Name: Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regios van de Nsa1 van S. Cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Leer hybride structurele analyse van eiwitten met geordende en ongeordende domeinen door röntgendiffractie en SAXS te combineren. Deze methode modelleert dynamische regio's die kristallografie niet kan oplossen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diffractie gegevens werden verzameld in Zuidoost-regionale samenwerking toegang Team (SER-kat) 22-ID en 22-BM straallijnen op de geavanceerde Photon bron (JBS), Argonne National Laboratory. De SAXS gegevens verzameld over de SIBILLEN beamline op het voorschot licht bron (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. We bedank het personeel op de SIBILLEN beamline voor hun medewerking aan externe gegevens verzamelen en verwerken. Wij zijn dankbaar aan de National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) massaspectrometrie onderzoeks- en steungroep voor hulp het eiwit domeingrenzen bepalen. Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse nationale Instituut van gezondheid intramurale Research Program; Amerikaanse National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 naar R. E. S.) en de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (CIHR, 146626 tot M.C.P). Gebruik van de APS werd ondersteund door de ons Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences onder Contract nr. W-31-109-Eng-38. Gebruik van de geavanceerde licht bron (ALS) werd gesteund door de directeur, Office of Science, Office van energie basiswetenschappen, van het US Department of Energy onder Contract nr. DE-AC02-05CH11231. Extra ondersteuning voor de SIBILLEN SAXS beamline afkomstig is van de National Institute of Health project MINOS (R01GM105404) en een High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Wij zouden ook graag Andrea Moon en Dr. Sara Andres bedanken voor hun kritische lezing van dit manuscript.

<ol><li>Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+biogenesis+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).</li>
<li>Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Puzzle+of+Life%3A+Crafting+Ribosomal+Subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits.</a> Trends Biochem Sci. , (2017).</li>
<li>Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+preribosomal+RNA+processing+pathways+in+yeast%2C+plant+and+human+cells+-+focus+on+coordinated+action+of+endo-+and+exoribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases.</a> FEBS Lett. , (2017).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19879902">Driving ribosome assembly.</a> Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).</li>
<li>Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAA+ATPase+Rix7+powers+progression+of+ribosome+biogenesis+by+stripping+Nsa1+from+pre-60S+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles.</a> J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).</li>
<li>Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA-ATPase+NVL2+acts+on+MTR4-exosome+complex+to+dissociate+the+nucleolar+protein+WDR74%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophy+Res+Co%22%5BJournal%5D)">AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74.</a> Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).</li>
<li>Maserati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr74+is+required+for+blastocyst+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse.</a> PLoS One. 6 (7), e22516(2011).</li>
<li>Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+noncoding+regulatory+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer.</a> Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).</li>
<li>Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+Reveals+Features+of+Ribosome+Assembly+Factor+Nsa1%2FWDR74+Important+for+Localization+and+Interaction+with+Rix7%2FNVL2%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2.</a> Structure. 25 (5), 762-772 (2017).</li>
<li>Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Go+hybrid%3A+EM%2C+crystallography%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Go hybrid: EM, crystallography, and beyond.</a> Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+%28SAXS%29+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).</li>
<li>Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+flexible+proteins+using+small-angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering.</a> J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).</li>
<li>Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+expression+and+purification+problems+of+RhoGDI+using+a+family+of+%22parallel%22+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres+Purif%22%5BJournal%5D)">Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors.</a> Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).</li>
<li>Doublie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+selenomethionyl+proteins+for+phase+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination.</a> Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallography+for+aspiring+crystallographers+or+how+to+avoid+pitfalls+and+traps+in+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination.</a> FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision-making+in+structure+solution+using+Bayesian+estimates+of+map+quality%3A+the+PHENIX+AutoSol+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>McCoy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+structures+of+protein+complexes+by+molecular+replacement+with+Phaser%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser.</a> Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Dyer, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SAXS+for+the+characterization+of+biomolecules+in+solution%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach.</a> Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).</li>
<li>Forster, S., Apostol, L., Bras, W. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?s0021889810008289">Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering.</a> J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).</li>
<li>Petoukhov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+the+ATSAS+program+package+for+small-angle+scattering+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis.</a> J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).</li>
<li>Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?ks5004">PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis.</a> J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).</li>
<li>Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?wi0087">Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria.</a> J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).</li>
<li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+assessment+of+mass%2C+models+and+resolution+by+small-angle+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering.</a> Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).</li>
<li>Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+rigid+body+modeling+of+macromolecular+complexes+against+small-angle+scattering+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data.</a> Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).</li>
<li>Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+ensemble+modelling+of+flexible+macromolecules+using+X-ray+solution+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).</li>
<li>Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889895007047">CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates.</a> J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).</li>
<li>Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://pymol.org">https://pymol.org</a> (2015).</li>
<li>Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Physiol+Biophys%22%5BJournal%5D)">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).</li>
<li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26841758">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).</li>
<li>Hinsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+flexibility+in+proteins%3A+impact+of+the+crystal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment.</a> Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).</li>
<li>Shtykova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+influenza+A+virus+matrix+protein+M1+and+its+self-assemblies+at+low+pH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH.</a> PLoS One. 8 (12), e82431(2013).</li>
<li>Mallam, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structures+of+DEAD-box+RNA+chaperones+reveal+conformational+changes+and+nucleic+acid+tethering+by+a+basic+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).</li>
<li>Papaleo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Protein+Loops+and+Linkers+in+Conformational+Dynamics+and+Allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery.</a> Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).</li>
<li>Rozycki, B., Boura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large%2C+dynamic%2C+multi-protein+complexes%3A+a+challenge+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology.</a> J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103(2014).</li>
<li>Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+structural+biology+to+unravel+molecular+mechanisms+of+protein-RNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition.</a> Methods. 118, 119-136 (2017).</li>
<li>Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Functional+Dynamics+of+Modular+Multidomain+Proteins+by+SAXS+and+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR.</a> Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met behulp van dit protocol, werd recombinante Nsa1 van S. cerevisiae gegenereerd voor structurele studies door middel van röntgendiffractie zowel SAXS. Nsa1 was goed opgevoede in oplossing en gekristalliseerd in meerdere kristal vormen. Tijdens de optimalisatie van deze kristallen, werd ontdekt dat de C-terminus van Nsa1 gevoelig voor aantasting van het protease was. De hoge resolutie, orthorhombisch kristal vorm kan alleen worden gedupliceerd met C-terminal truncatie varianten van Nsa1, waarschijnlijk omdat de...

