Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae
10 januari 2018
Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.
Het algemene doel van deze procedure is om een recombinant eiwit te produceren dat bestaat uit een mengsel van geordende en gesorteerde domeinen voor hybride structurele analyse door zowel röntgenkristallografie als kleine hoek röntgenscattering. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de structurele biologie te beantwoorden over het plaatsen van biologische functie zodat de bepaling van alle oplossingen de structuur van eiwit blijft. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om dynamische gebieden van een eiwit of macromolecuul te modelleren die niet kunnen worden opgelost door röntgenkristallografie.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode in het begin worstelen met het leren hoe ze de kwaliteit van hun SAXS-gegevens goed kunnen beoordelen. Om de procedure te beginnen, transformeer een Nsa1-expressieplasmide in een geschikte E.coli-expressiestam. Kweek de cellen, induceer Nsa1-expressie en oogst de cellen.
Resuspendeer de cellen in 25 milliliter lysisbuffer, vooraf gekoeld tot vier graden Celsius, met één EDTA-vrije proteaseremmertablet. Soniceer de cellen bij vier graden Celsius gedurende zeven minuten, met een cyclus van twee seconden aan, twee seconden uit. Centrifugeer vervolgens het lysaat bij 26.900 maal zwaartekracht gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius.
Zorg ervoor dat het mengsel niet bevriest tijdens de centrifugatie. Equilibreer vervolgens een zwaartekrachtstroomkolom met 10 ml geïmmobiliseerde kobaltaffiniteitresin met lysisbuffer. Laad het opgehelderde lysaat op de kolom en laat het bij vier graden Celsius door de hars stromen.
Was vervolgens de hars twee keer met 100 ml porties lysisbuffer. Eluteer Nsa1 uit de kolom met 20 ml elutiebuffer. Voer een 15mcl aliquot van de eluere op een vier tot 15%SDS-PAGE gel uit om de elutie van het eiwit te bevestigen.
Voeg vervolgens 1 ml van de 1 mg/ml TEV-proteasevoorraad oplossing toe aan de eluere. Incubeer de eluere bij vier graden Celsius een nacht om de MBP-tag te verwijderen. Gebruik vervolgens een 10 kilodalton centrifugaalfiltereenheid om de MBP-afgesneden Nsa1 tot ongeveer 5 ml te concentreren, wees voorzichtig om niet te veel te concentreren.
Zuiver het geconcentreerde eiwit op een gelfiltratiekolom vooraf geëquilibreerd met Buffer A. Een van de cruciale stappen in deze procedure is om ervoor te zorgen dat u alle aggregaten tijdens de zuivering verwijdert. Aggregaten zullen interfereren met kristallisatie en SAXS-gegevensverwerving en -analyses. Analyseer 15mcl monsters van elke kolomfractie met SDS-PAGE om de scheiding van MBP van Nsa1 te bevestigen.
Combineer de Nsa1-bevattende fracties. Gebruik een 10 kilodalton centrifugaalfiltereenheid om de gecombineerde fracties tot ongeveer 8 mg/ml te concentreren. Meet de absorptie bij 289 nanometer en bereken de eiwitconcentratie.
Ga onmiddellijk door met proteolytische screening en kristallisatieproeven. Om de proteolytische screening te beginnen, bereid 1 mg/ml voorraadoplossingen van Alpha-comotrypsine, trypsine, elastase, capayin, septilisine en Endoproteinase GluC. Verdun elke voorraadoplossing met verdunningsbuffer tot 1:10, 1:100 en 1:1.000.
Verdun de 8 mg/ml oplossing van Nsa1 tot 1 mg/ml met Buffer A. Combineer vervolgens voor elke proteaseverdunning 1mcl van de proteaseverdunning met 9mcl van de verdunde eiwitvoorraadoplossing. Incubeer de oplossingen bij 37 graden Celsius gedurende één uur. Voeg vervolgens 10mcl van 2x SDS-PAGE-steekproefbuffer toe aan elke oplossing en verwarm de oplossingen gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.
