Name: Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Leer gerichte genoombewerking met CRISPR/Cas9 in zebrafish voor functionele genetica en ontwikkelingsbiologie. Dit protocol maakt efficiënte productie en identificatie van gen-uitsparingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R21CA182197 naar J.O.), de Ralph W. en Grace M. Showalter Research Trust, en door de Purdue landbouwkunde en de uitbreiding voor de economischeontwikkeling (AgSEED) programma. Sanger sequencing gegevens werden verworven door de faciliteit van de Purdue Genomics Core ondersteund door P30 CA023168. Mary Witucki werd gesteund door de Purdue University Center for Cancer Research zomer Undergraduate Research Program ondersteund door de Carroll County kanker vereniging. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript. Wij danken Benjamin Carter, Ellen Denning en Taylor Sabato voor kritische terugkoppeling geven over het manuscript. Wij danken het departement van biochemie voor ondersteuning van dit werk, en het Center for Zebrafish Research bij Purdue University voor hun inzet in de zorg en het welzijn van onze zebrafish kolonie. Tot slot, wij danken de Purdue faciliteit voor de kern van de genomica, en bijdragen van Phillip San Miguel met betrekking tot de diensten van het NGS.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft de productie van gene uitsparingen in de zebravis gewervelde modelsysteem met behulp van CRISPR-Cas9-technologie. Een aantal protocollen zijn eerder beschreven om uit te voeren CRISPR-gemedieerde genoom engineering in zebrafish15,25,,26,50,51,,52. Dit protocol bouwt voort op eerdere pogingen door het combineren van een aantal eenvoudige maar reproducibly consistent experimentele technieken, met name HMA en NGS van meerdere heterozygoot vis, maken van een eenvoudig, economisch, en experimenteel robuust protocol voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in zebrafish die geschikt is voor labs bemand met personeel met een bereik van opleiding en ervaring, evenals het onderwijzen van de labs.
Aanbevelingen voor ontwerp en de synthese van gids die RNAS zijn opgenomen in dit protocol. Een belangrijke overweging in handleiding RNA ontwerp is de minimalisering van off-target effecten. Verschillende voorspelling algoritmen hebben ontwikkeld waarmee CRISPR-gebruikers toegang hebben tot berekening tools met gebruiksvriendelijke grafische interfaces die de activiteit van de gids op doelsoort zijn zowel de kans op uit-target effecten34, voorspellen 35,,36. Een specifieke voordeel van de zebravis systeem is verlaagde tarieven van off-target effecten, omdat de Cas9 wordt ingespoten in de embryo's en daarom expressie voorbijgaande aard is, dat is aangetoond in muizen leiden tot verminderde af-target effecten53. Af-target effecten zijn echter aangetoond optreden in zebrafish54. Een manier om controle voor off-target effecten is naar fenotype oprichter zebrafish die zijn gegenereerd door twee onafhankelijke gids RNAs die gericht zijn op het zelfde gen, aangezien deze gidsen zou zeer waarschijnlijk van invloed zijn op verschillende uit-target sites. Een alternatieve methode om te minimaliseren off-target effecten die niet wordt beschreven in dit protocol is het gebruik van een gemuteerde Cas9 die enkele streng einden op doelDNA, die gerepareerd worden met een hoog rendement genereert. Koppeling van DNA nicks in nabijheid van elkaar dat zijn een aanvulling op het tegenovergestelde strengen resulteert in effectieve indel vorming op de gewenste locus en af-target effecten55,56minimaliseert.
Naast het hebben van verschillende tarieven van off-target effecten, kan verschillende sgRNAs hebben verschillende tarieven voor de mutagenese van de gewenste doelgroep57,58,59. Dit protocol maakt gebruik van HMA voor het analyseren van de efficiëntie van de mutagenese van een bepaalde sgRNA met heteroduplex band vorming33,40. Heteroduplex banden zijn gemaakt door kruising van PCR gegenereerde DNA-strengen die incongruenties bevatten, en kan gemakkelijk worden opgelost met behulp van de Elektroforese van het gel. In tegenstelling tot andere methoden die gewoonlijk worden gebruikt voor het meten van indel vorming, zoals de T7 endonuclease assay of hoge resolutie smelten analyse25,26, HMA hoeft niet een dure enzym te snijden niet-overeenkomende DNA, en vereist geen ingewikkelde analyse van PCR smelten curven. Nog belangrijker is, controleren van de hoge tarieven van indel vorming in de ingespoten bevolking met HMA maakt het ook mogelijk de onderzoeker om te minimaliseren van de hoeveelheid vis die nodig zijn voor de productie van knock-out lijnen, waardoor de kosten van de identificatie van een mutatie met de gewenste kenmerken.