Ribosomen zijn grote ribonucleoprotein machines die de essentiële rol van het vertalen van mRNA naar eiwitten in alle levende cellen verrichten. Ribosomen bestaan uit twee subeenheden die worden geproduceerd in een complex proces ribosoom biogenese1,2,3,4genoemd. Eukaryotische ribosoom vergadering, is afhankelijk van de steun van honderden essentiële ribosomal vergadering factoren2,3,5. Nsa1 (het Nop7 gekoppeld 1) is een eukaryote ribosoom vergadering factor die vereist is voor de productie van de grote ribosomal subeenheid6, en is bekend als WD-repeat met 74 (WDR74) in hogere organismen7. WDR74 heeft aangetoond dat vereist is voor de vorming van de blastocyst in muizen8en de promotor van de WDR74 is vaak gemuteerd in kanker cellen9. De functie en de precieze mechanismen van Nsa1/WDR74 in ribosoom vergadering zijn echter nog steeds grotendeels onbekend. Om te beginnen te ontdekken van de rol van Nsa1/WDR74 tijdens de rijping van de eukaryote ribosoom, werden meerdere structurele analyses uitgevoerd, waaronder röntgendiffractie en kleine hoek X-ray scattering (SAXS)10.
Middel van röntgendiffractie, nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, elektronenmicroscopie en SAXS zijn alle belangrijke technieken voor de studie van macromoleculaire structuur. Grootte, vorm, beschikbaarheid en stabiliteit van macromoleculen invloeden de structurele biologie methode waarvoor een bepaalde macromolecule beste zal worden geschikt, maar het combineren van meerdere technieken door middel van een zogenaamde "hybride"-aanpak wordt steeds een steeds nuttig hulpmiddel11. Met name zijn röntgendiffractie en SAXS krachtige en complementaire methoden voor structurele bepaling van macromoleculen12.
Kristallografie biedt hoge resolutie atomaire structuren, variërend van kleine moleculen aan grote cellulaire machines zoals het ribosoom, en heeft geleid tot talrijke doorbraken in het begrip van de biologische functies van eiwitten en andere macromoleculen13. Bovendien, harnassen structuur gebaseerde drug design de kracht van kristalstructuren voor moleculaire docking door rekenmethoden, een kritische dimensie toe te voegen aan ontdekking en ontwikkeling van de drug14. Ondanks haar brede toepasbaarheid zijn flexibele en ongeordende systemen uitdagend om te beoordelen door kristallografie aangezien crystal verpakking kan worden belemmerd of elektron dichtheid kaarten mogelijk onvolledige of van slechte kwaliteit. SAXS is daarentegen een oplossingsgerichte en lage resolutie structurele aanpak staat om flexibele systemen, variërend van wanordelijke loops en termini intrinsiek ongeordende eiwitten12,15,16te beschrijven. Gezien het feit dat het is compatibel met een breed scala van deeltje grootte12, kunt SAXS werken synergetisch met kristallografie uit te breiden het bereik van biologische vragen die kunnen worden aangepakt door structurele studies.
Nsa1 is geschikt voor een structurele aanpak van hybride omdat het bevat een goed gestructureerde WD40 domein gevolgd door een functionele, maar flexibele C-terminus die niet vatbaar voor röntgendiffractie methoden. Hier volgt een protocol voor het klonen, expressie en zuivering van S. cerevisiae Nsa1 voor hybride structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en SAXS. Dit protocol kan worden aangepast om te bestuderen van de structuren van de andere eiwitten die bestaan uit een combinatie van bevolen en ongeordende regio's.