Laat de oplossingen op een vier tot 15%SDS-PAGE gel lopen om proteaseresistente domeinen te identificeren. Maak afgeknotte expressieconstructies die protease-labiele gebieden uitsluiten. Druk en zuiver deze eiwitten uit voor kristallisatie-optimalisatie.
Na het verwerven van SAXS-gegevens voor het Nsa1-eiwit over een reeks concentraties, stel het terminale shell-bestandspad in op de map met de gegevens. Start vervolgens de analysesoftware. Laad de verstrooiingscurven in de analysesoftware.
Gebruik de auto RG-tool om de straal van draaiing en de voorwaartse verstrooiingsintensiteit voor elke curve te bepalen. Genereer vervolgens Kratky-plots voor elke verstrooiingscurve om de mate van compactheid te bepalen. Gebruik de autonome tool om de paarsgewijze verdelingsfunctie voor elke curve te berekenen, met een maximale begindimensie van 3x de straal van draaiing.
Optimaliseer de maximale dimensie om een gladde, paarsgewijze verdelingsfunctiecurve te verkrijgen die consistent is met de experimentele verstrooiingscurve. Vergelijk de structurele parameters over concentraties om de afwezigheid van stralingsschade of concentratie-afhankelijke effecten te verifiëren. Het is cruciaal om belangrijke structurele parameters, inclusief straal van draaiing, moleculair gewicht, voorwaartse verstrooiing en paarafstandsverdelingsfuncties over een concentratiereeks te vergelijken.
En dat is om ervoor te zorgen dat er geen stralingsschade of concentratie-effecten zijn. Voer vervolgens de ensemble-optimalisatiemethode-utility uit met behulp van het startende eiwitkristallstructuurbestand, het doeleiwitsequentiebestand en het experimentele SAXS-gegevensbestand. Vergelijk de chi-kwadraatwaarden van het startende kristalstructuurbestand met het ensemblebestand om te bepalen of het ensemblemodel goed past bij de experimentele gegevens.
Gebruik moleculaire visualisatiesoftware om de kristalstructuur te overlappen met de gegenereerde conformers. Let op het totale aantal conformers en de fractie van bezetting voor elke conformer die bijdraagt aan de verstrooiingscurve. Proteolytische splitsing van het protease-labiele C-uiteinde van Nsa1 resulteerde in de vorming van orthorhomische kristallen.
Het vers gezuiverde Nsa1 vormde kubieke kristallen, maar de kristalstructuur ontbrak nog steeds aan elektronendichtheid voor het labiele c-uiteinde. Het n-terminale zeven beta-propeller WD-40 domein van Nsa1 was goed opgelost in beide structuren. Het Nsa1 WD-40 domein alleen was geen goede pasvorm voor de experimentele
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze methode beschrijft de klonering, expressie en zuivering van recombinant Nsa1 voor structurele bepaling middels röntgendiffractie en klein-hoek röntgenverstrooiing (SAXS). Deze methode is toepasbaar voor de hybride structurele analyse van eiwitten die zowel geordende als ongeordende domeinen bevatten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Structurele biologie
- Eiwitengineering
- Röntgenkristallografie
Achtergrond
- De studie richt zich op hybride structurele analyse van eiwitten.
- Het begrijpen van de structuur van eiwitten met dynamische regio's is cruciaal.
- Röntgenkristallografie kent beperkingen bij het oplossen van ongeordende regio's.
- Kleine-hoek röntgenspreiding (SAXS) biedt aanvullende gegevens.
Doel van de studie
- Om een recombinant eiwit te produceren voor structurele analyse.
- Om dynamische regio's van eiwitten die moeilijk te resolveren zijn, te modelleren.
- Om het begrip van de eiwitfunctie te verbeteren door middel van structurele inzichten.
Gebruikte methoden
- Transformatie van het Nsa1-expressieplasmid in E. coli.
- Kweken van getransformeerde cellen.
- Inductie van Nsa1-expressie.
- Oogsten van cellen voor eiwitzuivering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle klonering en expressie van recombinant Nsa1.
- Zuivering van eiwit dat geschikt is voor structurele analyse.
- Demonstratie van SAXS als instrument voor het bestuderen van ongeordende regio's.
- Inzichten in de structurele dynamiek van hybride eiwitten.
