Name: Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Leer microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in levende Xenopus laevis embryo's. Deze snelle, minimaal invasieve methode karakteriseert metabolieten tijdens ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid-subsidies GM114854 (tot P.N.) en CA211635 (tot P.N.), Arnold en Mabel Beckman Stichting Beckman Young Investigator toekennen (P.N.), de DuPont jonge Professor award (naar P.N.), de American Society for massa Spectrometrie Research Award (tot P.N.), en de Stichting van de Club van de kosmos-beurzen (aan R.M.O. en E.P.P.). De adviezen en conclusies in deze publicatie uitgedrukt zijn uitsluitend die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de financieringsbronnen.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microprobe CE-ESI-MS in staat stelt de directe karakterisering van metabolieten in afzonderlijke cellen in levend, vrij ontwikkeling van embryo's. De kern van de aanpak zijn twee technische onderdelen, namelijk in situ capillaire microsampling en hoog-gevoeligheids CE-ESI-MS. vergeleken met geheel-cel dissectie, capillaire microsampling heeft het voordeel van snelle werking (enkele seconden vs. 5 min / cel door dissectie), compatibiliteit met de complexe driedimensionale morfologie van embryo's en schaalbaarheid...

Een grondig inzicht in de embryonale ontwikkeling vereist karakterisering van alle moleculaire veranderingen die in elke cel van het ontwikkelende organisme ontvouwen. Next-Generation Sequencing met moleculaire versterking maakt diepe meting van eencellige transcriptomes1 in ontwikkelende systemen2,3, aanzienlijk minder is bekend over de suite van kleinere moleculen geproduceerd in één embryonale cellen, met inbegrip van eiwitten en, vooral, metabolieten (moleculaire massa &#60; ~ 1.500 Da). Met een snelle en dynamische respons op intrinsieke en extrinsieke gebeurtenissen fungeert de metabolome als een krachtige descriptor van moleculaire staat van een cel. De eencellige metabolome, roept daarom de mogelijkheden voor het bijhouden van de ruimtelijke en temporele ontwikkeling van cel heterogeniteit in de vroege embryo en identificeren van nieuwe moleculen voor functionele studies. Echter zonder moleculaire amplificatie beschikbaar voor deze moleculen vraagt detectie van de metabolome om uitzonderlijke gevoeligheid met behulp van spectrometrie van de massa (MS), die is de technologie van de keuze voor metaboliet analyse.
Eencellige MS is een verzameling van technologieën met voldoende gevoeligheid voor het meten van metabolieten in afzonderlijke cellen (Zie beoordelingen 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Reproduceerbaar bemonstering van cellen en efficiënte winning van metabolieten zijn essentieel voor de succesvolle opsporing van metabolieten in afzonderlijke cellen. Geheel-cel dissectie van geïdentificeerde cellen uit Xenopus embryo's heeft de karakterisatie van kleine moleculen en peptiden16ingeschakeld. Andere benaderingen hanteren micropipetten om te proeven van de individuele levende cellen gevolgd door detectie met behulp van electrospray ionisatie (ESI) MS. Bijvoorbeeld, de metabolieten in plant of zoogdiercellen werden gemeten door eencellige video MS17, druk sonde18, één sonde19en fluidic kracht microscopie20, onder andere technieken21, 22,23,24. Bovendien vereenvoudigt de opneming van chemische scheiding vóór ionisatie in de eencellige MS workflow efficiënt de metabolome, dus het verlichten van eventuele storingen tijdens ion generatie voor detectie. Bovenal biedt scheiding ook verbinding-specifieke informatie om te helpen in de moleculaire identificaties. Capillaire elektroforese (CE) is gebruikt voor het detecteren van metabolieten in één ontleed25,26 of microsampled27neuronen, vastleggen van kleine-molecuul verschillen tussen neuron fenotypen. We onlangs aangepast CE aan ESI tandem MS het traceringsniveau detectie van honderden metabolieten in afzonderlijke cellen die werden ontleed van vroege embryo's van Xenopus laevis16,28inschakelen. Deze studies bleek verrassend metabole verschillen tussen embryocellen in een vroeg stadium van ontwikkeling en leidde tot de ontdekking van metabolieten met eerder onbekende developmental effecten16.
Wij bieden hier een protocol dat de detectie van metabolieten in afzonderlijke cellen rechtstreeks in een levende gewervelde embryo met behulp van microprobe eencellige CE-ESI-MS29,30ingeschakeld. De model-organisme gekozen is de 8-tot-32-cel X. laevis embryo, hoewel de aanpak ook voor de latere stadia van ontwikkeling en andere soorten modelorganismen geldt. Dit protocol maakt gebruik van aangescherpte haarvaten met multi-as vertalende controle onder begeleiding door een high-resolution imaging systeem naar een ~ 10 nL gedeelte van geïdentificeerde cellen in situ in het morfologisch complexe zich ontwikkelende embryo gecombineerd. Deze microprobe is schaalbaar naar kleinere cellen en opereert binnen seconden, dat is voldoende snel om bij te houden van de cel geslachten in het embryo. Na uitpakken polar of apolaire kleine molecules, zoals metabolieten en peptides, uit de verzamelde monster in ~ 4-5 µL extractievloeistof, een ~ 10 nL van de resulterende uittreksel wordt geanalyseerd in een op maat gemaakte CE-platform naar een massaspectrometer ESI afgebroken. Bouw en de exploitatie van het CE-ESI-multiple sclerose platform is gebaseerd op protocollen elders beschreven. 31 , 32 de co-axiale CE-ESI-interface wordt geconstrueerd zoals elders beschreven. 31 dit platform wordt onderhouden in het regime kegel-jet sproeien om het traceringsniveau gevoeligheid met een capaciteit voor kwantificering over een 4-5 log-volgorde dynamisch bereik (relatieve28,29,30 of absolute16). Het CE-ESI-MS platform biedt een 60-amol ondergrens voor detectie met 8% relatieve standaardafwijking (RSD) in kwantificatie over een geteste bereik van 10 nM tot 1 µM voor kleine molecules16, die toereikend zijn om te karakteriseren van endogene metabolieten in X. laevis cellen. Microprobed cellen blijven verdelen gaandeweg de embryo via ontwikkeling30, waardoor stoffelijk als ruimtelijk opgelost analyse van cellulaire metabolisme. Inderdaad, eencellige CE-ESI-MS kan worden gebruikt voor het vinden van metabole verschillen tussen cellen die de dorsal-ventrale16,29, dier-plantaardige16, links-rechts28 developmental assen alsmede cellen in beslag nemen die vormen het zenuwweefsel gedoemd dorsale afstamming van een gemeenschappelijk progenitor cel in X. laevis30. Naast het opvragen van metabole verschillen tussen afzonderlijke embryonale cellen op verschillende ontwikkelingsstadia van de X. laevis embryo30, wij verwachten dat de protocollen die hier worden beschreven zijn van toepassing op een breed scala van biomoleculen en de microsampled van de afzonderlijke cellen uit verschillende stadia van embryonale ontwikkeling, alsmede andere soorten cellen en modelorganismen. Bovendien, kan de microprobe worden gebruikt voor microsampling, terwijl een ander platform compatibel met minuscule monsters kan worden gebruikt voor scheiding en/of karakterisering van biomoleculen.