Het relatieve gemak van het genereren van de CRISPR gebaseerde microdeleties kunt creëren van multiple allelen van meerdere genen tegelijk. Web-gebaseerde software is beschikbaar voor analyse van enkele mutaties van heterozygoot vis met behulp van Sanger rangschikken van PCR producten49. In het geval waar drie of meer CRISPR-gemuteerd allelen worden geanalyseerd, is NGS te karakteriseren van de aard van de indel waarschijnlijk mogelijk te zijn rendabeler te karakteriseren van de aard van de indel als deze aanpak maakt een pool van maximaal 50 verschillende allelen te worden gekenmerkt op o nvu (Zie Tabel van materialen)60,61,62. Dergelijke schaalvoordelen zou waarschijnlijk vooral handig in een omgeving van undergraduate laboratorium.
Kortom, dit protocol biedt stapsgewijze aanwijzingen voor het reproducibly het genereren van hoge kwaliteit CRISPR-reagentia (in met name sgRNA) zodanig dat minder volwassen vis moeten worden gemaakt en geanalyseerd om te achterhalen met succes de mutant allelen van belang, die ook vermindert de tijd en de kosten van het genereren van de gewenste lijnen. Nog belangrijker is, is dit protocol zodanig is ontworpen dat het kan worden toegepast door laboratoria met beperkte middelen te produceren van mutant zebravis op een betaalbare manier. Bovendien, we hebben gevonden dat deze aanpak geschikt voor studenten is en dus de mogelijkheden voor onderwijs en opleiding van studenten geïnteresseerd in hands-on ervaring in het genoom van de CRISPR gebaseerde bewerken breidt.

De instandhouding van de moleculaire machines in eukaryoten ten grondslag ligt aan de kracht van het gebruik van modelorganismen voor onderzoek. Veel van deze modelsystemen vergemakkelijken het gebruik van omgekeerde-genetische benaderingen zoals gerichte gene uitsparingen te karakteriseren van de bijdrage van een gen-product met een biologische of ziekte proces van belang. Gene verstoring technieken in organismen zoals zebrafish hebben historisch vertrouwd op gerichte invoering van frameshift mutaties die uit de onnauwkeurige reparatie van DSBs1,2 voortvloeien. Wanneer een DSB is ingevoerd in het genoom, de DNA-laesie is gerepareerd door een van de twee trajecten die universeel aanwezig in bijna alle soorten cellen en organismen zijn: niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) en homologie geleide reparatie (HDR)3,4 . De onnauwkeurige aard van de NHEJ machine produceert vaak microdeleties van verschillende lengtes5,6,7,8,9. Invoering van frameshift mutaties in de codering sequentie van een gen kan produceren een voortijdige stop codon, waardoor vaak de gene achterblijven.