Conclusies
- De methode biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van complexe eiwitstructuren.
- De combinatie van röntgendiffractie en SAXS verbetert het structurele begrip.
- Toekomstige toepassingen kunnen andere eiwitten met vergelijkbare kenmerken omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Hybride structurele methoden die röntgendiffractie en SAXS combineren, stellen biofarmaceutische teams in staat om volledige eiwitarchitecturen te ontrafelen, inclusief ongeordende regio's die cruciaal zijn voor targetvalidatie. Deze aanpak vermindert mechanische ambiguïteit in de vroege ontdekkingsfase door experimentele gegevens te verschaffen over flexibele domeinen die de binding en functie beïnvloeden. De resulterende structurele zekerheid ondersteunt het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen en informeert strategieën voor leadidentificatie voor targets met intrinsieke ongeordendheid.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door gestructureerde en ongeordende domeinen van doeleitwiten te resolveren.
- Operationele waarde: Biedt experimentele validatie van domeinorganisatie en flexibiliteit, waardoor de afhankelijkheid van uitsluitend computationele voorspellingen wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het beperken van risico's bij targetselectie door conformationele toestanden te onthullen die de druggability en de toegankelijkheid van bindingsplaatsen kunnen beïnvloeden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gevalideerde structurele modellen die kunnen dienen als basis voor het ontwerp van assays voor targets met dynamische regio's.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare biofysische gegevens op (bijv. gyratie-straal, paardistributie) die geschikt zijn voor assay-standaardisatie over verschillende concentraties.
- Schaalbaarheid: Maakt de preparatie van goed gekarakteriseerde eiwitmonsters mogelijk voor downstream screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen structurele inzichten in de ontdekkingsfase en preklinische validatie door het gedrag in oplossingsfase van volledige targets te definiëren.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt hoe ongeordende regio's bijdragen aan de eiwitfunctie of complexassemblage, wat inzicht geeft in de relevantie van biomarkers.
- Risicogestuurde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door onzekerheid in structuur-functierelaties van targets te verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze hybride methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij structurele zekerheid over volledige eiwitten een betrouwbaardere overgang naar preklinische fasen mogelijk maakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door zowel geordende als ongeordende domeinen van assemblagefactoren zoals Nsa1 op te lossen.
- Screening: Levert assay-klare, monodisperse eiwitmonsters gevalideerd door SAXS en kristallografie, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen garandeert.
- Analytics: Levert kwantitatieve SAXS-outputs (bijv. Rg, I(0), P(r)) die vergelijking van conformationele toestanden onder variërende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt domeinstructuren met hoge resolutie met gedrag in oplossing, waardoor continuïteit ontstaat naar preklinische modellen van ribosoombiogenese.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van andere multidomeineiwitten met geordende en ongeordende regio's, waardoor de investering in structurele biologie wordt gemaximaliseerd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitmodellen door ongeordende regio's op te lossen die onzichtbaar zijn voor alleen kristallografie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare structurele gegevens via gecombineerde orthogonale methoden.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid bij de validatie van doelwitten te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van uitgebreide structurele validatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering, kristallografie en de verzameling en analyse van SAXS-gegevens.
- Is afhankelijk van toegang tot synchrotron-beamlines voor hoogwaardige SAXS-metingen en röntgendiffractie.
- Noodzaakt tot gestandaardiseerde protocollen voor monstervoorbereiding om aggregatie te voorkomen, wat zowel de kristallografie als SAXS zou compromitteren.
- Omvat een zorgvuldige optimalisatie van het constructontwerp om protease-labiele regio's te verwijderen terwijl functionele domeinen behouden blijven.
- Vereist interdisciplinaire samenwerking tussen structurele biologen, biofysici en teams voor geneesmiddelenontwikkeling om hybride modellen te interpreteren.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Nsa1 (Nop7 Associated 1) Protein Purification
3:43
Proteolytic Screening
5:14
Small-Angle X-Ray Scattering (SAXS) Data Processing, Comparison of Concentration Series, and Ensemble Modeling
7:31
Results: Modeling the Disordered C-Terminus Region of Nsa1
8:37
Conclusion
