Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

Het algemene doel van dit protocol is om metabolieten in levende cellen van zich ontwikkelende embryo's te karakteriseren door in situ microsampling capillaire elektroforese-massaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cel- en ontwikkelingsbiologie, omdat het de analyse van metabolisme in enkele cellen direct in levende zich ontwikkelende embryo's mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel is, schaalbaar voor verschillende celgroottes en minimaal invasieve bemonstering van individuele cellen in levende embryo's mogelijk maakt.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat sommige stappen moeilijk te leren zijn omdat het embryo zich relatief snel ontwikkelt en een op maat gemaakt capillaire elektroforese elektrospray ionisatie-instrument wordt gebruikt. Begin deze procedure met de bereiding van 2% agarose in een 1X Steinberg's oplossing. Terwijl het nog vloeibaar is, bekleed de bodem van 60 millimeter petrischalen met de oplossing.

Zodra de agarosegel is afgekoeld en gestold, verbrand het uiteinde van een zes-inch Pasteurpipet tot het een bol vormt. Druk vervolgens lichtjes op het verwarmde uiteinde om vijf tot 10 putjes van ongeveer één millimeter diep in de agarose af te drukken. Om micropipetten met taps toelopende punten te maken, trekt u eerst borosilicaat capillairen in een Flaming/Brown type capillairtrekker met behulp van de instellingen die in het tekstprotocol staan vermeld.

Vervolgens breekt u de punt van de getrokken micropipet af met behulp van een paar fijne scherpe pincetten om een capillaire buitendiameter van ongeveer 20 micron te verkrijgen. Voer deze stap uit onder een stereomicroscoop om precisie en reproduceerbaarheid te bevorderen. Verkrijg embryo's door gonadotropine-geïnduceerde natuurlijke paring van volwassen xenopus laevis of via in vitro bevruchting zoals vermeld in het tekstprotocol.

Verwijder de jellycoats rond de embryo's zodra ze beginnen te kloven tot de tweecellig fase door de embryo's eerst twee minuten in de dejellying oplossing te laten rusten. Draai ze vervolgens zachtjes nog twee minuten rond om te voorkomen dat de embryo's aan de oppervlakte van de opvangschaal blijven kleven. Giet de inhoud van de schaal voorzichtig in een schone beker en decant snel de dejellying oplossing uit de beker.

Bedek de eieren onmiddellijk met 0.1X Steinberg's oplossing om de resterende dejellying oplossing af te spoelen. Draai zachtjes rond en decant vervolgens de oplossing. Herhaal deze stap vier keer om de embryo's grondig te wassen.

Breng de ontdekte embryo's over naar 1X Steinberg's oplossing in een petrischaal. Om overbevolking in de schalen te minimaliseren, plaats ongeveer 100 embryo's per 100 millimeter schaal. Sorteer de klevende embryo's in de tweecellig fase in een aparte schaal waarin stereotypische pigmentatie de dorsale ventrale toegang met verwijzing naar sulfaatkaarten zeker markeert.

Identificeer correct klevende embryo's door ervoor te zorgen dat de eerste klof, die het middensagittale vlak afbakent, de donker gepigmenteerde dierlijke pool en de licht gepigmenteerde dierlijke pool bisecteert, zodat de twee helften spiegelbeelden zijn. Monteer vervolgens een gefabriceerde micropipet op een multi-assige micromanipulator. Verbind de micropipet met een micro-injector.

Gebruik een plastic overdrachtspipet om ongeveer vijf van de achtcellig embryo's te aspireren en breng ze over naar de opvangschaal met 0.5X Steinberg's oplossing. Gebruik een haarloep om de te bemonsteren embryo in een afzonderlijke put te plaatsen en zorg ervoor dat de correct geïdentificeerde cel van belang op een hoek van ongeveer 90 graden voor de microprobe staat. Terwijl u onder de stereomicroscoop werkt, leidt u de punt van de micropipet in de geïdentificeerde enkele cel in het levende embryo.

Trek een gewenste portie van de inhoud van de cel door negatieve drukpulsaties toe te passen op de microcapillair met behulp van de micro-injector. Trek de microprobe voorzichtig uit de cel en breng de punt over in vier microliter van het gekoelde metabolietextractie-oplosmiddel in een micro-vial. Breng vervolgens een drukgolf van positief 80 psi gedurende één seconde aan op de capillair met behulp van de micro-injector om het aspiraat in het oplosmiddel te verdrijven.

Sluit de vial strak om verdamping te voorkomen en plaats de vial terug op ijs totdat het bemonsteren voltooid is. Zodra het bemonsteren voltooid is, vortexmix de monsters die microcentrifugevials bevatten gedurende ongeveer één minuut om de extractie van metabolieten te versnellen. Centrifugeer vervolgens de vials gedurende vijf minuten bij 8.000 g bij vier graden Celsius om cellulaire deeltjes en andere deeltjes te pelleten.

Bewaar de celextracten samen met de celdeeltjes en het precipitaat bij Minuus 20 graden Celsius gedurende een dag of bij Minuus 80 graden Celsius gedurende maximaal één maand totdat ze gemeten worden door CE-ESI-MS. Bouw het CE-injectieplatform op dat in staat is tot snelle verticale translatie van een platform dat de achtergrondelektrolytvial en de monsterlaadmicrovial bevat, zoals vermeld in het tekstprotocol. Monteer de CE-ESI-interface door eerst de elektrospray metalen emitter in een drie-poorts T-verbinding te plaatsen.

Voer vervolgens de scheidings capillair van de CE door de elektrospray emitter, waardoor deze ongeveer 40 tot 100 micron voorbij de punt van de emitter uitsteekt. Werk onder een stereomicroscoop om nauwkeurigheid te bevorderen. Verbind de capillair van de elektrospray oplossing met de resterende poort om de elektrospray oplossing te leveren.

Gebruik geschikte hulzen en vingervaste verbindingen voor lekvrije werking van de CE-ESI-interface. Gebruik een platenhouder om de CE-ESI-interface op een drie-assige vertaaltafel te monteren en plaats de punt van de elektrospray emitter ongeveer twee millimeter van de oriëntatie van de massaspectrometer. Om de componenten van de interface schoon te maken, levert u eerst de elektrosprayoplossing door de elektrospray emitter met een snelheid van één microliter per minuut en de BGE door de CE scheidings capillair.

Gebruik sp