<table><tbody><tr><td>Reagents voor embryocultuurmedia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>Calciumnitraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Cysteïne</td><td>MP Biomedicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Trizmahydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizmabase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Metabolietenextractieoplosmiddelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril (LC-MS-kwaliteit)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-kwaliteit)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS-kwaliteit)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Oplosmiddelen en normen voor CE-ESI-MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur (LC-MS-kwaliteit)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-kwaliteit)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS-kwaliteit)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholinechloride</td><td>Acros Organics</td><td>159170050</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Microprobefabricage-opstelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropijpjestrekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillairen</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Fijne scherpe pincetten: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>Corrosiebestendig en autoklaveerbaar.</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Microprobemonsternemingsopstelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Moet vibratiegeïsoleerd zijn.</td></tr><tr><td>Verlichter b.v. Goosenecks</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten (Kunststof, wegwerp)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal 60 mm en 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Pasteurpipetten (Borosilicaat, wegwerp)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>CE-ESI-MS-opstelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoogspanningsvoeding</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td>De HVPS kan op afstand worden bestuurd met behulp van een laagspanningsprogramma dat wordt gegenereerd door een personal computer. Let op: Hoge spanning vormt een elektrische schokgevaren; alle verbindingsonderdelen moeten worden geaard of zorgvuldig worden afgeschermd om te voorkomen dat gebruikers per ongeluk worden blootgesteld.</td></tr><tr><td>Spuitpompen (2)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>Stereomicroscoop die geschikt is voor 4,5&times; vergroting, uitgerust met een verlichter om de spuitmodus van de CE-ESI-interface te controleren.</td></tr><tr><td>XYZ-translatietafel</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ-translatietafel</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Deze platform is in staat om nanoliter-hoeveelheden monster via hydrodynamische injectie in de scheidingskapillaren te laden en het BGE voor CE te leveren. Beide interfaces die in dit werk worden beschreven, waren in staat om 6&ndash;10 nL monster binnen 1 min in een 1 m scheidingskapillaren te injecteren</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen monstervial</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen BGE-vial</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gefusieerd silicakapillaren (40 &micro;m/105 &micro;m ID/OD; 100 cm)</td><td>Polymicro technologieën</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>Gefusieerd silicakapillaren (75 &micro;m/360 &micro;m ID/OD; 100 cm)</td><td>Polymicro technologieën</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen emitter met stompe punten (130/260 &micro;m ID/OD)</td><td>Hamilton Co.</td><td>21031A</td><td>Voor betere prestaties, laser-cleave en polijst de emittertip fijn.</td></tr><tr><td>Spuiten (gasdicht): 500 - 1000 &micro;L</td><td>Hamilton Co.</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Digitaal multimeter</td><td>Fluke</td><td>Fluke 117</td><td></td></tr><tr><td>Hoge resolutie massaspectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td>Maxis Impact HD</td><td>Hoge resolutie tandemmassaspectrometer uitgerust met een atmosferische drukinterface die is geconfigureerd voor ESI</td></tr><tr><td>Afvuringsmix voor massaspectrometerkalibratie</td><td>Agilent technologies</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis ver. 4.3 software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Aanvullend materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuumconcentrator die geschikt is voor gebruik bij 4&ndash;10&deg;C

microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in live kikker (xenopus laevis) embryo 's

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

De kwantificering van kleine molecules in afzonderlijke cellen werpt nieuwe mogelijkheden om beter inzicht te krijgen in de fundamentele processen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het embryo. Inschakelen eencellige onderzoeken rechtstreeks in levende embryo's, nieuwe analytische benaderingen nodig zijn, met name die gevoelige, selectieve kwantitatieve, robuust en schaalbaar naar de andere cel maten. Hier presenteren we een protocol waarmee de in situ -analyse van het metabolisme in afzonderlijke cellen in vrij ontwikkeling van embryo's van de Zuid-Afrikaanse klauwkikker kikker (Xenopus laevis), een krachtig model in cel en ontwikkelingsbiologie. Deze aanpak gebruikt een capillaire microprobe om een bepaald gedeelte uit één geïdentificeerde cellen in het embryo, verlaten naburige cellen intact voor latere analyse gecombineerd. De verzamelde celinhoud wordt geanalyseerd door een microscale capillaire elektroforese electrospray ionisatie (CE-ESI) interface gekoppeld aan een massaspectrometer high-resolution tandem. Deze aanpak is schaalbaar tot verschillende groottes van de cel en compatibel met de complexe driedimensionale structuur van het zich ontwikkelende embryo. Als voorbeeld tonen we dat microprobe die eencellige CE-ESI-MS in staat de opheldering van metabolische cel heterogeniteit dat zich ontvouwt stelt als een progenitor cel aanleiding tot nakomelingen tijdens de ontwikkeling van het embryo geeft. Naast cel en ontwikkelingsbiologie zijn de protocollen van de analyse van de eencellige hier beschreven vatbaar voor andere cel formaat, celtypes of diermodellen.

Wij dienst onlangs microprobe eencellige CE-ESI-MS te karakteriseren van metabolieten in afzonderlijke geïdentificeerde cellen in vrij ontwikkelen Xenopus laevis embryo's29,30. De microprobe maakt snel (~ 5 sec/cel), in situ aspiratie van ~ 10 nL van een afzonderlijke cel, meerdere aspiraties van dezelfde cel of meerdere andere cellen binnen de dezelfde of latere stadia van ontwikkeling van de levende embryo (<st...

