Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio
28 augustus 2018
Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.
Het algemene doel van deze procedure is om gerichte genoombewerking uit te voeren met behulp van CRISPR/Cas9-technologie bij zebravissen om gen-knockouts op een robuuste, goedkope manier te ontwikkelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de biologische rol van een gen in de context van een modelsysteem van gewervelde dieren, zoals hoe een gen bijdraagt aan ontwikkelingsprocessen in hogere eukaryoten. Met deze eenvoudige, robuuste procedures kunnen laboratoriumpersoneel van alle ervaringsniveaus, inclusief studenten, gerichte genomische modificaties bij zebravissen uitvoeren.
Personen die nieuw zijn in deze methode, zouden de stapsgewijze instructies moeten kunnen volgen om optimale genomische doelen voor CRISPR-mutagenese te identificeren, zebravis-embryo-micro-injectie uit te voeren en gemodificeerde allelen te identificeren. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien deze methode is bedoeld voor studenten die mogelijk onbekend zijn met een of meer van de noodzakelijke technieken. Richtlijnen voor het ontwerp van template-specifieke oligo's voor de productie van geleide RNA worden gegeven in het tekstprotocol.
Om te beginnen, schorst u het Cas9-eiwit in buffer om een oplossing van één milligram per milliliter te genereren. Bewaar deze oplossing in injectieklare aliquots bij minus 80 graden Celsius voor later gebruik. Synthetiseer vervolgens de sgRNA met een in vitro transcriptiekit zoals degene die wordt gesuggereerd in de materialen van dit artikel volgens de instructies van de fabrikant.
Zuiver de gesynthetiseerde sgRNA met behulp van een RNAse-vrije ammoniumacetaatprecipitatie. Voeg 25 microliters vijf molaire ammoniumacetaat toe aan het gesynthetiseerde RNA en meng de oplossing door te vortexen. Voeg vervolgens 150 microliters 200 bewijs nuclease-vrij ethanol toe aan het monster.
En plaats de reactie in een min 80 graden Celsius vriezer gedurende minimaal 20 minuten. Centrifugeer vervolgens de monsters op maximale snelheid. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en zorg ervoor dat het RNA-pellet niet wordt verstoord.
Voeg vervolgens één milliliter 70%ethanol toe en draai de buis meerdere keren om resterend zout uit de buis te wassen. Centrifugeer opnieuw bij maximale snelheid bij vier graden Celsius gedurende zeven minuten. Gebruik een P1000-pipet om het grootste deel van de oplossing te verwijderen.
Gebruik vervolgens een P200-pipet om zoveel mogelijk van de resterende oplossing te verwijderen zonder het pellet te verstoren. Zorg ervoor dat u RNAse-besmetting vermijdt, droog het pellet in een schone ruimte tot er geen vloeibare druppels meer zichtbaar zijn in de buis. Resuspendeer het pellet in 30 microliters RNAse-vrij water en gebruik een spectrofotometer om het product te kwantificeren.
Deel de oplossing in aliquoten in voor langdurige opslag bij min 80 graden Celsius. Meng vervolgens 300 tot 500 nanogram sgRNA met een gelijk volume van 2X RNA-gel-laaddye. Gebruik vervolgens een P1000-pipet om elk van de agarose-gelwelletjes meerdere keren te ontdoen van puin met behulp van running buffer.
Laad de oplossingen in de agarose-gelwelletjes en laat de gel draaien bij 10 volt per centimeter gedurende voldoende tijd om de RNA-banden op de gel te scheiden. De tijd kan variëren per elektroforese-apparaat. Over het algemeen zou de kleurstoffront tot 2/3 van de lengte van de gel moeten worden uitgevoerd.
Gebruik vervolgens een nucleïnezuurkleuring om de banden te visualiseren. Intact RNA verschijnt als een enkele band zoals in baan een en twee hier getoond. Gedegradeerd RNA loopt als een vlek zoals in baan drie.
Bereidt eerst de zebravis-subjecten voor het fokken de nacht voorafgaand aan het uitvoeren van injecties voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Combineer vervolgens Cas9-eiwit en sgRNA in een twee-naar-één-verhouding. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten terwijl Cas9 en sgRNA een ribonucleoproteïnecomplex vormen.
