Name: Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer de real-time meting van epitheliale barrièrepermeabiliteit in menselijke intestinale organoïden met fluorescentie-microscopie. Deze methode visualiseert en kwantificeert veranderingen door farmacologische behandelingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedank Drs. Stephanie Spohn en Basel Abuaita voor de vele nuttige discussies op organoid microinjection. JRS wordt ondersteund door de intestinale stamcel Consortium (U01DK103141), een gezamenlijk onderzoeksproject, gefinancierd door het nationale Instituut van Diabetes en spijsverterings en ziekten van de nier (NIDDK) en het National Institute of Allergy en besmettelijke ziekten (NIAID). JRS en VBY worden ondersteund door de roman NIAID, alternatief modelsystemen voor zuurbestendige ziekten (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH wordt ondersteund de mechanismen van microbiële pathogenese opleiding subsidie van de National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID, T32AI007528) en het klinisch en translationeel Science award aan de Michigan-Instituut voor klinische en gezondheid Onderzoek (UL1TR000433).
De volledige gegevensbestanden en data analyse code die wordt gebruikt in dit manuscript zijn beschikbaar op https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

<ol><li>Standring, S., Borley, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStandring%2C+S+%22Gray%27s+anatomy%3A+The+anatomical+basis+of+clinical+practice%22">Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice</a>. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+tight+junction+barrier+regulation+and+mucosal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+defense%3A+The+leaky+epithelial+barrier+in+intestinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease.</a> Lab Invest. 84, 282-291 (2004).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability-a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+A+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+sites+of+mannitol+permeability+of+small+and+large+intestine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat.</a> Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).</li>
<li>Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+tests+in+coeliac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability tests in coeliac disease.</a> Clin Lab. 47, 143-150 (2001).</li>
<li>Salles Teixeira, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability+measurements%3A+General+aspects+and+possible+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Hosp%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls.</a> Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
<li>Donato, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+permeability+in+a+commonly+used+epithelial+cell+line%3A+T84+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).</li>
<li>Balimane, P. V., Chong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+models+for+intestinal+permeability%3A+A+critique%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique.</a> Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).</li>
<li>Vidyasagar, S., MacGregor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ussing+chamber+technique+to+measure+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability.</a> Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).</li>
<li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Ussing%27s+chambers%3A+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).</li>
<li>Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+human+adult+stem+or+progenitor+cell+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>Aurora, M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPSC-derived+lung+and+intestinal+organoids+as+models+of+human+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue.</a> Dev Biol. 420, 230-238 (2016).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+human+intestinal+tissue+from+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro.</a> Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+toxin+production+by+clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infect Immun. 83, 138-145 (2015).</li>
<li>Leslie, J. L., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole+new+ball+game%3A+Stem+cell-derived+epithelia+in+the+study+of+host-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions.</a> Anaerobe. 37, 25-28 (2016).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2FColonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Hill, D. R., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+Understanding+the+molecular+basis+of+the+host-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+nHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+bacteroides+thetaiotaomicron+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).</li>
<li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+intestinal+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+clostridium+difficile+infection%3A+Inhibition+of+nHE3+and+microbiota+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).</li>
<li>Bancroft, J., Gamble, M. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=Dhn2KispfdQC">Theory and practice of histological techniques</a>. , Churchill Livingstone. (2008).</li>
<li>Kennedy, S., Oswald, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKennedy%2C+S+%22PCR+troubleshooting+and+optimization%3A+The+essential+guide%22">PCR troubleshooting and optimization: The essential guide</a>. , Caister Academic Press. (2011).</li>
<li>Kurien, B., Scofield, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKurien%2C+B+%22Western+blotting%3A+Methods+and+protocols%22">Western blotting: Methods and protocols</a>. , Springer. New York. (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+image+to+imageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Winston, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+W+%22Microsoft+excel+data+analysis+and+business+modeling%22">Microsoft excel data analysis and business modeling</a>. , Pearson Education. (2016).</li>
<li>R Core Team. A language and environment for statistical computing. <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">R Foundation for Statistical Computing</a>. , (2017).</li>
<li>Rosenbaum, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenbaum%2C+S+%22Basic+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics%3A+An+integrated+textbook+and+computer+simulations%22">Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations</a>. , Wiley. (2016).</li>
<li>Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tightly+bound+divalent+cation+regulates+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization.</a> Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).</li>
<li>Vojdani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+assessment+of+intestinal+permeability%2C+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Ther+Health+Med%22%5BJournal%5D)">For the assessment of intestinal permeability, size matters.</a> Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).</li>
<li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+shiga+toxin+producing+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli.</a> PLoS One. 12, e0178966(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten bekend te maken.

