Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio
August 28th, 2018
Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.
Het algemene doel van deze procedure is om gerichte genoombewerking uit te voeren met behulp van CRISPR/Cas9-technologie bij zebravissen om gen-knockouts op een robuuste, goedkope manier te ontwikkelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de biologische rol van een gen in de context van een modelsysteem van gewervelde dieren, zoals hoe een gen bijdraagt aan ontwikkelingsprocessen in hogere eukaryoten. Met deze eenvoudige, robuuste procedures kunnen laboratoriumpersoneel van alle ervaringsniveaus, inclusief studenten, gerichte genomische modificaties bij zebravissen uitvoeren.
Personen die nieuw zijn in deze methode, zouden de stapsgewijze instructies moeten kunnen volgen om optimale genomische doelen voor CRISPR-mutagenese te identificeren, zebravis-embryo-micro-injectie uit te voeren en gemodificeerde allelen te identificeren. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien deze methode is bedoeld voor studenten die mogelijk onbekend zijn met een of meer van de noodzakelijke technieken. Richtlijnen voor het ontwerp van template-specifieke oligo's voor de productie van geleide RNA worden gegeven in het tekstprotocol.
Om te beginnen, schorst u het Cas9-eiwit in buffer om een oplossing van één milligram per milliliter te genereren. Bewaar deze oplossing in injectieklare aliquots bij minus 80 graden Celsius voor later gebruik. Synthetiseer vervolgens de sgRNA met een in vitro transcriptiekit zoals degene die wordt gesuggereerd in de materialen van dit artikel volgens de instructies van de fabrikant.
Zuiver de gesynthetiseerde sgRNA met behulp van een RNAse-vrije ammoniumacetaatprecipitatie. Voeg 25 microliters vijf molaire ammoniumacetaat toe aan het gesynthetiseerde RNA en meng de oplossing door te vortexen. Voeg vervolgens 150 microliters 200 bewijs nuclease-vrij ethanol toe aan het monster.
En plaats de reactie in een min 80 graden Celsius vriezer gedurende minimaal 20 minuten. Centrifugeer vervolgens de monsters op maximale snelheid. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en zorg ervoor dat het RNA-pellet niet wordt verstoord.
Voeg vervolgens één milliliter 70%ethanol toe en draai de buis meerdere keren om resterend zout uit de buis te wassen. Centrifugeer opnieuw bij maximale snelheid bij vier graden Celsius gedurende zeven minuten. Gebruik een P1000-pipet om het grootste deel van de oplossing te verwijderen.
Gebruik vervolgens een P200-pipet om zoveel mogelijk van de resterende oplossing te verwijderen zonder het pellet te verstoren. Zorg ervoor dat u RNAse-besmetting vermijdt, droog het pellet in een schone ruimte tot er geen vloeibare druppels meer zichtbaar zijn in de buis. Resuspendeer het pellet in 30 microliters RNAse-vrij water en gebruik een spectrofotometer om het product te kwantificeren.
Deel de oplossing in aliquoten in voor langdurige opslag bij min 80 graden Celsius. Meng vervolgens 300 tot 500 nanogram sgRNA met een gelijk volume van 2X RNA-gel-laaddye. Gebruik vervolgens een P1000-pipet om elk van de agarose-gelwelletjes meerdere keren te ontdoen van puin met behulp van running buffer.
Laad de oplossingen in de agarose-gelwelletjes en laat de gel draaien bij 10 volt per centimeter gedurende voldoende tijd om de RNA-banden op de gel te scheiden. De tijd kan variëren per elektroforese-apparaat. Over het algemeen zou de kleurstoffront tot 2/3 van de lengte van de gel moeten worden uitgevoerd.
Gebruik vervolgens een nucleïnezuurkleuring om de banden te visualiseren. Intact RNA verschijnt als een enkele band zoals in baan een en twee hier getoond. Gedegradeerd RNA loopt als een vlek zoals in baan drie.
Bereidt eerst de zebravis-subjecten voor het fokken de nacht voorafgaand aan het uitvoeren van injecties voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Combineer vervolgens Cas9-eiwit en sgRNA in een twee-naar-één-verhouding. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten terwijl Cas9 en sgRNA een ribonucleoproteïnecomplex vormen.
Voeg vervolgens 0,5 microliter 2,5% fenolrode oplossingen toe in voldoende RNAse-vrij water om een eindvolume van vijf microliters te bereiken. Gebruik een micropipettrekker om een glascapillair van één millimeter te trekken om de injectienaald voor te bereiden. Snijd vervolgens de punt van de resulterende glazen naald af met een scheermes om een hoekige opening te verkrijgen.
Plaats de naald in een micromanipulator die is bevestigd aan een micro-injector. Stel met behulp van een lichtmicroscoop de injectiedruk in totdat de naald consistent één nanometer oplossing in de petrischaal injecteert. Oefen het voorbereiden van naalden en het injecteren van controle-embryo's met behulp van alleen een kleurstofoplossing en neem de overleving na 24 uur ontwikkeling op voordat u embryo-micro-injectie uitvoert.
U zou meer dan 90% overleving moeten kunnen bereiken vergeleken met een niet-geïnjecteerde controle. Selecteer vervolgens 10 tot 15 embryo's als controlepopulatie en plaats ze in een afzonderlijk gelabelde petrischaal. Gebruik een transferpipet om de resterende embryo's voorzichtig op een injectieplaat op kamertemperatuur uit te lijnen.
