Geautomatiseerde meting van Cryptococcal soorten Polysaccharide Capsule en cel lichaam
11 januari 2018
Deze techniek wordt beschreven van een geautomatiseerde batch-beeldprocessor, bedoeld voor het meten van de polysacharide capsule en lichaam stralen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor Cryptococcus neoformans capsule metingen die de geautomatiseerde image processor kan ook worden toegepast op andere gebaseerd contrastdetectie van cirkelvormige objecten.
Het algemene doel van deze techniek is om vervelende handmatige metingen te automatiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cryptococcus, zoals de relatie tussen de grootte van de capsule of de celkern en de verschillende aspecten van virulentie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om enorme steekproeven te analyseren zonder vermoeidheid.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van cryptococcose, omdat de grootte van de capsule en de celkern belangrijke aspecten zijn van de ziekteverwekker. Om een India Ink Slide voor te bereiden, begint u met het pipetten van 10 microliter cryptococcus-monster op een plaatje. Elke ronde yi-stam werkt, maar voor dit experiment werd H99 de enige gebruikte stam.
Pipet twee microliter India Ink-verf op het monster en meng het door de pipettip fysiek in het monster te duwen en in een cirkelvormige beweging te bewegen tot de India Ink gelijkmatig verdeeld lijkt. Plaats een dekglas over het monster door de linkerrand van het dekglas tegen het oppervlak van de plaat te houden. Breng vervolgens voorzichtig en gelijkmatig de andere kant van het dekglas over het monster.
Laat de plaat vijf minuten aan de lucht drogen. Breng vervolgens een lichte laag nagellak aan op de rand van het dekglas om een afdichting te vormen en de India Ink-verf te behouden. Om de monsters af te beelden, plaatst u een plaatje onder een helderveldmicroscoop met de camera-aansluiting en bekende pixel-naar-micron conversie. Pas de filters, objectieven en contrasten aan en zorg ervoor dat het gezichtsveld dicht, maar niet overbevolkt is met cryptococcus-cellen met een duidelijk contrast tussen de celcapsule en de achtergrond, en goed gefocust met de celkern gevisualiseerd als een donkere band. Nadat u foto's hebt gemaakt, slaat u ze op in een enkele map met duidelijke titels, omdat het meetalgoritme op afbeeldingen in een enkele map zal worden uitgevoerd en de uitvoergegevens zullen worden georganiseerd volgens de namen van de afbeeldingsbestanden. Volg de instelling van het algoritme volgens het tekstprotocol en voer de toepassing uit door te dubbelklikken op QCA.py.
Tijdens het volgen van de stappen in het programma, voert u het type extensie van de afbeeldingsbestanden in, voorafgegaan door een punt en gescheiden door puntkomma's. Klik vervolgens op de Enter-knop. Kies de map waar de afbeeldingsbestanden zich bevinden door op de Select Directory-knop te klikken en selecteer de map die de afbeeldingen bevat.
Genereer de lijst met afbeeldingsbestanden in de map door op de Generate Image List-knop te klikken. De afbeeldingen worden vermeld in het tekstvak aan de rechterkant. Controleer en zorg ervoor dat de lijst nauwkeurig en compleet is.
Selecteer vervolgens een willekeurige afbeelding uit de lijst om als voorbeeld te gebruiken door op de Select Random Image-knop te klikken. Voer vervolgens de microscoopobjectieven en binning-instellingen in. Als de standaardinstellingen niet overeenkomen met de gebruikte microscoop, selecteert u Custom Pixel Conversion en voert u de pixel naar micrometer conversie voor de afbeeldingsbestanden in.
Nadat u deze hebt geselecteerd, klikt u op de Calculate Conversion-knop en controleert u of de conversie correct is volgens het tekstvak aan de rechterkant. Om de algoritmeparameters voor cirkeldetectie in te voeren, voert u de minimale en maximale detecteerbare straal in voor de buitenste capsuledetectie, als de min en max capsulestraal vermeldingen. Voer vervolgens de minimale en maximale detecteerbare straal in voor celkerndetectie als de min en max celkernstraal vermeldingen.