Dit protocol wordt een algemene methode voor de microinjection van hPSC afkomstige Oberhof en intestinale organoids weefsel-afgeleide en de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time. We hebben ook aangetoond dat onze benadering van analyse en interpretatie van de gegevens die zijn gegenereerd met behulp van deze methoden. Gezien de groeiende aanneming van intestinale organoids modelsystemen16,20,21,28 en de jarenlange interesse in intestinale barrière permeabiliteit als een fysiologisch relevante functionele resultaat3,4,5,6, wij verwachten dat anderen werken op dit gebied zal zitten kundig voor toepassing en voortbouwen op deze methoden.
Er zijn verschillende stappen die essentieel zijn voor de toepassing van deze techniek. Toegang tot hoogwaardige hPSC- of weefsel afgeleide HIO weefsel voorafgaand aan uitgebreide experimenten met microinjection dienen te worden vastgesteld. HIO macrostructuur mogelijk heterogene, met variatie in zowel de grootte en de vorm, hoewel weefsel identiteit en cellulaire morfologie is zeer reproduceerbaar bij gebruik van vastgelegde methode voor het genereren van Oberhof24. Sferische Oberhof, bestaande uit een enkele semi-transparante lumen en het meten van ongeveer 1 mm in diameter zijn ideaal voor microinjection en meting van luminal fluorescentie in real-time. In sommige gevallen mislukt microinjection, wat resulteert in de ineenstorting van de HIO of duidelijk lekkage van geïnjecteerde materiaal. Mislukte Oberhof kunnen worden verwijderd uit de cultuur ook naar eigen goeddunken van de gebruiker met behulp van een standaard micropipet. Overwegen de doelstelling lenzen beschikbaar op een imaging platform bij het selecteren van Oberhof voor microinjection en beeldbewerking. In het algemeen, 2-4 X objectieven zijn ideaal voor het vangen van het volledige HIO fluorescent signaal, hoewel een 10 X doelstelling kan worden gebruikt als energiebesparende lenzen niet beschikbaar zijn of als de beschikbare Oberhof &#60; 1 mm in diameter. Imaging-software moet voldoende zijn voor de geautomatiseerde inname van fluorescerende beelden op bepaalde punten na verloop van tijd.
Diverse wijzigingen van dit protocol zijn mogelijk om de experimentele wensen. Bijvoorbeeld, de resultaten van barrière functie tests kunnen worden afhankelijk van de moleculaire omvang van de verbindingen in gebruik43 en het kan dienstig zijn om te testen dextran preparaten van verschillende moleculair gewicht. Daarnaast kan helderveld beeldvorming worden uitgevoerd naast fluorescentie imaging als indicatie van de algemene structurele integriteit van de weefsels25. Bij het uitvoeren van microinjection van levende bacteriën25,28,31,32,33,44, kan het nodig zijn om toe te voegen van penicilline en streptomycine of gentamicine aan de voedingsbodems HIO voorafgaand aan of na microinjection. De buitenkant van de microcapillary zal tijdens het vullen met de bacteriecultuur schorsing besmet raken en dit kan worden overgedragen aan de HIO-media. Afwisselend, microinjection kan worden uitgevoerd op Oberhof geschorst in extracellulaire matrix (bijvoorbeeld Matrigel) zonder media, de media toe te voegen nadat de microinjection is voltooid. Dit kan besmetting van de extracellulaire matrix en het buitenvlak van de HIO beperken. Bij het plannen van microbiële groei testen, kan het nodig te verwijderen van antibiotica in de media na 1-2 uur te voorkomen van vertragen of verhinderen van de groei van microinjected organismen zijn.
Tot slot is erkennen dat niet alle onderzoekers toegang tot microscopie apparatuur geschikt is voor in vitro imaging hebben zullen, het belangrijk erop te wijzen dat de procedures die worden beschreven in dit protocol voor het verzamelen van gegevens van de fluorescentie kunnen worden toegepast op afbeeldingen die op vaste tijdstippen met behulp van standaard epifluorescerende microscopie zonder geautomatiseerde beeld vastleggen of milieucontrole. Voorbeelden van deze aanpak kunnen worden gevonden in de verslagen door Leslie en Huang et al. 25, die onderzocht van C. difficile toxine activiteit in intestinale organoids hPSC afkomstige, en Karve en Pradan et al. 44, die epitheliale barrière permeabiliteit in soortgelijke hPSC afkomstige intestinale organoids microinjected met levende E. coli onderzocht. Handmatige bediening van beeldvormingsapparatuur kan resulteren in een grotere variatie en problemen bij het normaliseren van het fluorescerende signaal. Wanneer het uitvoeren van handmatige beeldvorming van FITC-dextran geïnjecteerd Oberhof is het essentieel te handhaven vaste vergroting, fluorescerende excitatie-intensiteit en blootstelling tijden gedurende het gehele experiment om te voorkomen dat het verstoren van de intensiteit van de fluorescentie-metingen.