Vroege genoom engineering strategieën in zebrafish ter bevordering van microdeleties opgenomen meganucleases, zink-vinger nucleasen en transcriptie activator-achtige effector nucleasen, die allemaal DNA-eiwit interactie gebruikt te richten op een nuclease aan een specifieke genomic doel waar het een DSB10,11,12,13,14,15ingevoerd. Deze technologieën zijn echter vaak moeilijk toe te passen als gevolg van de moeizame en ingewikkelde techniek nodig om te genereren een nuclease die zich richt op de opeenvolging van DNA van belang. In tegenstelling tot eerdere strategieën afhankelijk gene CRISPR gebaseerde bewerken niet is van eiwit-DNA interacties voor targeting. In plaats daarvan is de CRISPR-geassocieerde (Cas) endonuclease gericht via een RNA-gids die gebruikmaakt van de nucleotide base paren interacties te richten een genomic site van belang16,17,18,19 2120, ,. Als gevolg van de eenvoud van het ontwerpen van een RNA is gids met de gewenste base interacties voor targeting het in paren rangschikken relatief eenvoudig om de Cas endonuclease naar de gewenste plaats. Het type II CRISPR systeem is in het bijzonder sterk ontwikkeld voor genoom uitgeven toepassingen als gevolg van verschillende voordelige eigenschappen met inbegrip van gebruik van een enkele met meerdere domeinen Cas nuclease (Cas9) die interactie met DNA te stimuleren endonuclease activiteit vereist en gebruik van een enkele gids RNA (sgRNA) om te richten het op de DNA sequentie van cognaat18. De reeks eisen die noodzakelijk zijn voor het targeten van de cognaat sgRNA zijn goed begrepen19, en de gewenste sgRNA gemakkelijk door in vitro transcriptie wordt gegenereerd. De eenvoud en robuustheid van de CRISPR/Cas9-aanpak vergemakkelijkt sterk gerichte genetische modificatie in de zebravis en een grote verscheidenheid van andere organismen.
De verbeterde mogelijkheid ertoe gerichte genoom bewerken in de zebravis als gevolg van de ontwikkeling van de CRISPR gebaseerde reagentia aanzienlijk heeft verhoogd de kans om processen karakteristieke van gewervelde organismen zoals ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel te bestuderen systeem. De zebravis genoom van Sinorhizobium orthologs van 70% van de eiwit-codeert genen gevonden in het menselijk genoom alsmede 84% van de genen die ziekten bij de mens22is gekoppeld. Zebravis ontwikkeling vertoont enkele key kwaliteiten die het gebruik ervan in omgekeerde genetische studies verbeteren: de embryo's worden gelegd in grote klauwen, extern te ontwikkelen van de moeder, waardoor ze zich lenen voor genetische manipulatie door microinjection, en volwassen zebravis seksueel volwassen door 3 maanden oud, waardoor snelle teeltmateriaal voor gewenste lijnen23.
Er zijn talrijke protocollen beschikbaar die beschrijven een aantal verschillende benaderingen te genereren en te identificeren CRISPR afkomstige microdeleties in zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Veel van deze procedures zijn echter tijd intensief, toegang tot dure apparatuur nodig, en kunnen lastig zijn voor labs met beperkte expertise. De hierin beschreven stappen bieden een eenvoudige, robuuste en economische CRISPR/Cas9-strategie voor de ingenieur zebrafish knock-out lijnen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een zeer efficiënte kit voor het synthetiseren van sgRNAs met behulp van DNA oligonucleotides (oligos), vergelijkbaar met andere benaderingen die al eerder beschreven32. Het beschreven protocol omvat twee stappen in het bijzonder die sterk analyse van CRISPR-gemuteerd lijnen vereenvoudigen: stapsgewijze gebruik van de PCR-gebaseerde HMA33 gemakkelijk bepalen de aanwezigheid van genoom wijzigingen en sequencing analyse van heterozygoot zebrafish snel en gemakkelijk bepalen de aard van meerdere microdeleties op een economische manier. Daarnaast zijn stapsgewijze instructies opgenomen voor selectie van de robuuste, betrouwbare productie en injectie van gids RNAs. De stappen hier illustreren een robuust, relatief goedkope protocol waarmee laboratoriumpersoneel met een scala aan expertise bij te dragen aan de identificatie van het gen uitsparingen in zebrafish.