Injecteer onder een dissectiemicroscoop één nanoliter van de oplossing in de dooierzak van elk embryo. Breng vervolgens de geïnjecteerde embryo's terug naar een gelabelde petrischaal en bedek ze met 1X E3-media met methyleenblauw. Plaats de geïnjecteerde embryo's in een incubator bij 28 graden Celsius gedurende 24 uur.
Inspecteer vervolgens de geïnjecteerde embryo's om dode of abnormaal ontwikkelende individuen te verwijderen. Verzamel eerst twee sets van vijf 72 uur oude embryo's van de platen met geïnjecteerde embryo's en één set van vijf 72 uur oude embryo's van de niet-geïnjecteerde controlegroep in de microcentrifugebuisjes. Pipetteer voorzichtig het media van elke embryoset en anesthesiseer ze.
Verwijder het anestheticum na twee minuten en voeg 45 microliter 50 millimolair natriumhydroxide toe. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij 95 graden. Vervolgens verwij
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestroomlijnd protocol voor gerichte genoombewerking bij zebravis met behulp van CRISPR/Cas9-technologie. Het legt de nadruk op het genereren en identificeren van CRISPR-afgeleide nonsense-allelen door een combinatie van technieken, waaronder de heteroduplex mobiliteitstest en next-generation sequencing.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
- Modelorganismen
Achtergrond
- Zebravissen dienen als een belangrijk model voor gewervelde dieren voor het bestuderen van genfunctie.
- CRISPR/Cas9-technologie maakt nauwkeurige genoombewerking mogelijk.
- Het begrijpen van genrollen kan ontwikkelingsprocessen in hogere eukaryoten verduidelijken.
- Deze methode is toegankelijk voor onderzoekers op alle ervaringsniveaus.
Doel van de studie
- Een robuust protocol bieden voor het genereren van genknockouts bij zebravis.
- De identificatie van mutaties die het resultaat zijn van CRISPR-bewerking vergemakkelijken.
- Onderzoekers in staat stellen om genfuncties in ontwikkelingsbiologie te verkennen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van Cas9-eiwit en sgRNA voor micro-injectie.
- Micro-injectie van zebravis-embryo's met CRISPR-componenten.
- Gebruik van next-generation sequencing om mutaties te identificeren.
- Heteroduplex mobiliteitstest voor mutatie-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van CRISPR-afgeleide nonsense-allelen in zebravis.
- Hoge overlevingspercentages van geïnjecteerde embryo's na micro-injectie.
- Effectieve identificatie van genomische modificaties met behulp van sequencingtechnieken.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode voor onderzoekers met verschillende ervaringsniveaus.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare aanpak voor gerichte genoombewerking bij zebravis.
- Het verbetert de mogelijkheid om genfuncties in een model voor gewervelde dieren te bestuderen.
- Deze methode kan gemakkelijk worden overgenomen door onderzoekers en studenten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, cost-effective generation of gene knockouts in zebrafish, a key vertebrate model for target validation and phenotypic screening in early drug discovery. By providing a streamlined workflow for CRISPR-based genome editing accessible to researchers of all experience levels, it supports mechanistic de-risking and predictive confidence in therapeutic hypothesis testing. The method reduces resource requirements while maintaining high germline transmission efficiency, aligning with enterprise goals for scalable, reproducible discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function through protein-null allele generation in a vertebrate system.
- Operational Value: Supports rapid target validation using zebrafish embryos with high survival rates post-microinjection.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by linking genotype to phenotype in a disease-relevant model.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates modified alleles suitable for downstream phenotypic and functional screening assays.
- Operational Value: Employs heteroduplex mobility assay (HMA) and NGS for standardized, quantitative indel detection.
- Scalability: Designed to minimize fish and equipment needs, enabling high-throughput allele identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses zebrafish as a disease-relevant system to bridge discovery and preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Confirms germline transmission of CRISPR modifications, supporting F1 generation for inheritance studies.
- Predictive Confidence: Enables characterization of indels via NGS to predict functional impact of genetic perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting progression from target hypothesis to lead identification through reliable genome editing in zebrafish.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing via targeted gene knockout in a vertebrate model with high editing efficiency.
- Screening: Produces validated biological systems for assay development using HMA-confirmed founder fish.
- Analytics: Provides quantitative mutation analysis through HMA band intensity comparison and NGS-based indel sequencing.
- Translational Research: Supports continuity from gene editing to phenotypic assessment in developing zebrafish embryos.
- Enterprise Reuse: Optimized for low cost and undergraduate accessibility, enabling broad laboratory adoption and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through precise, CRISPR-generated nonsense alleles.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via streamlined sgRNA preparation and microinjection protocols.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk through early functional gene interrogation in a vertebrate system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on germline transmission and phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, embryo handling, and nucleic acid extraction techniques.
- Dependent on access to microinjectors, thermocyclers, gel electrophoresis, and spectrophotometry for QC.
- Necessitates standardization of sgRNA design and Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complex formation across users.
- Adaptation considerations include varying sgRNA efficiency and potential mosaicism in injected embryos.
- Practical limitations include the need for phenotypic screening to distinguish functional knockouts from silent indels.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Preparation of CRISPR-reagents for Embryo Microinjection
4:03
Microinjection of CRISPR-components into Zebrafish Embryos
6:12
Analysis of Efficiency of Indel Formation Using an HMA
8:45
Identification and Propagation of Knock-out Lines
9:45
Results: Zebrafish Embryos Exhibit a Pigment Defect when Injected with an sgRNA Targeting Tyrosinase at the One Cell Stage
10:32
Conclusion
