Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids
18 december 2017
Dit protocol beschrijft de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time volgende farmacologische behandeling in menselijke intestinale organoids met behulp van fluorescentie microscopie en levende cel microscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om de permeabiliteit van de epitheliale barrière in humane intestinale organoïden in de loop van de tijd te meten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van gastro-enterologie te beantwoorden, zoals hoe specifieke toxines, bacteriële producten of zelfs farmacologische behandelingen de permeabiliteit van de epitheliale barrière kunnen veranderen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zowel visualisatie als kwantitatieve meting van de permeabiliteit van de epitheliale barrière in realtime mogelijk maakt en gebruik maakt van menselijk intestinaal epitheelweefsel.
Voorafgaand aan het micro-injecteren van humane intestinale organoïden, moet de micro-injector worden ingesteld en moet de microcapillair worden voorbereid, geïnstalleerd en getest zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de microcapillair te vullen met het injectiemateriaal, dompelt u de punt van de glazen microcapillair in de FITC-dextran injectie suspensie, waarbij u ervoor moet zorgen dat de punt van de microcapillair niet breekt tegen de zij- of onderkant van de buis. Trek de mineraalolie spuit terug om ongeveer 10 microliters van de FITC-dextran suspensie in de microcapillair te trekken.
Wanneer de micro-injectie suspensie 90% van de lengte van de glazen microcapillair vult, stop met het vullen van de microcapillair. Druk lichtjes op de spuit voordat u de microcapillair uit de micro-injectie oplossing trekt om ervoor te zorgen dat de punt van de microcapillair geen luchtzakken bevat. Verwijder de humane intestinale organoïd cultuurplaat uit de celcultuur incubator en breng over naar de bioveiligheidskast met de micro-injector.
Verwijder het deksel van de cultuurplaat en plaats de eerste put centraal op de microscooptafel zodat deze duidelijk zichtbaar is door het oculaire van de microscoop bij de laagste vergroting. Draai de micromanipulatorarm zodat de microcapillair naar beneden in de cultuurput wordt gewezen onder een hoek van meer dan 45 graden ten opzichte van de microscooptafel. Plaats de punt van de microcapillair ongeveer een centimeter boven de oppervlakte van het medium boven de eerste cultuurput.
Controleer of zowel de punt van het glazen filament als de humane intestinale organoïd zichtbaar zijn door het oculaire. De sleutel tot een succesvolle micro-injectie is om de microcapillair zorgvuldig uit te lijnen met de organoïd voordat u de micro-injectie probeert. En ik raad nieuwe gebruikers altijd aan om te oefenen met reserve weefsel voordat ze een kritisch experiment proberen.
Door de controleknop van de z-as met de klok mee te draaien, laat de microcapillair langzaam zakken. Prik de humane intestinale organoïd met de punt van de microcapillair. Het buitenoppervlak van de humane intestinale organoïd zal lichtjes inzakken terwijl de microcapillair druk begint uit te oefenen, en zal terug in vorm komen zodra de punt het lumen binnendringt.
Als het moeilijk is om de punt van de microcapillair in het lumen te zien, pas dan de verlichting of vergrotingsinstellingen van de dissectiemicroscoop aan. Wanneer de microcapillair correct is gepositioneerd met de punt van de microcapillair nabij het centrum van de humane intestinale organoïd, verwijder de handen van de micromanipulator bediening. Druk lichtjes op de met mineraalolie gevulde spuit om de micro-injectie oplossing uit de microcapillair en in het lumen van de humane intestinale organoïd te duwen.
De humane intestinale organoïd kan lichtjes uitzetten om het volume van de injectie te accommoderen. Met de microcapillair gepositioneerd boven het medium om accidentele schade aan de humane intestinale organoïden tijdens het manoeuvreren te voorkomen, ga naar de volgende doelwit humane intestinale organoïd. Verwissel de microcapillair tussen behandelingen of in geval van breuk.