<table><tbody><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>sgRNA analyse software. http://crispor.tefor.net/</td></tr><tr><td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td>sgRNA analyse software. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>sgRNA analyse software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td></tr><tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCR primer ontwerp. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr><td>Rnase vrije techniek</td><td></td><td></td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>RNase-vrij water</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Synthese van geleide RNA's. Thermo Fisher en Qiagen hebben beide geschikt water.</td></tr><tr><td>Rnase-vrij ethanol</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Ethanol van moleculaire biologie kwaliteit is Rnase vrij. Fischer, VWR verkopen geschikt ethanol.</td></tr><tr><td>Cas9 Eiwit</td><td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>Cas9 eiwit met nucleair lokalisatie signaal.</td></tr><tr><td>Doelspecifieke oligo's</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Synthesize geleide RNA's.</td></tr><tr><td>PCR-primers flankerend geleid RNA snijpunt</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Gebruik voor heteroduplex-analyse, 100-300 bp product.</td></tr><tr><td>PCR-primers flankerend geleid RNA snijpunt</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Gebruik voor sequencing CRISPR-allelen, 300-600 bp product aanbevolen.</td></tr><tr><td>EnGen sgRNA Synthese Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>In vitro transcribe geleide RNA's.</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>RNase-vrije buffer voor elektroforese van nucleïnezuren.</td></tr><tr><td>6X Load Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>DNA laden voor elektroforese.</td></tr><tr><td>5M Ammoniumacetaat</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Opruimingsreagens voor zuivering van geleide RNA's.</td></tr><tr><td>Ethanol (200 proof, nuclease-vrij)</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Opruimingsreagens voor zuivering van geleide RNA's. Materialen van moleculaire kwaliteit zijn RNase vrij.</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Voor synthese en zuivering van geleide RNA's.</td></tr><tr><td>RNase weg</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>Elimineert RNase contaminatie van oppervlakken, apparatuur, glaswerk.</td></tr><tr><td>DNA Ladder, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>Molecuulgewicht standaarden voor gelelektroforese van DNA.</td></tr><tr><td>DNA Ladder, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>Molecuulgewicht standaarden voor gelelektroforese van DNA.</td></tr><tr><td>RNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Single streng RNA marker om te verifiëren dat volledige lengte sgRNA is gesynthetiseerd</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Polyacrylamide gel gieten.</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Polyacrylamide gel gieten.</td></tr><tr><td>40% Polyacrylamide (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Denaturerende polyacrylamide gel gieten.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Denaturerende polyacrylamide gel gieten.</td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Geleide RNA laden op denaturerende gel voor elektroforese.</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Visualisatie van nucleïnezuren.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Alternatieve methode voor ethidiumbromide voor detectie van dsDNA in agarose of polyacrylamide gels.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>RNA opruiming, PCR zuivering.</td></tr><tr><td>MyTaq Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>Voor DNA amplificatie met PCR.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Elk merk</td><td></td><td>PCR amplificatie.</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Elk merk</td><td></td><td>NanoDrop of gerelateerd product om de hoeveelheid DNA/RNA te kwantificeren.</td></tr><tr><td>E3 embryo media</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>Media voor het opvoeden van embryo's en het maken van injectieplaat. Recept: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Methyleenblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Toegevoegd aan 1x E3 media om schimmelgroei op embryo's te voorkomen.</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Embryo's bewaren, injectieplaat gieten.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>Injectieplaat gieten, agarose gels.</td></tr><tr><td>Microinjectie mal</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Om putjes te creëren om embryo's tijdens injectie vast te houden.</td></tr><tr><td>Fenolrood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>Kleurstof voor visualisatie van injectie.