Het intestinaal epitheel vormt een selectieve barrière die de directionele vervoer van voedingsstoffen, H2O ionen en afvalproducten bemiddelt terwijl het minimaliseren van de niet-specifieke diffusie-gemedieerde uitwisseling van andere deeltjes tussen de lumen en de mesenchymale weefsel of bloed levering1,2. De niet-specifieke permeabiliteit van de intestinale epitheliale barrière is lang beschouwd als een belangrijke functionele parameter in zowel de volksgezondheid als de ziekte3,4,5,6, waarin het tempo van de diffusie van kleine moleculen in het epithelium via de paracellular ruimte. Meting van de permeabiliteit van de epitheliale barrière kan worden uitgevoerd diermodellen7 en in menselijke patiënten8 tot en met de inname van lactulose, die heeft geen specifieke vervoerder in het maag-darmkanaal, en de daaropvolgende verzameling en meting van lactulose concentraties in het perifere bloed. Alternatieve geconsumeerde markers van barrièrefunctie zoals fluorescently geëtiketteerde koolhydraten zijn ook beschikbaar9,10. Deze benadering is aangepast voor intestinale epitheliale celculturen geteeld op Transwell ondersteunt11, een vereenvoudigde aanpak die zorgt voor meer experimentele controle, maar is ook bekritiseerd als een slechte voorspeller van in vivo permeabiliteit als gevolg van het ontbreken van gedifferentieerde epitheliale subtypen en weefsel structuur12. Met behulp van kamers vertegenwoordigen van nog een andere aanpak en laat voor de meting van epitheliale barrièrefunctie in hele intestinale mucosa ex vivo13. Toepassing van deze techniek is vaak beperkt door weefsel beschikbaarheid en voorwaarde13,14. Nieuwe methoden die balans reproduceerbaarheid en doorvoer met fysiologische relevantie zijn dus noodzakelijk.
Recente ontwikkelingen in in vitro organogenese hebben geleid tot de invoering van systemen voor 3D weefselkweek model als een geavanceerde platform voor Recapitulerend de dynamiek van complexe weefsels15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. In het bijzonder de menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleid menselijke intestinale organoids (Spa)19,24 naar voren zijn gekomen als een reproduceerbare en experimenteel hanteerbare modelsysteem voor de studie van host-microbiële interacties en epitheliale barrière dynamics25,26,27,28. Ook menselijke weefsel afkomstige organoids (ook bekend als enteroids) kan worden afgeleid uit een eenvoudige biopsie procedure en kan worden gebruikt als een hanteerbare systeem te bestuderen van de menselijke fysiologie en ziekte15,29,30. Microinjection van menselijke intestinale organoids voorziet in de levering van de experimentele samenstellingen25 of microben25,31,32,33 tot en met de apicale epitheliale live oppervlak van de organoid lumen. Leslie en Huang et al. 25 aangepast onlangs deze techniek voor het meten van de permeabiliteit van de barrière in Oberhof microinjected met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) label dextran na blootstelling aan bacteriële toxines.
Dit protocol is bedoeld als een gids voor het meten van epitheliale barrière permeabiliteit in Oberhof hPSC afkomstige en weefsel afkomstige Oberhof met behulp van fluorescentie microscopie. Met kleine aanpassingen, kan het ook dienen als een algemene inleiding over microinjection van Oberhof met experimentele verbindingen. Gebruikers kunnen dit protocol met aanvullende of alternatieve downstream toepassingen na microinjection aanvullen.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0,5 M steriele (pH 8,0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Cell matrix oplossing (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT live cel-beeldvormingssysteem</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr><tr><td>Camera</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Inbegrepen bij Deltavision systeem</td></tr><tr><td>softWoRx Beeldvormingssoftware</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Inbegrepen bij Deltavision systeem</td></tr><tr><td>Bioveiligheidscabinet</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>B27 supplement (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutamine (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>Pipetthouders</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Alternatief voor Xenoworks pipethouders</td></tr><tr><td>Magnetische standaard</td><td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>Aanbevolen microscoop, hoewel andere modellen waarschijnlijk compatibel zijn</td></tr><tr><td>Olympus IX71 Fluorescerende microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Inbegrepen bij Deltavision systeem</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td>29065728</td><td>Inbegrepen bij Deltavision systeem</td></tr><tr><td>Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Proteïne</td><td>R&amp;D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236-EG</td><td>Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>4645-RS</td><td>Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>6057-NG</td><td>Onderdeel van ENR media; zie McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextran (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetpuller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>Glasfilamenten</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipethouders</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>Voorkeursapparaat</td></tr><tr><td>Analoge slangenset</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 inch duidelijke ferrule</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>1-1,2 mm O-ring</td><td>Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale organoids