We worden stappen beschreven waarmee snel in situ bemonstering van een klein gedeelte van een afzonderlijke cel met hoge precisie en minimale invasie met behulp van capillaire gebaseerde micro-sampling, ter vergemakkelijking van chemische karakterisering van een momentopname van de metabole activiteit in levende embryo's met behulp van een custom-built eencellige capillaire elektroforese en massaspectrometrie platform.

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Het algemene doel van dit protocol is om metabolieten in levende cellen van zich ontwikkelende embryo's te karakteriseren door in situ microsampling capillaire elektroforese-massaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cel- en ontwikkelingsbiologie, omdat het de analyse van metabolisme in enkele cellen direct in levende zich ontwikkelende embryo's mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel is, schaalbaar voor verschillende celgroottes en minimaal invasieve bemonstering van individuele cellen in levende embryo's mogelijk maakt.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat sommige stappen moeilijk te leren zijn omdat het embryo zich relatief snel ontwikkelt en een op maat gemaakt capillaire elektroforese elektrospray ionisatie-instrument wordt gebruikt. Begin deze procedure met de bereiding van 2% agarose in een 1X Steinberg's oplossing. Terwijl het nog vloeibaar is, bekleed de bodem van 60 millimeter petrischalen met de oplossing.Zodra de agarosegel is afgekoeld en gestold, verbrand het uiteinde van een zes-inch Pasteurpipet tot het een bol vormt. Druk vervolgens lichtjes op het verwarmde uiteinde om vijf tot 10 putjes van ongeveer één millimeter diep in de agarose af te drukken. Om micropipetten met taps toelopende punten te maken, trekt u eerst borosilicaat capillairen in een Flaming/Brown type capillairtrekker met behulp van de instellingen die in het tekstprotocol staan vermeld.Vervolgens breekt u de punt van de getrokken micropipet af met behulp van een paar fijne scherpe pincetten om een capillaire buitendiameter van ongeveer 20 micron te verkrijgen. Voer deze stap uit onder een stereomicroscoop om precisie en reproduceerbaarheid te bevorderen. Verkrijg embryo's door gonadotropine-geïnduceerde natuurlijke paring van volwassen xenopus laevis of via in vitro bevruchting zoals vermeld in het tekstprotocol.Verwijder de jellycoats rond de embryo's zodra ze beginnen te kloven tot de tweecellig fase door de embryo's eerst twee minuten in de dejellying oplossing te laten rusten. Draai ze vervolgens zachtjes nog twee minuten rond om te voorkomen dat de embryo's aan de oppervlakte van de opvangschaal blijven kleven. Giet de inhoud van de schaal voorzichtig in een schone beker en decant snel de dejellying oplossing uit de beker.Bedek de eieren onmiddellijk met 0.1X Steinberg's oplossing om de resterende dejellying oplossing af te spoelen. Draai zachtjes rond en decant vervolgens de oplossing. Herhaal deze stap vier keer om de embryo's grondig te wassen.Breng de ontdekte embryo's over naar 1X Steinberg's oplossing in een petrischaal. Om overbevolking in de schalen te minimaliseren, plaats ongeveer 100 embryo's per 100 millimeter schaal. Sorteer de klevende embryo's in de tweecellig fase in een aparte schaal waarin stereotypische pigmentatie de dorsale ventrale toegang met verwijzing naar sulfaatkaarten zeker markeert.Identificeer correct klevende embryo's door ervoor te zorgen dat de eerste klof, die het middensagittale vlak afbakent, de donker gepigmenteerde dierlijke pool en de licht gepigmenteerde dierlijke pool bisecteert, zodat de twee helften spiegelbeelden zijn. Monteer vervolgens een gefabriceerde micropipet op een multi-assige micromanipulator. Verbind de micropipet met een micro-injector.Gebruik een plastic overdrachtspipet om ongeveer vijf van de achtcellig embryo's te aspireren en breng ze over naar de opvangschaal met 0.5X Steinberg's oplossing. Gebruik een haarloep om de te bemonsteren embryo in een afzonderlijke put te plaatsen en zorg ervoor dat de correct geïdentificeerde cel van belang op een hoek van ongeveer 90 graden voor de microprobe staat. Terwijl u onder de stereomicroscoop werkt, leidt u de punt van de micropipet in de geïdentificeerde enkele cel in het levende embryo.Trek een gewenste portie van de inhoud van de cel door negatieve drukpulsaties toe te passen op de microcapillair met behulp van de micro-injector. Trek de microprobe voorzichtig uit de cel en breng de punt over in vier microliter van het gekoelde metabolietextractie-oplosmiddel in een micro-vial. Breng vervolgens een drukgolf van positief 80 psi gedurende één seconde aan op de capillair met behulp van de micro-injector om het aspiraat in het oplosmiddel te verdrijven.Sluit de vial strak om verdamping te voorkomen en plaats de vial terug op ijs totdat het bemonsteren voltooid is. Zodra het bemonsteren voltooid is, vortexmix de monsters die microcentrifugevials bevatten gedurende ongeveer één minuut om de extractie van metabolieten te versnellen. Centrifugeer vervolgens de vials gedurende vijf minuten bij 8.000 g bij vier graden Celsius om cellulaire deeltjes en andere deeltjes te pelleten.Bewaar de celextracten samen met de celdeeltjes en het precipitaat bij Minuus 20 graden Celsius gedurende een dag of bij Minuus 80 graden Celsius gedurende maximaal één maand totdat ze gemeten worden door CE-ESI-MS. Bouw het CE-injectieplatform op dat in staat is tot snelle verticale translatie van een platform dat de achtergrondelektrolytvial en de monsterlaadmicrovial bevat, zoals vermeld in het tekstprotocol. Monteer de CE-ESI-interface door eerst de elektrospray metalen emitter in een drie-poorts T-verbinding te plaatsen.Voer vervolgens de scheidings capillair van de CE door de elektrospray emitter, waardoor deze ongeveer 40 tot 100 micron voorbij de punt van de emitter uitsteekt. Werk onder een stereomicroscoop om nauwkeurigheid te bevorderen. Verbind de capillair van de elektrospray oplossing met de resterende poort om de elektrospray oplossing te leveren.Gebruik geschikte hulzen en vingervaste verbindingen voor lekvrije werking van de CE-ESI-interface. Gebruik een platenhouder om de CE-ESI-interface op een drie-assige vertaaltafel te monteren en plaats de punt van de elektrospray emitter ongeveer twee millimeter van de oriëntatie van de massaspectrometer. Om de componenten van de interface schoon te maken, levert u eerst de elektrosprayoplossing door de elektrospray emitter met een snelheid van één microliter per minuut en de BGE door de CE scheidings capillair.Gebruik sp