</td></tr><tr><td>Mineraalolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>Om naald injectievolume te kalibreren.</td></tr><tr><td>Transferpijpjes</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Embryo's verplaatsen.</td></tr><tr><td>Scheermes</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Injectienaald snijden, staart knippen volwassen vis.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Embryo's op 28,5 oC houden.</td></tr><tr><td>Verticale pijpjestrekker</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Naalden voor injectie genereren. Aanvullende naaldaantrek instructies: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>Capillaire buizen</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Naalden voor injectie genereren.</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Oplossing in injectienaalden laden.</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>Embryo's injecteren.</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td></td><td>Embryo's injecteren.</td></tr><tr><td>30% Polyacylamide (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Heteroduplex gel gieten.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Zebravis anesthesieren voor staart knippen en gDNA extractie uit embryo's. Recept: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>Microgolf

efficiënte productie en identificatie van crispr/cas9-gegenereerd gene uitsparingen in de modelsysteem danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Karakterisering van de geclusterde, regelmatig interspaced, korte, palindromische herhalen (CRISPR) systeem van Streptococcus pyogenes heeft de ontwikkeling van een aanpasbaar platform om snel genereren gene wijzigingen in een breed scala van organismen, met inbegrip van de zebravis. CRISPR gebaseerde genoom bewerken maakt gebruik van een enkele gids RNA (sgRNA) te richten op een CRISPR-geassocieerde (Cas) endonuclease aan een genomic DNA (gDNA) doel van belang, waar de Cas endonuclease genereert een dubbel-strand break (DSB). Reparatie van DSBs door foutgevoelige mechanismen tot invoegingen of verwijderingen (microdeleties). Hierdoor kan frameshift mutaties die vaak leiden tot een voortijdige stop codon binnen de codering volgorde, waardoor een eiwit-null-allel. CRISPR gebaseerde genoom engineering vereist alleen een paar onderdelen van de moleculaire en zebrafish embryo's gemakkelijk door microinjection is binnengebracht. Dit protocol beschrijft de methoden die worden gebruikt voor het genereren van CRISPR reagentia voor zebrafish microinjection en vis exposeren germline transmissie van CRISPR gemodificeerde genen te identificeren. Deze methoden omvatten in vitro transcriptie van sgRNAs, microinjection van CRISPR reagentia, identificatie van microdeleties veroorzaakte op de doelsite met behulp van een PCR-gebaseerde methode met de naam van een heteroduplex mobility assay (HMA) en karakterisering van de microdeleties met behulp van zowel een lage doorvoersnelheid en een krachtige volgende generatie sequencing (NGS)-gebaseerde aanpak die meerdere PCR producten verzameld uit heterozygoot vis analyseren kan. Dit protocol wordt gestroomlijnd om te minimaliseren van het aantal vissen nodig én de soorten apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van de analyses. Bovendien, dit protocol is ontworpen om te worden vatbaar voor gebruik door laboratorium persoonlijke van alle niveaus van ervaring met inbegrip van studenten, waardoor dit krachtige hulpmiddel kunnen economisch worden ingezet door alle geïnteresseerd in het uitvoeren van de CRISPR gebaseerde onderzoeksgroep genomic wijziging in zebrafish.

De experimentele benaderingen in dit protocol omschreven zorgen voor efficiënte, rendabele productie van zebravis knock-out lijnen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie. De volgende cijfers zijn opgenomen in dit artikel om de interpretatie en probleemoplossing van de resultaten verkregen met behulp van dit protocol. Na succesvolle productie en microinjection van CRISPR-reagentia, de zebravis embryo's kunnen worden geanalyseerd voor openlijke fenotypes en indel vorming met behulp van HMA. Een nuttige controle te visualiseren van het succes van de CRISPR-experiment is het gebruik van de sgRNA die is beschreven in stap 1.5 te richten op het produceren van pigment gen tyrosinase. Cas9-geïnduceerde indel vorming op tyrosinase resulteert in verlies van pigmentatie en gemakkelijk gescoord wordt door 48 hpf (Figuur 1). Een ander nuttig besturingselement om ervoor te zorgen dat de bereiding van de CRISPR-reagentia voor injectie is geslaagd, is om te verifiëren dat full-length (120 nt) sgRNA heeft zijn gesynthetiseerd met behulp van een denatureren polyacrylamide-gel (Figuur 2, Lane 1 en 2). RNA is afgebroken het mogelijk weergegeven als een uitstrijkje, bijvoorbeeld Lane 3 (Figuur 2) toont aangetaste RNA dat is niet geschikt voor injectie.