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Voorschotten in 3D cultuur van intestinale weefsels verkregen via biopsie of gegenereerd op basis van pluripotente stamcellen via gestuurde differentiatie, hebben geleid tot geavanceerde in vitro modellen van de intestinale mucosa. Gebruik te maken van deze opkomende modelsystemen vergt aanpassing van tools en technieken ontwikkeld voor 2D cultuur systemen en dieren. Hier beschrijven we een techniek voor het meten van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale organoids in real-time. Dit wordt bereikt door microinjection van fluorescently-geëtiketteerden dextran en beeldvorming op een omgekeerde Microscoop uitgerust met epifluorescerende filters. Real-time meting van de permeabiliteit van de barrière in de darm organoids vergemakkelijkt de generatie van high-resolution temporele gegevens in menselijke intestinale epitheelweefsel, hoewel deze techniek kan ook worden toegepast op vaste timepoint imaging benaderingen. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen voor de meting van epitheliale barrière permeabiliteit na blootstelling aan farmacologische agenten, bacteriële producten of toxine of levende micro-organismen. Dit protocol kan ook dienen als een algemene inleiding over microinjection van intestinale organoids met kleine wijzigingen, en gebruikers kunnen ervoor kiezen te vullen dit protocol met aanvullende of alternatieve downstream toepassingen na microinjection.