<table><tbody><tr><td>Moleculaire Kloning van Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2 parallel vector</td><td>Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiae genomisch DNA</td><td>ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>Primer voor het klonen van Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><tr><td>Recombinant Eiwitproductie en Zuivering van Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP- NSA1 en verschillende afkortingen</td><td>Lo et al., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selenomethionine</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Dioxaan-Vrij</td><td>Promega</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Vrije Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer, 1 M pH7.5</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M Imidazool, pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>Talon Affinity Resin</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtratiekolom</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>TEV Protease</td><td>Bereidt door NIEHS Protein Expression Core</td><td>Expressieplasmide verstrekt door NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr><tr><td>4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisatie, Proteolytische Screening</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>Salt Rx</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Index Screen</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion Screen</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Precipitant Synergy</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci 96-well 3-druppel UVP sitting drop platen</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>3inch Breed Crystal Clear Sealing Tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Proti-Ace Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/natriumhydroxide pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-011-</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat tribasic</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Plates met afdichting (VDX Plate met Sealant)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>18 mM Gemonteerde Nylon Loops (0.05 mm tot 0.5 mM)</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Seed Bead Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Crystal Caps</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Cryo Wand</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Cryogene Foam Dewar</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Puck System</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>Full Skirt 96 well Clear Plate</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>AxyMat Sealing Mat</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Lite Spectrophotometer</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Robot</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/Websites</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HKL2000</td><td>Otwinoski en Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>Emsley et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr><tr><td>Scatter</td><td>Rambo en Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov en Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun et al, 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al, 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria et al, 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek x-ray scattering model ongestructureerde regio's van de nsa1 van s. cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Bepaling van de volledige structuur van ribosoom vergadering factor Nsa1 van Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is uitdagend vanwege de wanordelijke en protease labile C-terminus van het eiwit. Dit manuscript worden de methoden beschreven om te zuiveren van recombinante Nsa1 van S. cerevisiae voor structurele analyse door middel van röntgendiffractie zowel SAXS. Röntgendiffractie werd gebruikt om op te lossen van de structuur van het welgeordende N-terminale WD40 domein van Nsa1, en vervolgens SAXS werd gebruikt voor het oplossen van de structuur van de C-terminus van Nsa1 in oplossing. Verstrooiing oplossingsgegevens werd bijeengezocht uit full-length Nsa1 in oplossing. De theoretische verstrooiing amplitudes werden berekend op basis van de hoge resolutie kristalstructuur van het domein WD40, en dan een combinatie van vastlichaam en ab initio modellering geopenbaard de C-terminus van Nsa1. Met deze hybride aanpak werd de quaternaire structuur van de gehele proteïne gereconstrueerd. De methoden die hier worden gepresenteerd gelden over het algemeen voor de hybride structurele bepaling van andere eiwitten die bestaat uit een mix van gestructureerde en ongestructureerde domeinen.