Voor het analyseren van de indel vorming frequentie van genen gericht door CRISPR-Cas9 die niet leiden openlijke fenotypen zoals tyrosinase tot, is HMA analyse een eenvoudige en betrouwbare methode. sgRNA/Cas9 geïnjecteerd embryo's geanalyseerd gebruik HMA resulteert in de vorming van heteroduplex bands en vermindering van de intensiteit van de homoduplex band (Figuur 4). De aanwezigheid van heteroduplex bands wordt verder gebruikt in dit protocol bij het identificeren van potentiële oprichter vis uit de microinjected van de embryo's en als volwassenen (Figuur 4 en Figuur 5), voor het analyseren van de efficiëntie van de transmissie germline van een oprichter ( Figuur 6), en om te controleren of de aanwezigheid van een indel in een heterozygote F1 vis (Figuur 7). De heterozygoot vis die een indel bevatten zijn kandidaten voor NGS de aard van de indel vast te stellen en te bepalen of een voortijdige stop codon in de codering regio van het target-gen aanwezig is.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> Figuur 1 : Zebravis embryo's vertonen een pigment defect wanneer ingespoten met een sgRNA dat targeting tyrosinase stadium van de één-cel. (A) Wild-type, uninjected embryo op 48 hpf en (B) geïnjecteerd embryo op 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> Figuur 2 : In vitro transcriptie van sgRNA met behulp van synthese kit. Oligos werden gesynthetiseerd met behulp van in vitro transcriptie volgens de sgRNA synthese kit instructies. 500 ng van RNA werd uitgevoerd op een gel ureum/pagina zoals beschreven. sgRNA geladen in rijstroken 1en 2 toont een band die overeenkomt met de volledige lengte, intact 120 nt RNA. De sgRNA in baan 3 toont een aangetaste RNA-monster dat is niet geschikt voor injectie.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> Figuur 3 : Vergelijking van de gezondheid van de embryo's 24 hpf geïnjecteerd. Een levende embryo (A) ontwikkeld om 24 hpf, wordt gemakkelijk onderscheiden van een embryo dat ontwikkeling (B) is afgebroken. Embryo's die lijken op (B) of drastisch veranderd functies met (A), zoals spinal kromming of gewijzigd van hoofd en ogen ontwikkeling moet worden verwijderd uit de schotel. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> Figuur 4 : Heteroduplex mobility assay voor sgRNA-Cas9 microinjected embryo's de zebravis. Zwembaden van de 5 embryo's per monster werden verzameld op 72 hpf en gDNA werd gewonnen. Heteroduplex analyse werd uitgevoerd zoals beschreven, monsters even vol met 500 ng van DNA. Rijstroken: M = 100 bp marker; 1 = uninjected controle; 2 = injectie monster 1; 3 = injectie monster 2. Verwacht band maat 98 = bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> Figuur 5 : Heteroduplex mobiliteit kwantitatieve analyse van gDNA gewonnen uit de staart van een volwassen CRISPR-geïnjecteerd zebrafish. Embryo's die werden geïnjecteerd met een sgRNA en een Cas9 eiwit waren uitgegroeid tot volwassenheid (3 maanden). Vissen B en C heteroduplex banden vertonen en vervolgens werden gefokt om te identificeren germline verzonden microdeleties; vis A werd niet gebruikt in daaropvolgende analyse omdat het niet een positieve heteroduplex-band vertonen doet. Rijstroken: 1 = wild-type controle; 2 = vis A; 3 = vis B; 4 = vis C. verwacht band maat 98 = bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> Figuur 6 : Heteroduplex mobility assay van één embryo's die zijn gegenereerd door het fokken van een zebravis F0 CRISPR-geïnjecteerd om een wild-type vis te identificeren germline verzonden microdeleties. Zebravis werden gekruist, en de F1-embryo's geteeld voor 72 h. één embryo's werden verzameld en heteroduplex analyse uitgevoerd zoals beschreven. Rijstroken: 1 = wild-type controle; 2-10 = een enkele F1 embryo per rijstrook. Deze gel bevat dat 7 van de 10 embryo's een positieve heteroduplex-band tonen, die een doorvoersnelheid van kiemcellen van 70% van de indel aangeeft. Verwacht van de band grootte = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> Figuur 7 : Heteroduplex mobility assay voor volwassen F1 zebrafish staart clips. Volwassen F1 vis werden gescoord door HMA microdeleties identificeren. Vis die tentoongesteld