Oberhof werden onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen en gekweekt in cel matrix oplossing als eerder beschreven19,24. Na 4 weken in cultuur, had de Oberhof voldoende uitgebreid zodat microinjection. Oberhof waren microinjected met 4 kDa FITC-geconjugeerd dextran geschorst PBS of PBS met Clostridium difficile toxine TcdA. C. difficile is een opportunistische gastro-intestinale pathogen dat toxine-gemedieerde epitheliale toxiciteit in Oberhof25vertoont. Als positieve controle, EGTA toevoegde aan de HIO voedingsbodems in een subset van Oberhof ingespoten met PBS en FITC-dextran. EGTA is een calcium-complexvormer waardoor snelle ambtshalve polymerisatie van de actine cytoskelet42. FITC fluorescentie in real time op een levende imaging Microscoop binnen een gecontroleerd milieu kamer werd gecontroleerd en beelden werden gevangen in 10 minuten intervallen.
Post-hoc analyse van beeldvorming gegevens bleek aanzienlijke verschillen in de bewaring van FITC fluorescentie (Figuur 5). Oberhof geïnjecteerd met PBS behield bijna alle van de fluorescent signaal aanwezig op t = 0, maar Oberhof die ook met TcdA van behandeld met EGTA ingespoten werden tentoongesteld een substantiële afname van fluorescerende intensiteit door 8 uur na microinjection (figuur 5a). Imaging gegevens werden gekwantificeerd voor alle Oberhof op alle tijdstippen voor het genereren van een hoge resolutie dataset vertegenwoordigen de relatieve verandering in intensiteit van de fluorescentie na verloop van tijd in elke experimentele voorwaarde (figuur 5B). Verschillen in epitheliale permeabiliteit werden beoordeeld door de berekening van de gemiddelde eliminatie tijd (t-1/2 ) van FITC voor elke groep van de behandeling (tabel 1) en vergelijken van de verschillen in t t,1/2 tussen groepen met behulp van de Student t-test. Controle-behandelde Oberhof behouden het merendeel van de FITC fluorescent signaal voor meer dan 16 uur (t-1/2 = 17 ± 0,3 h). Behandeling met EGTA aanzienlijk verminderd FITC-dextran eliminatie tijd ten opzichte van controle Oberhof (t-1/2 = 2.6 ± 0,2 h; P = 1.3 x 10-8). In overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten25, microinjection van TcdA aanzienlijk verhoogd epitheliale barrière permeabiliteit ten opzichte van de controle behandeling (t-1/2 = 7.6 ± 0,6 h; P = 5.4 x 10-4). Dus, zowel extern (EGTA) en microinjected (TcdA)-verbindingen zijn geschikt voor het induceren van belangrijke wijzigingen in epitheliale barrière permeabiliteit in Oberhof. Deze resultaten suggereren dat de effecten van een breed scala van farmacologische stoffen, metabolieten, bacteriële producten, cytokines, groeifactoren en andere verbindingen op de epitheliale barrièrefunctie kunnen worden geëvalueerd aan de hand van deze aanpak.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Behandeling</td>
			<td>Halfwaardetijd (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Lagere 95% CI (h)</td>
			<td>Boven 95% CI (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controle</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45 uur</td>
			<td>17.78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0.19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3,38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0.63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Mean eliminatie time (t1/2) voor de FITC-dextran in Oberhof behandeld met EGTA of TcdA. Eenheden zijn uren na microinjection.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figuur 1: basis lay-out van een microinjector en micromanipulator voor HIO microinjection. Dit beeld toont de volledige aanvulling van apparatuur die wordt gebruikt voor het uitvoeren van microinjection van Oberhof. Belangrijke onderdelen worden aangeduid en bestelinformatie vindt u in de tabel van de materialen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figuur 2: de trekker van de micropipet. De koper verwarming spoel hc, bovenste klem c1, onder klem (c2), de trekker van de arm (pa), warmte selectie knevel (ht) worden aangeduid met de pijlen. De juiste instelling voor serie 1 en trek in rode tekst worden aangegeven. De inzet toont een gloeidraad correct gemonteerd glas klaar voor verwarming. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figuur 3: representatieve beelden van een weefsel afkomstige HIO ingespoten met FITC-dextran. (A) afbeelding tonen de positionering van het glas-microcapillary vlak voor opneming in de HIO en microinjection. (B) helderveld beeld van een weefsel afkomstige menselijke intestinale organoids na microinjection van FITC-dextran. Merk op dat het signaal van de fluorescentie zelfs zonder het gebruik van een specifiek filter set blijkt. Deze verkleuring helpt microinjection precisie. 3 X vergroting <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figuur 4: Live imaging werkstroom. (A) Screenshot ter illustratie van de noodzakelijke stappen voor het instellen van de parameters van de Microscoop, vinden de Oberhof op de dia en de positie van het werkgebied voor elke HIO te worden beeld opslaan. (B) pre imaging instellingen voor het vastleggen van het FITC-kanaal met regelmatige tussenpozen op elk van de posities opgegeven in A. (C) na imaging export van gegevens opmaken de DV-bestanden als TIFF-afbeeldingen met een TIFF-afbeelding per HIO per tijdstip.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figuur 5: representatieve resultaten. (A)-cel van de stam afgeleid menselijke intestinale organoids (HIO) microinjected met 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) beeld voor 20 uur. Oberhof werden ook microinjected met PBS (control) of de Clostridium difficile toxine TcdA (12,8 ng/µL) of 2 mM EGTA toegevoegd aan de externe cultuur media behandeld. 4 X vergroting. (B) Plot van gemiddelde genormaliseerde FITC intensiteit na verloop van tijd in Oberhof behandeld met PBS (control), TcdA of EGTA. Foutbalken vertegenwoordigen S.E.M. en n = 11 Oberhof (Control), 3 Oberhof (EGTA), 6 Oberhof (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Dit protocol beschrijft de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time volgende farmacologische behandeling in menselijke intestinale organoids met behulp van fluorescentie microscopie en levende cel microscopie.