microprobe-capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-for-single

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

Hier presenteren we protocollen om zowel ambient massaspectrometrie beeldvorming (MSI) van weefsels en in-situ live enkele cel MS (SCMS) analyse uit te voeren met behulp van de enkele sonde, een geminiaturiseerd multifunctioneel apparaat voor MS analyse.

Toepassingen van de single-probe: massaspectrometrie Imaging en Single Cell Analysis onder omgevingsomstandigheden

Een geïntegreerde cel manipulatie platform is ontwikkeld voor gebruik in combinatie met een single-probe massaspectrometrie Setup voor de on-line analyse van individuele schorsing cellen onder omgevingsomstandigheden.

Geïntegreerde cel manipulatie platform in combinatie met de single-probe voor massaspectrometrie analyse van drugs en metabolieten in enkele schorsing cellen

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Hier beschrijven we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische karakterisering van cellijnen met bekende weefsellotgevallen in het gewervelde Xenopus laevis-embryo .

Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Dit protocol heeft tot doel celmetabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometrie (SCMS) door het wassen van vluchtige zoutoplossingen, het snel afschrikken van vloeibare stikstof, vriesdrogen en opslag van -8 °C te combineren. Het toont aan dat het afschrikken van vloeibare stikstof essentieel is voor het behoud van metabolietprofielen, terwijl langdurige koude opslag tot een minimum moet worden beperkt om metabole veranderingen te voorkomen.

Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

We bieden gedetailleerde methoden om beginnende transcripten metabolisch te labelen en te zuiveren voor transcriptoomanalyse in vroege embryo's van Xenopus met behulp van 5-ethynyl-uridine (5-EU).

Metabole labeling van het ontluikende transcriptoom in de vroege embryogenese van Xenopus

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Leer microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in levende Xenopus laevis embryo's. Deze snelle, minimaal invasieve methode karakteriseert metabolieten tijdens ontwikkeling.

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

Meer video's verkennen