van een positieve heteroduplex band waren PCR versterkt en ingediend voor brede sequencing analyse om te bepalen van de aard van de mutatie. (A) rijstroken: 1 = wild-type controle; 2 = vis een (4 bp schrapping, 1 bp mismatch). (B) deze F1 vis van de dezelfde oprichter werden geïdentificeerd, en nog verschillende heteroduplex patronen, die aangeeft germline transmissie van meerdere gemodificeerde allelen van een enkele oprichter Toon. Rijstroken: 1 = wild-type controle; 2 = vis B (4 bp inbrengen, 7 bp mismatch), 3 = vis C (4 bp schrapping, 4 bp mismatch). Elk van deze microdeleties gemaakt een voortijdige stop codon in de codering sequentie van het gen van de doelgroep, zoals bepaald door NGS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Het algemene doel van deze procedure is om gerichte genoombewerking uit te voeren met behulp van CRISPR/Cas9-technologie bij zebravissen om gen-knockouts op een robuuste, goedkope manier te ontwikkelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de biologische rol van een gen in de context van een modelsysteem van gewervelde dieren, zoals hoe een gen bijdraagt aan ontwikkelingsprocessen in hogere eukaryoten. Met deze eenvoudige, robuuste procedures kunnen laboratoriumpersoneel van alle ervaringsniveaus, inclusief studenten, gerichte genomische modificaties bij zebravissen uitvoeren.Personen die nieuw zijn in deze methode, zouden de stapsgewijze instructies moeten kunnen volgen om optimale genomische doelen voor CRISPR-mutagenese te identificeren, zebravis-embryo-micro-injectie uit te voeren en gemodificeerde allelen te identificeren. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien deze methode is bedoeld voor studenten die mogelijk onbekend zijn met een of meer van de noodzakelijke technieken. Richtlijnen voor het ontwerp van template-specifieke oligo's voor de productie van geleide RNA worden gegeven in het tekstprotocol.Om te beginnen, schorst u het Cas9-eiwit in buffer om een oplossing van één milligram per milliliter te genereren. Bewaar deze oplossing in injectieklare aliquots bij minus 80 graden Celsius voor later gebruik. Synthetiseer vervolgens de sgRNA met een in vitro transcriptiekit zoals degene die wordt gesuggereerd in de materialen van dit artikel volgens de instructies van de fabrikant.Zuiver de gesynthetiseerde sgRNA met behulp van een RNAse-vrije ammoniumacetaatprecipitatie. Voeg 25 microliters vijf molaire ammoniumacetaat toe aan het gesynthetiseerde RNA en meng de oplossing door te vortexen. Voeg vervolgens 150 microliters 200 bewijs nuclease-vrij ethanol toe aan het monster.En plaats de reactie in een min 80 graden Celsius vriezer gedurende minimaal 20 minuten. Centrifugeer vervolgens de monsters op maximale snelheid. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en zorg ervoor dat het RNA-pellet niet wordt verstoord.Voeg vervolgens één milliliter 70%ethanol toe en draai de buis meerdere keren om resterend zout uit de buis te wassen. Centrifugeer opnieuw bij maximale snelheid bij vier graden Celsius gedurende zeven minuten. Gebruik een P1000-pipet om het grootste deel van de oplossing te verwijderen.Gebruik vervolgens een P200-pipet om zoveel mogelijk van de resterende oplossing te verwijderen zonder het pellet te verstoren. Zorg ervoor dat u RNAse-besmetting vermijdt, droog het pellet in een schone ruimte tot er geen vloeibare druppels meer zichtbaar zijn in de buis. Resuspendeer het pellet in 30 microliters RNAse-vrij water en gebruik een spectrofotometer om het product te kwantificeren.Deel de oplossing in aliquoten in voor langdurige opslag bij min 80 graden Celsius. Meng vervolgens 300 tot 500 nanogram sgRNA met een gelijk volume van 2X RNA-gel-laaddye. Gebruik vervolgens een P1000-pipet om elk van de agarose-gelwelletjes meerdere keren te ontdoen van puin met behulp van running buffer.Laad de oplossingen in de agarose-gelwelletjes en laat de gel draaien bij 10 volt per centimeter gedurende voldoende tijd om de RNA-banden op de gel te scheiden. De tijd kan variëren per elektroforese-apparaat. Over het algemeen zou de kleurstoffront tot 2/3 van de lengte van de gel moeten worden uitgevoerd.Gebruik vervolgens een nucleïnezuurkleuring om de banden te visualiseren. Intact RNA verschijnt als een enkele band zoals in baan een en twee hier getoond. Gedegradeerd RNA loopt als een vlek zoals in baan drie.Bereidt eerst de zebravis-subjecten voor het fokken de nacht voorafgaand aan het uitvoeren van injecties voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Combineer vervolgens Cas9-eiwit en sgRNA in een twee-naar-één-verhouding. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten terwijl Cas9 en sgRNA een ribonucleoproteïnecomplex vormen.Voeg vervolgens 0,5 microliter 2,5% fenolrode oplossingen toe in voldoende RNAse-vrij water om een eindvolume van vijf microliters te bereiken. Gebruik een micropipettrekker om een glascapillair van één millimeter te trekken om de injectienaald voor te bereiden. Snijd vervolgens de punt van de resulterende glazen naald af met een scheermes om een hoekige opening te verkrijgen.Plaats de naald in een micromanipulator die is bevestigd aan een micro-injector. Stel met behulp van een lichtmicroscoop de injectiedruk in totdat de naald consistent één nanometer oplossing in de petrischaal injecteert. Oefen het voorbereiden van naalden en het injecteren van controle-embryo's met behulp van alleen een kleurstofoplossing en neem de overleving na 24 uur ontwikkeling op voordat u embryo-micro-injectie uitvoert.U zou meer dan 90% overleving moeten kunnen bereiken vergeleken met een niet-geïnjecteerde controle. Selecteer vervolgens 10 tot 15 embryo's als controlepopulatie en plaats ze in een afzonderlijk gelabelde petrischaal. Gebruik een transferpipet om de resterende embryo's voorzichtig op een injectieplaat op kamertemperatuur uit te lijnen.Injecteer onder een dissectiemicroscoop één nanoliter van de oplossing in de dooierzak van elk embryo. Breng vervolgens de geïnjecteerde embryo's terug naar een gelabelde petrischaal en bedek ze met 1X E3-media met methyleenblauw. Plaats de geïnjecteerde embryo's in een incubator bij 28 graden Celsius gedurende 24 uur.Inspecteer vervolgens de geïnjecteerde embryo's om dode of abnormaal ontwikkelende individuen te verwijderen. Verzamel eerst twee sets van vijf 72 uur oude embryo's van de platen met geïnjecteerde embryo's en één set van vijf 72 uur oude embryo's van de niet-geïnjecteerde controlegroep in de microcentrifugebuisjes. Pipetteer voorzichtig het media van elke embryoset en anesthesiseer ze.Verwijder het anestheticum na twee minuten en voeg 45 microliter 50 millimolair natriumhydroxide toe. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij 95 graden. Vervolgens verwij

efficient-production-identification-crisprcas9-generated-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Deze video beschrijft een techniek van Embryo microinjection om verbindingen in Zebrafish dooierzak te leveren.

Embryo Microinjection: Een techniek om een verbinding in de Zebrafish Yolk te leveren

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de productie en de achterste CRISPR/Cas9 genoom Knockout elektrische vissen. Gedetailleerd beschreven zijn de vereiste moleculaire biologie-, fok-en veeteelt vereisten voor zowel een gymnotitievorm als een mormyrid, en injectietechnieken om Cas9-geïnduceerde Indel F0 -larven te produceren.

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het gebruik van het RNA-targeting Cas13D-enzym (RfxCas13D) in vliegen.

Alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila Melanogaster met CRISPR/CasRx

Vroege ontwikkeling is afhankelijk van moederlijk overgeërfde producten en de rol van veel van deze producten is momenteel onbekend. Hierin beschreven we een protocol dat CRISPR-Cas9 gebruikt om fenotypen met maternale effecten in een enkele generatie te identificeren.

Het bepalen van de rol van maternale tot expressie gebrachte genen in de vroege ontwikkeling met maternale crispants

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Leer gerichte genoombewerking met CRISPR/Cas9 in zebrafish voor functionele genetica en ontwikkelingsbiologie. Dit protocol maakt efficiënte productie en identificatie van gen-uitsparingen mogelijk.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Meer video's verkennen