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Het algemene doel van deze procedure is om de permeabiliteit van de epitheliale barrière in humane intestinale organoïden in de loop van de tijd te meten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van gastro-enterologie te beantwoorden, zoals hoe specifieke toxines, bacteriële producten of zelfs farmacologische behandelingen de permeabiliteit van de epitheliale barrière kunnen veranderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zowel visualisatie als kwantitatieve meting van de permeabiliteit van de epitheliale barrière in realtime mogelijk maakt en gebruik maakt van menselijk intestinaal epitheelweefsel.Voorafgaand aan het micro-injecteren van humane intestinale organoïden, moet de micro-injector worden ingesteld en moet de microcapillair worden voorbereid, geïnstalleerd en getest zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de microcapillair te vullen met het injectiemateriaal, dompelt u de punt van de glazen microcapillair in de FITC-dextran injectie suspensie, waarbij u ervoor moet zorgen dat de punt van de microcapillair niet breekt tegen de zij- of onderkant van de buis. Trek de mineraalolie spuit terug om ongeveer 10 microliters van de FITC-dextran suspensie in de microcapillair te trekken.Wanneer de micro-injectie suspensie 90% van de lengte van de glazen microcapillair vult, stop met het vullen van de microcapillair. Druk lichtjes op de spuit voordat u de microcapillair uit de micro-injectie oplossing trekt om ervoor te zorgen dat de punt van de microcapillair geen luchtzakken bevat. Verwijder de humane intestinale organoïd cultuurplaat uit de celcultuur incubator en breng over naar de bioveiligheidskast met de micro-injector.Verwijder het deksel van de cultuurplaat en plaats de eerste put centraal op de microscooptafel zodat deze duidelijk zichtbaar is door het oculaire van de microscoop bij de laagste vergroting. Draai de micromanipulatorarm zodat de microcapillair naar beneden in de cultuurput wordt gewezen onder een hoek van meer dan 45 graden ten opzichte van de microscooptafel. Plaats de punt van de microcapillair ongeveer een centimeter boven de oppervlakte van het medium boven de eerste cultuurput.Controleer of zowel de punt van het glazen filament als de humane intestinale organoïd zichtbaar zijn door het oculaire. De sleutel tot een succesvolle micro-injectie is om de microcapillair zorgvuldig uit te lijnen met de organoïd voordat u de micro-injectie probeert. En ik raad nieuwe gebruikers altijd aan om te oefenen met reserve weefsel voordat ze een kritisch experiment proberen.Door de controleknop van de z-as met de klok mee te draaien, laat de microcapillair langzaam zakken. Prik de humane intestinale organoïd met de punt van de microcapillair. Het buitenoppervlak van de humane intestinale organoïd zal lichtjes inzakken terwijl de microcapillair druk begint uit te oefenen, en zal terug in vorm komen zodra de punt het lumen binnendringt.Als het moeilijk is om de punt van de microcapillair in het lumen te zien, pas dan de verlichting of vergrotingsinstellingen van de dissectiemicroscoop aan. Wanneer de microcapillair correct is gepositioneerd met de punt van de microcapillair nabij het centrum van de humane intestinale organoïd, verwijder de handen van de micromanipulator bediening. Druk