Voeg vervolgens 0,5 microliter 2,5% fenolrode oplossingen toe in voldoende RNAse-vrij water om een eindvolume van vijf microliters te bereiken. Gebruik een micropipettrekker om een glascapillair van één millimeter te trekken om de injectienaald voor te bereiden. Snijd vervolgens de punt van de resulterende glazen naald af met een scheermes om een hoekige opening te verkrijgen.
Plaats de naald in een micromanipulator die is bevestigd aan een micro-injector. Stel met behulp van een lichtmicroscoop de injectiedruk in totdat de naald consistent één nanometer oplossing in de petrischaal injecteert. Oefen het voorbereiden van naalden en het injecteren van controle-embryo's met behulp van alleen een kleurstofoplossing en neem de overleving na 24 uur ontwikkeling op voordat u embryo-micro-injectie uitvoert.
U zou meer dan 90% overleving moeten kunnen bereiken vergeleken met een niet-geïnjecteerde controle. Selecteer vervolgens 10 tot 15 embryo's als controlepopulatie en plaats ze in een afzonderlijk gelabelde petrischaal. Gebruik een transferpipet om de resterende embryo's voorzichtig op een injectieplaat op kamertemperatuur uit te lijnen.
Injecteer onder een dissectiemicroscoop één nanoliter van de oplossing in de dooierzak van elk embryo. Breng vervolgens de geïnjecteerde embryo's terug naar een gelabelde petrischaal en bedek ze met 1X E3-media met methyleenblauw. Plaats de geïnjecteerde embryo's in een incubator bij 28 graden Celsius gedurende 24 uur.
Inspecteer vervolgens de geïnjecteerde embryo's om dode of abnormaal ontwikkelende individuen te verwijderen. Verzamel eerst twee sets van vijf 72 uur oude embryo's van de platen met geïnjecteerde embryo's en één set van vijf 72 uur oude embryo's van de niet-geïnjecteerde controlegroep in de microcentrifugebuisjes. Pipetteer voorzichtig het media van elke embryoset en anesthesiseer ze.
Verwijder het anestheticum na twee minuten en voeg 45 microliter 50 millimolair natriumhydroxide toe. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij 95 graden. Vervolgens verwij
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestroomlijnd protocol voor gerichte genoommodificatie in zebravis met behulp van CRISPR/Cas9-technologie. Er wordt nadruk gelegd op de generatie en identificatie van CRISPR-afgeleide nonsense-allelen via een combinatie van technieken, waaronder de heteroduplex-mobiliteitsassay en next-generation sequencing.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
- Modelorganismen
Achtergrond
- Zebravissen dienen als een belangrijk gewervde model voor het bestuderen van genfuncties.
- CRISPR/Cas9-technologie maakt nauwkeurige genoommodificatie mogelijk.
- Inzicht in de rol van genen kan ontwikkelingsprocessen in hogere eukaryoten verduidelijken.
- Deze methode is toegankelijk voor onderzoekers van alle ervaringsniveaus.
Doel van de studie
- Het bieden van een robuust protocol voor het genereren van gen-knock-outs in zebravis.
- Het faciliteren van de identificatie van mutaties als gevolg van CRISPR-editing.
- Het in staat stellen van onderzoekers om genfuncties in de ontwikkelingsbiologie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van Cas9-eiwit en sgRNA voor micro-injectie.
- Micro-injectie van CRISPR-componenten in zebravisembryo's.
- Gebruik van next-generation sequencing voor de identificatie van mutaties.
- Heteroduplex mobility assay voor mutatieanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van CRISPR-afgeleide nonsense-allelen in zebravisen.
- Hoge overlevingspercentages van geïnjecteerde embryo's na micro-injectie.
- Effectieve identificatie van genomische modificaties met behulp van sequencingtechnieken.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode voor onderzoekers met verschillende niveaus van ervaring.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare aanpak voor gerichte genoommodificatie in zebravisen.
- Het vergroot de mogelijkheid om genfuncties in een gewervde modelorganisme te bestuderen.