Maak de klem aan het uiteinde van de micromanipulatorarm los en verwijder de microcapillair uit de micropipethouder. Om verbindingen die naar het apicale epitheel worden geleverd te testen, moet het samenstelling worden opnieuw gesuspendeerd in steriel PBS bevattende twee milligram per milliliter FITC-dextran. In dit representatieve experiment, re-suspendeerde Clostridium difficile toxine TcdA, voegde 12,8 nanogram per microliter toe in PBS bevattende FITC-dextran vóór micro-injectie.
Micro-injecteer de samenstelling in het lumen van de humane intestinale organoïd zoals gedemonstreerd in de vorige sectie. Om verbindingen die naar het basale laterale compartiment worden geleverd te testen, vervang na micro-injectie van FITC-dextran het externe cultuurmedium met nieuw medium bevattende twee millimolair EGTA als positieve controle, PBS voertuig alleen als negatieve controle, of een andere experimentele samenstelling. Begin onmiddellijk met live beeldvorming na micro-injectie.
Deze representatieve lichtveldafbeelding toont een weefsel-afgeleide humane intestinale organoïd na micro-injectie van FITC-dextran. Het fluorescente signaal is duidelijk zichtbaar, zelfs zonder het gebruik van een specifiek filterstel. Stamcel-afgeleide humane intestinale organoïden werden gemicro-injecteerd met vier kilodalton FITC-geconjugeerd dextran gesuspendeerd in PBS, of PBS bevattende Clostridium difficile toxine TcdA.
Als positieve controle werd EGTA toegevoegd aan het humane intestinale organoïd cultuurmedium in een subset van humane intestinale organoïden geïnjecteerd met PBS en FITC-dextran. De humane intestinale organoïden werden gedurende 20 uur geïmagerd. Zoals geïllustreerd door deze afbeeldingen, behielden humane intestinale organoïden geïnjecteerd met PBS bijna alle fluorescente signaal aanwezig op T nul.
Echter, humane intestinale organoïden die ook werden geïnjecteerd met TcdA, of behandeld met EGTA, vertoonden een substantieel afname in fluorescente intensiteit acht uur na micro-injectie. De beeldgegevens werden gekwantificeerd voor alle humane intestinale organoïden op alle tijdstippen om een hoge resolutie dataset te genereren die de relatieve verandering in fluorescente intensiteit in de loop van de tijd in elke experimentele conditie vertegenwoordigt. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer 30 minuten tot een uur worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal experimentele omstandigheden.
Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om geduldig te zijn en de tijd te nemen om de humane intestinale organoïden uit te lijnen met de microcapillair voorafgaand aan micro-injectie. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals PCR, western blot en RNA-zoeken worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het real-time meten van de permeabiliteit van de epitheliale barrière in humane intestinale organoïden. Met behulp van fluorescentie- en live-cellmicroscopie stelt deze techniek onderzoekers in staat om veranderingen in de permeabiliteit na farmacologische behandelingen te visualiseren en te kwantificeren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Gastroenterologie
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- De integriteit van de epitheliale barrière is cruciaal voor de gezondheid van de darmen.
- Verstoring hiervan kan leiden tot diverse gastro-intestinale aandoeningen.
- Real-time meettechnieken verbeteren het begrip van veranderingen in de permeabiliteit.
- Humane intestinale organoïden bieden een relevant model voor het bestuderen van de epitheliale functie.
Doel van de studie
- Om de effecten van toxinen en farmacologische behandelingen op de permeabiliteit van de epitheliale barrière te meten.
- Om veranderingen in de permeabiliteit in real-time te visualiseren.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor toekomstig gastroenterologisch onderzoek.
Gebruikte methoden
- Microinjectie van FITC-dextran in humane intestinale organoïden.
- Live imaging om veranderingen in het fluorescentiesignaal in de tijd te monitoren.
- Kwantitatieve analyse van de fluorescentie-intensiteit om de permeabiliteit te beoordelen.
- Gebruik van controles om de experimentele condities te valideren.
Belangrijkste resultaten
- Menselijke intestinale organoïden behielden het fluorescentiesignaal na behandeling met PBS.
- Een significante afname van de fluorescentie werd waargenomen bij behandelingen met TcdA en EGTA.
- Er zijn kwantitatieve gegevens gegenereerd die de relatieve veranderingen in permeabiliteit aantonen.