lichtjes op de met mineraalolie gevulde spuit om de micro-injectie oplossing uit de microcapillair en in het lumen van de humane intestinale organoïd te duwen.De humane intestinale organoïd kan lichtjes uitzetten om het volume van de injectie te accommoderen. Met de microcapillair gepositioneerd boven het medium om accidentele schade aan de humane intestinale organoïden tijdens het manoeuvreren te voorkomen, ga naar de volgende doelwit humane intestinale organoïd. Verwissel de microcapillair tussen behandelingen of in geval van breuk.Maak de klem aan het uiteinde van de micromanipulatorarm los en verwijder de microcapillair uit de micropipethouder. Om verbindingen die naar het apicale epitheel worden geleverd te testen, moet het samenstelling worden opnieuw gesuspendeerd in steriel PBS bevattende twee milligram per milliliter FITC-dextran. In dit representatieve experiment, re-suspendeerde Clostridium difficile toxine TcdA, voegde 12,8 nanogram per microliter toe in PBS bevattende FITC-dextran vóór micro-injectie.Micro-injecteer de samenstelling in het lumen van de humane intestinale organoïd zoals gedemonstreerd in de vorige sectie. Om verbindingen die naar het basale laterale compartiment worden geleverd te testen, vervang na micro-injectie van FITC-dextran het externe cultuurmedium met nieuw medium bevattende twee millimolair EGTA als positieve controle, PBS voertuig alleen als negatieve controle, of een andere experimentele samenstelling. Begin onmiddellijk met live beeldvorming na micro-injectie.Deze representatieve lichtveldafbeelding toont een weefsel-afgeleide humane intestinale organoïd na micro-injectie van FITC-dextran. Het fluorescente signaal is duidelijk zichtbaar, zelfs zonder het gebruik van een specifiek filterstel. Stamcel-afgeleide humane intestinale organoïden werden gemicro-injecteerd met vier kilodalton FITC-geconjugeerd dextran gesuspendeerd in PBS, of PBS bevattende Clostridium difficile toxine TcdA.Als positieve controle werd EGTA toegevoegd aan het humane intestinale organoïd cultuurmedium in een subset van humane intestinale organoïden geïnjecteerd met PBS en FITC-dextran. De humane intestinale organoïden werden gedurende 20 uur geïmagerd. Zoals geïllustreerd door deze afbeeldingen, behielden humane intestinale organoïden geïnjecteerd met PBS bijna alle fluorescente signaal aanwezig op T nul.Echter, humane intestinale organoïden die ook werden geïnjecteerd met TcdA, of behandeld met EGTA, vertoonden een substantieel afname in fluorescente intensiteit acht uur na micro-injectie. De beeldgegevens werden gekwantificeerd voor alle humane intestinale organoïden op alle tijdstippen om een hoge resolutie dataset te genereren die de relatieve verandering in fluorescente intensiteit in de loop van de tijd in elke experimentele conditie vertegenwoordigt. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer 30 minuten tot een uur worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal experimentele omstandigheden.Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om geduldig te zijn en de tijd te nemen om de humane intestinale organoïden uit te lijnen met de microcapillair voorafgaand aan micro-injectie. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals PCR, western blot en RNA-zoeken worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de