- Deze methode kan eenvoudig worden toegepast door zowel onderzoekers als studenten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt de snelle en kosteneffectieve generatie van gene knockouts mogelijk in zebravis, een essentieel gewervde model voor targetvalidatie en fenotypische screening in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling. Door een gestroomlijnde workflow voor CRISPR-gebaseerde genoommodificatie aan te bieden die toegankelijk is voor onderzoekers van alle ervaringsniveaus, ondersteunt het de mechanistische risicoreductie en het voorspellend vertrouwen bij het testen van therapeutische hypothesen. De methode vermindert de benodigde middelen terwijl een hoge efficiëntie van kiemlijntransmissie behouden blijft, wat in lijn is met bedrijfsdoelstellingen voor schaalbare, reproduceerbare discovery biology.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking en doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het onderzoek naar genfuncties mogelijk door het genereren van proteïne-null allelen in een gewerveld systeem.
- Operationele waarde: Ondersteunt snelle targetvalidatie met gebruik van zebravissenembryo's met hoge overlevingspercentages na micro-injectie.
- Voorspellende waarde: Faciliteert biologische risicoreductie door genotype aan fenotype te koppelen in een ziekterevlevant model.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gemodificeerde allelen die geschikt zijn voor downstream fenotypische en functionele screeningsassays.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van de heteroduplex mobility assay (HMA) en NGS voor gestandaardiseerde, kwantitatieve indel-detectie.
- Schaalbaarheid: Ontworpen om de behoefte aan vissen en apparatuur te minimaliseren, wat high-throughput identificatie van allelen mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van zebravis als een ziekterelavant systeem om de kloof tussen ontdekking en preklinische validatie te overbruggen.
- Mechanische risicoreductie: Bevestigt de kiemlijnoverdracht van CRISPR-modificaties, wat de F1-generatie ondersteunt voor overervingsstudies.
- Predictieve betrouwbaarheid: Maakt karakterisering van indels via NGS mogelijk om de functionele impact van genetische perturbaties te voorspellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is integreerbaar in vroege discovery-workflows en ondersteunt de overgang van doelwithypothese naar lead-identificatie door middel van betrouwbare genoommodificatie in zebravisjes.
- Discovery Biology: Maakt hypothese-testen mogelijk via gerichte gene-knockout in een gewervde modelorganisme met een hoge bewerkings-efficiëntie.
- Screening: Levert gevalideerde biologische systemen op voor assay-ontwikkeling met behulp van HMA-bevestigde founder-vissen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve mutatieanalyse via vergelijking van HMA-bandintensiteit en NGS-gebaseerde indel-sequencing.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van gene-editing naar fenotypische beoordeling in ontwikkelende zebravisembryo's.
- Enterprise Hergebruik: Geoptimaliseerd voor lage kosten en toegankelijkheid voor bachelorstudenten, wat brede adoptie in laboratoria en het delen van reagentia mogelijk maakt.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door middel van precieze, via CRISPR gegenereerde nonsense-allelen.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gestroomlijnde protocollen voor sgRNA-preparatie en micro-injectie.
- Strategische waarde: Vermindering van biologische risico's in een laat stadium door vroege functionele genonderzoek in een gewerveld systeem.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van kiemlijnoverdracht en fenotypische uitkomsten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, embryohandtering en technieken voor nucleicazuurextractie.
- Afhankelijk van toegang tot micro-injectoren, thermocyclers, gelelektroforese en spectrofotometrie voor kwaliteitscontrole.
- Maakt standaardisatie van het sgRNA-ontwerp en de vorming van Cas9-sgRNA ribonucleoproteïnecomplexen tussen gebruikers noodzakelijk.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten variërende sgRNA-efficiëntie en potentieel mosaicisme in geïnjecteerde embryo's.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van fenotypische screening om functionele knock-outs te onderscheiden van stille indels.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Preparation of CRISPR-reagents for Embryo Microinjection
4:03
Microinjection of CRISPR-components into Zebrafish Embryos
6:12
Analysis of Efficiency of Indel Formation Using an HMA
8:45
Identification and Propagation of Knock-out Lines
9:45
Results: Zebrafish Embryos Exhibit a Pigment Defect when Injected with an sgRNA Targeting Tyrosinase at the One Cell Stage
10:32
Conclusion