- De techniek kan efficiënt worden uitgevoerd binnen 30 minuten tot één uur.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van de epitheliale barrièrefunctie.
- Real-time imaging verbetert het begrip van de permeabiliteitsdynamiek.
- Toekomstige toepassingen kunnen het testen van diverse farmacologische middelen omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Real-time meting van de permeabiliteit van de epitheliale barrière in menselijke intestinale organoïden maakt een kwantitatieve beoordeling met hoge resolutie van de barrièrefunctie mogelijk in een menselijk relevant 3D-systeem. Deze mogelijkheid is essentieel voor het verminderen van risico's bij vroege ontdekkingshypothesen rondom modulatie van de darmbarrière en voor het evalueren van de impact van farmacologische agentia, toxines of microbiële producten op de epitheliale integriteit. Deze benadering ondersteunt het voorspellend vertrouwen op het snijvlak van target-validatie en de selectie van preklinische modellen voor portfolio's voor gastro-intestinale geneesmiddelenontwikkeling.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van de epitheliale barrièrefunctie mogelijk in een fysiologisch relevant menselijk model.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de verstoring van de barrière te kwantificeren in reactie op kandidaat-middelen of toxinen.
- Faciliteert functionele targetvalidatie voor pathways die betrokken zijn bij barrièreintegriteit en ziekte.
- Levert kwantitatieve gegevens ter ondersteuning van go/no-go-beslissingen in programma's in een vroeg stadium.
Screening en Assay-ontwikkeling
- Stelt een reproduceerbare, kwantitatieve assay vast voor barrièrepermeabiliteit met behulp van live imaging en fluorescente tracers.
- Maakt gestandaardiseerde vergelijking mogelijk van de effecten van verbindingen over meerdere experimentele condities.
- Ondersteunt de schaalbaarheid en aanpassing van de assay voor het screenen van farmacologische of microbiële modulatoren van de barrièrefunctie.
- Maakt een robuuste evaluatie mogelijk van door verbindingen geïnduceerde veranderingen in de epitheliale integriteit.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante menselijke weefselmodellen voor de translationele ontwikkeling van biomarkers.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door downstream moleculaire analyses na micro-injectie mogelijk te maken.
- Vermindert het translationele risico door mensspecifieke reacties op kandidaat-interventies te modelleren.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van verbindingen die gericht zijn op epitheliale barrièrepaden.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door functionele beoordeling van de barrière-integriteit in menselijke organoïden mogelijk te maken, wat zowel workflows voor target-validatie als lead-evaluatie ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert real-time veranderingen in de barrièrepermeabiliteit om de betrokkenheid van signaalpaden en het biologische mechanisme te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor de vergelijking van verbindingen en de standaardisatie van assays.
- Analytica: Biedt temporele gegevens met een hoge resolutie over de retentie of het verlies van fluorescente tracers, ter ondersteuning van statistische analyse van permeabiliteitsveranderingen.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug van in vitro bevindingen naar preklinische modellen door gebruik te maken van organoïden van menselijke oorsprong en het mogelijk maken van downstream moleculaire profilering.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een flexibel platform dat aanpasbaar is aan diverse experimentele vragen en klassen van verbindingen binnen gastro-intestinaal onderzoek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in programma's gericht op barrières en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standardiseert de permeabiliteitsbeoordeling met schaalbare, reproduceerbare workflows.
- Strategische waarde: Informeert vroege go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door gevalideerde targets prioriteit te geven.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van activa met aangetoonde barrière-modulerende activiteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in micro-injectie en live-cell imaging van 3D organoïdeculturen.
- Vereist toegang tot inverted fluorescentiemicroscopie en nauwkeurige micromanipulatieapparatuur.
- Maakt cross-team standaardisatie van injectie- en imagingprotocollen noodzakelijk voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan zowel weefselafgeleide als stamcelafgeleide menselijke intestinale organoïden met geringe protocolaanpassingen.
- Zorgvuldige behandeling en biosafety-voorzorgsmaatregelen zijn essentieel bij het werken met toxines of levende micro-organismen.
