongscellen. Deze techniek is nuttig voor het onderzoeken van de rol van microdeeltjesbijdrage in de regulatie van immuunresponsen, barrièrefunctie, weefselbeschadiging en herstel, evenals bij kankerprogressie. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muis-microdeeltjes kunt isoleren en labelen en de microdeeltjes kunt gebruiken in een functioneel wondgenezingsactivum in vivo.

Vergeet niet dat werken met levende dieren gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen voorstellen het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en het voltooien van de juiste veiligheidstrainingen altijd moeten worden ondernomen voordat u deze procedure uitvoert.