Verplaats nu de capsule- en celkerngevoeligheidsschuifregelaars om de gevoeligheidsdrempel van het algoritme aan te passen. Een lage gevoeligheid zal strikt zijn en valse positieve cirkeldetectie verminderen, maar kan ook minder echte cirkels detecteren. Omgekeerd zal een hoge gevoeligheid de detectieratio verhogen, maar kan ook leiden tot valse positieve cirkels.
Maximiseer het aantal gedetecteerde lichamen en capsules en inspecteer visueel of de cirkels correct lijken te passen. Het aantal lichamen binnen de gedetecteerde capsules zal worden weergegeven in het tekstvak aan de rechterkant. Anders manipuleert u de algoritmeparameters totdat de resultaten nauwkeurig zijn.
Voer het detectiealgoritme uit op de volledige map met afbeeldingsbestanden door op de Begin Analysis-knop te klikken. Elke afbeelding wordt geanalyseerd en het programma toont Finished in het tekstvak aan de rechterkant wanneer alle afbeeldingen zijn geanalyseerd. Klik vervolgens op de Match and Cleanup-knop.
Dit zal gedetecteerde celkernen matchen met de gedetecteerde capsules waarin ze zich bevinden en de werkelijke capsulestraal berekenen door het lichaam van de capsule af te trekken. Zoek in de afbeeldingsmap de voltooide gegevens in het CleanedOutput. csv-bestand.
Als er slechts één gegevensstuk is geselecteerd, wordt het bestand CleanedBodies. csv of CleanedCapsules.csv genoemd. Zoals hier te zien is in deze microscopische afbeelding van een India Ink-plaatje, zijn de cellen gescheiden en in voldoende lage dichtheid om het gezichtsveld niet te overweldigen.
Er is ook voldoende kleurstof gebruikt om contrast te creëren tussen de cellen en de achtergrond. Het algoritme bepaalt een drempelwaarde uniek voor elke afbeelding door de gemiddelde intensiteitswaarde te nemen en de standaarddeviatie toe te voegen. Pixelintensiteiten met een intensiteit hoger dan de drempelwaarde worden als wit beschouwd en met een lagere intensiteit als zwart.
De celkern moet worden gevisualiseerd als een robuuste, zwarte cirkel op de witte achtergrond van de capsule. Het beste brandpunt om te gebruiken is een waarop de celkern als een donkere, geconcentreerde band verschijnt. Dit brandpunt is acceptabel als standaard, omdat het de cel goed focust.
Dit wordt bevestigd door de celwand te visualiseren met UVITEX, een soort kleurstof die een scherpe, scherp gefocuste celwand met een zwak signaal in het midden duidelijk maakt. Wanneer het protocol nauwkeurig wordt gevolgd en optimale afbeeldingen worden verkregen, is het algoritme nauwkeurig en betrouwbaar. Als het protocol echter verkeerd wordt gevol
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze techniek beschrijft een geautomatiseerde batch-beeldprocessor die is ontworpen om de radii van de polysacharidecapsule en het cellichaam te meten. Hiermee is de analyse van grote monstervolumes mogelijk, wat onderzoek binnen het cryptococcose-veld faciliteert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Microbiologie
- Pathogeenanalyse
Achtergrond
- De grootte van de capsule en het cellichaam zijn kritische factoren in de virulentie van Cryptococcus neoformans.
- Handmatige metingen zijn tijdrovend en foutgevoelig door vermoeidheid.
- Het automatiseren van dit proces kan de efficiëntie van het onderzoek verhogen.
- India-inktkleuring wordt gebruikt om de capsules en cellen te visualiseren.
Doel van de studie
- Om de meting van de capsule- en cellichaamsgrootte in cryptokokken-cellen te automatiseren.
- Om de relatie tussen deze afmetingen en virulentie te onderzoeken.
- Om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de metingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van India-inktpreparaten voor beeldvorming.
- Gebruik van bright-field microscopie voor visualisatie.
- Implementatie van een geautomatiseerd algoritme voor beeldverwerking.
- Analyse van beeldbestanden om de radii van de capsule en het cellichaam te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- De geautomatiseerde processor kan grote hoeveelheden beelden efficiënt analyseren.
- Er werden nauwkeurige metingen van de capsule- en lichaamsgrootte verkregen.
- De techniek bleek betrouwbaar wanneer aan de optimale beeldvormingscondities werd voldaan.
- De resultaten kunnen therapeutische benaderingen voor cryptococcosis informeren.