real-time-measurement-epithelial-barrier-permeability-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft het gebruik van uitgesneden darmweefselpreparaten of 'darmzakken' als een ex vivo model van de darmwandfunctie. Dit model kan worden gebruikt om de integriteit van zowel de epitheliale barrière als de slijmvlieglaag op specifieke darmlocaties in diermodellen van spijsverteringsziekten te beoordelen.

Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

Hier beschrijven we een techniek om de barrière-integriteit van kleine darmorganoïden te kwantificeren. Het feit dat de methode is gebaseerd op levende organoïden maakt het sequentiële onderzoek van verschillende barrière-integriteit modulerende stoffen of combinaties daarvan op een tijdopgeloste manier mogelijk.

Onderzoek naar darmbarrière afbraak in levende organoïden

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Dit protocol beschrijft de oprichting van enteroïden, een driedimensionaal darmmodel, uit foetaal darmweefsel. Immunofluorescente beeldvorming van epitheliale biomarkers werd gebruikt voor modelkarakterisering. Apicale blootstelling van lipopolysacchariden, een bacterieel endotoxine, met behulp van micro-injectietechniek geïnduceerde epitheliale permeabiliteit op een dosisafhankelijke manier gemeten door de lekkage van fluorescerende dextran.

Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

Het huidige protocol schetst een methode die lucifergeel gebruikt in een apicale enteroïde model om de darmdoorlaatbaarheid te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te bepalen bij enteroïden die inflammatoire darmziekten modelleren, zoals necrotiserende enterocolitis.

Intestinale permeabiliteit bepalen met lucifergeel in een apical-out enteroïde model

Deze studie presenteert een protocol voor het genereren van 2D-monolagen in de darm van runderen uit organoïden, en biedt verbeterde toegang voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en ziekteverwekker. Het bevat methoden voor het beoordelen van de integriteit en functionaliteit van het membraan, het bevorderen van in vitro modellen die de gastro-intestinale fysiologie van runderen nabootsen. Deze aanpak belooft aanzienlijke biomedische en agrarische voordelen, waaronder verbeterde...

Vooruitgang in de organoïdetechnologie van runderen met behulp van monolaaginterfaces voor dunne en grote darmen

Deze studie schetst een protocol voor het genereren van 2D-monolagen van varkensorganoïden afkomstig van de dunne en dikke darm. De groei van deze monolagen wordt gekenmerkt door toenemende TEER-waarden, wat wijst op een robuuste epitheliale integriteit. Bovendien vertonen deze monolagen fysiologische secretoire reacties in Ussing-kamerexperimenten na de toepassing van forskolin.

Tweedimensionale darmorganoïden van varkens die de fysiologische eigenschappen van de inheemse darm weerspiegelen

Het protocol in dit onderzoek beschrijft werkwijzen voor de real-time monitoring herprogrammering progressie via de kinetische meting van positieve en negatieve pluripotente stamcel markers gebruikt flowcytometrie analyse. Het protocol bevat ook de imaging-gebaseerde beoordeling van de morfologie, en merker of reporter expressie tijdens iPSC generatie.

Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren

Leer de real-time meting van epitheliale barrièrepermeabiliteit in menselijke intestinale organoïden met fluorescentie-microscopie. Deze methode visualiseert en kwantificeert veranderingen door farmacologische behandelingen.

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Meer video's verkennen