Nsa1 was PCR versterkt van S. cerevisiae genomic DNA en subcloned in een vector met een N-terminal 6 x-Histidine affiniteit label, gevolgd door MBP en een TEV protease-site. Nsa1 werd omgevormd tot E. coli BL21(DE3) cellen en hoge opbrengst van eiwit expressie werden verkregen na inductie met IPTG en groei bij 25 ° C's nachts (figuur 1A). Nsa1 was affiniteit-gezuiverd op geïmmobiliseerdet kobalt affiniteit hars, gevolgd door MBP decolleté me...

Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Het algemene doel van deze procedure is om een recombinant eiwit te produceren dat bestaat uit een mengsel van geordende en gesorteerde domeinen voor hybride structurele analyse door zowel röntgenkristallografie als kleine hoek röntgenscattering. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de structurele biologie te beantwoorden over het plaatsen van biologische functie zodat de bepaling van alle oplossingen de structuur van eiwit blijft. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om dynamische gebieden van een eiwit of macromolecuul te modelleren die niet kunnen worden opgelost door röntgenkristallografie.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode in het begin worstelen met het leren hoe ze de kwaliteit van hun SAXS-gegevens goed kunnen beoordelen. Om de procedure te beginnen, transformeer een Nsa1-expressieplasmide in een geschikte E.coli-expressiestam. Kweek de cellen, induceer Nsa1-expressie en oogst de cellen.Resuspendeer de cellen in 25 milliliter lysisbuffer, vooraf gekoeld tot vier graden Celsius, met één EDTA-vrije proteaseremmertablet. Soniceer de cellen bij vier graden Celsius gedurende zeven minuten, met een

combining-x-ray-crystallography-with-small-angle-x-ray-scattering-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

Dit protocol laat zien hoe een model met een lage resolutie ab initio en structurele details van een wasmiddel-ontbindend membraan eiwit in small-angle neutron scattering met contrast-matching van het detergent oplossing te verkrijgen.

Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

Hier presenteren we hoe kleine Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan worden gebruikt om informatie op lage resolutie enveloppen die vertegenwoordigen de macromoleculaire structuur te verkrijgen. Wanneer gebruikt in combinatie met hoge resolutie structurele technieken zoals röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie, bieden SAXS gedetailleerde inzichten in multidomain eiwitten en macromoleculaire complexen in-oplossing.

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Presenteren we het gebruik van het MeshAndCollect-protocol bij het verkrijgen van een gegevensset voltooid diffractie, voor gebruik in latere structuurbepaling, samengesteld uit gedeeltelijke diffractie datasets verzameld uit vele kleine kristallen van de fluorescente proteïne Cerulean.

Oplossing van de structuur van de Fluorescent Protein Cerulean met behulp van MeshAndCollect

SEC-BioSAXS metingen van biologische macromoleculen zijn een standaardbenadering voor het bepalen van de oplossingsstructuur van macromoleculen en hun complexen. Hier analyseren we SEC-BioSAXS-gegevens van twee soorten vaak aangetroffen SEC-sporen: chromatogrammen met volledig opgeloste en gedeeltelijk opgeloste pieken. We tonen de analyse en deconvolutie met behulp van scatter en BioXTAS RAW.

Analyse van SEC-SAXS-gegevens via EFA-deconvolution en Scatter

Neutroneneiwitkristallografie is een structurele techniek die de lokalisatie van waterstofatomen mogelijk maakt, waardoor belangrijke mechanistische details van de eiwitfunctie worden verstrekt. We presenteren hier de workflow voor het monteren van een eiwitkristal, neutronendiffractiegegevensverzameling, structuurverfijning en analyse van de neutronenverstrooiingslengtedichtheidskaarten.

Neutronenkristallografie Gegevensverzameling en -verwerking voor het modelleren van waterstofatomen in eiwitstructuren

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Leer hybride structurele analyse van eiwitten met geordende en ongeordende domeinen door röntgendiffractie en SAXS te combineren. Deze methode modelleert dynamische regio's die kristallografie niet kan oplossen.

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regios van de Nsa1 van S. Cerevisiae (Video) | JoVE Journal

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Meer video's verkennen