Conclusies
- Deze methode vermindert de benodigde tijd voor metingen aanzienlijk.
- Het verbetert de mogelijkheid om de virulentiefactoren van Cryptococcus neoformans te bestuderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere circulaire objecten in microbiologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Geautomatiseerde meting van de cryptococcale polysacharidecapsule en de afmetingen van het cellichaam pakt een kritiek knelpunt in onderzoek naar virulentie van pathogenen aan door high-throughput, reproduceerbare kwantificering mogelijk te maken. Deze mogelijkheid ondersteunt targetvalidatie en mechanistische risicovermindering in antifungal discovery-programma's door gestandaardiseerde, schaalbare gegevens te leveren over belangrijke virulentiedeterminanten. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door meetvariabiliteit te verminderen en statistisch robuuste correlaties tussen capsulegrootte en pathogeen potentieel te faciliteren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de therapeutische hypothese die capsulegrootte aan virulentie koppelt te onderzoeken via nauwkeurige, geautomatiseerde morfometrische analyse.
- Operationele waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door consistente, vermoeidheidsvrije metingen te leveren over grote steekproeven.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door betrouwbare kwantitatieve gegevens over virulentiefactoren van pathogenen te genereren voor go/no-go-beslissingen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door het vaststellen van een gestandaardiseerd protocol voor de meting van de capsule en het cellichaam.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van algoritmische drempelwaarde-bepaling en cirkeldetectie, onafhankelijk van vermoeidheid van de operator.
- Schaalbaarheid: Faciliteert high-throughput data-analyse, wat krachtige statistische evaluatie van virulentiecorrelaties over grote datasets mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt de virulentiebeoordeling in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door ziekterelevante systeemmetingen van de cryptokokkenmorfologie te leveren.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Ondersteunt datagestuurde beslissingen over antifungale kandidaten door metingen van de kapselgrootte te koppelen aan het pathogene potentieel.
- Mechanistische Risicoreductie: Richt zich op de voorspellende waarde door de variabiliteit in een belangrijk virulentie-geassocieerd fenotype te minimaliseren.
Integratie van Pijplijn en Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische evaluatie, waardoor een consistente meting van cryptokokken-virulentiefactoren over verschillende onderzoeksfasen heen mogelijk wordt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door de grootte van de capsule en het cellichaam te kwantificeren als indicatoren voor het virulentiepotentieel.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en kwantitatieve output via geautomatiseerde beeldanalyse, waardoor een betrouwbare evaluatie van het effect van verbindingen op de morfologie van pathogenen mogelijk wordt.
- Analytica: Genereert nauwkeurige metingen van de capsule- en lichaamsstraal, waarmee teams condities kunnen vergelijken en de therapeutische impact op de virulentie kunnen beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit via ziekte-relevante morfologische metrieken die de beoordeling van de virulentie informeren.
- Enterprise Hergebruik: Functioneert als een herbruikbare analytische beeldvormingscapaciteit die toepasbaar is op meerdere stammen en experimentele condities binnen cryptokokkenonderzoek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in target-validatie door verminderde meetvariabiliteit en verhoogde betrouwbaarheid van virulentie-geassocieerde gegevens.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid bereikt via algoritmische verwerking van met India-inkt gekleurde monsters.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door het mogelijk maken van vroege, robuuste virulentieprofilering.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en besluitvorming over verdere ontwikkeling, ondersteund door getrouwe morphometrische data in grote volumes.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microbiologische monstervoorbereiding en helderveldmicroscopie voor optimale India Ink-kleuring en visualisatie.
- Afhankelijk van beeldbewerkingsinfrastructuur met een bekende pixel-naar-micron-conversie en camera-aansluiting voor nauwkeurige kalibratie van het algoritme.
- Vereist standaardisatie van beeldacquisitieparameters (dichtheid, focus, contrast) tussen teams om de nauwkeurigheid van het algoritme over verschillende gebruikers te waarborgen.
- Vereist aanpassing van algoritmeparameters (min/max radius, gevoeligheid) bij toepassing op verschillende cryptokokkenstammen of beeldsystemen.
- Beperkt tot de detectie van cirkelvormige objecten; de prestaties kunnen afnemen bij niet-morfologische monsters of suboptimale kleuring die leidt tot pseudo-cirkelartefacten.
