Name: Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer klonale analyse van hematopoëtische stamcelprecursoren tijdens embryonale ontwikkeling bij muizen. Deze methode combineert index sorteren met endotheliale co-cultuur om fenotypische eigenschappen en engraftment potentieel te beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zouden graag bedanken Andrew Berger, Stacey Dozono en Brian Raden in het Fred Hutchinson Stroom Cytometry kern voor hulp met FACS. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid NHLBI UO1-subsidie #HL100395, bijkomende Collaborative Grant #HL099997 en NIDDK verlenen #RC2DK114777. Brandon Hadland wordt ondersteund door de Alex's limonade staan Foundation en Hyundai Hope op wielen Foundation.

<ol><li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells%2Flong-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).</li>
<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origin+of+the+HSC+hierarchy+reveals+an+SCF-dependent%2C+IL-3-independent+CD43%28-%29+embryonic+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+progenitor+emergence+in+the+murine+embryo+and+yolk+sac+precedes+stem+cell+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection.</a> Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li>
<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li>
<li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+developmental+stage+of+HSC+and+recipient+on+transplant+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes.</a> Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).</li>
<li>Butler, J. M., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+vascular+niche+for+studying+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis.</a> Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).</li>
<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li>
<li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Common+Origin+for+B-1a+and+B-2+Lymphocytes+in+Clonal+Pre-+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).</li>
<li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Single-Cell+Functional+and+Gene+Expression+Analysis+Resolves+Heterogeneity+within+Stem+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li>
<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
<li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li>
<li>Lorsbach, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RUNX1+in+adult+hematopoiesis%3A+analysis+of+RUNX1-IRES-GFP+knock-in+mice+reveals+differential+lineage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression.</a> Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).</li>
<li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf%CE%B2+for+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li>
<li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li>
<li>Inlay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+progenitors+that+emerge+prior+to+hematopoietic+stem+cells+in+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).</li>
<li>Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell-independent+hematopoiesis%3A+emergence+of+erythroid%2C+megakaryocyte%2C+and+myeloid+potential+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo.</a> FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De studie van HSC genesis tijdens de embryonale ontwikkeling vereist kunnen detecteren HSC potentiële in hemogenic precursoren nog ontbreekt de bevoegdheid om te bieden op de lange termijn multilineage hematopoietische reconstitutie in getransplanteerde volwassen ontvangers. In dit protocol presenteren we een klonale assay van embryonale hemogenic precursoren door stromale co cultuur op vasculaire niche ECs van de AVA, die de rijping van precursoren naar HSC ondersteunt, met latere functionele analyse van transplantatie ...

Klonen studies is gebleken heterogeniteit in de lange termijn engraftment eigenschappen van volwassen HSCs, nieuwe inzicht bijbrengen in HSC subtypen en wijzigingen in de HSC gedrag tijdens veroudering1. Echter, soortgelijke studies van embryonale HSCs en hun uitgangsstoffen zijn uitdagender. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, HSCs die ontstaan is uit een populatie van precursoren bekend als hemogenic endotheel in een voorbijgaande proces bedoeld als het endotheel hematopoietische overgang2. Het eerste HSC, gedefinieerd door hun vermogen om te leveren robuuste, op lange termijn multilineage engraftment na transplantatie in geconditioneerde volwassen geadresseerden, worden niet gedetecteerd totdat na embryonale dag 10.5 (E10.5) in het lymfkliertest embryo, met zeer lage frequentie3 . Tijdens hun ontwikkeling, moeten voorlopers van HSC (pre-HSC) die voortvloeien uit hemogenic endotheel rijping voorafgaand aan het verwerven van de eigenschappen van volwassen HSC die voorzien in efficiënte engraftment in4,5 van de tests van de transplantatie ondergaan , 6. de studie van zeldzame HSC oorsprong, een veelheid van hematopoietische progenitorcellen met erythroid, verduisterend myeloïde en lymfoïde potentieel al worden gedetecteerd vóór de opkomst van HSC van pre-HSC7,8. Pre-HSC onderscheiden van andere hematopoietische progenitorcellen vereist dus, methoden voor klonaal cellen isoleren en hen voorzien van voldoende voor hun rijping signalen naar HSC, om te ontdekken hun engraftment eigenschappen in het testen van de transplantatie.
Een aantal benaderingen zijn beschreven die voldoende zijn voor de detectie van pre-Help en ondersteuning door ex vivo of in vivo rijping naar HSC. Ex vivo methoden hebben afhankelijk van de cultuur van embryonale weefsels, zoals de AGM-regio, waar het eerste HSC in ontwikkeling9worden gedetecteerd. Voortbouwend op deze methoden, protocollen waarin de dissociatie opgenomen, hebben sorteren, en opnieuw aggregatie van AVA weefsels toegestaan de karakterisatie van gesorteerde populaties met HSC precursoren tijdens de ontwikkeling van E9.5 naar E11.5 in de para-aorta splanchnopleura (P-Sp) / AGM regio's4,5,10; deze benaderingen zijn echter niet vatbaar voor high-throughput analyse van precursoren op het niveau van de eencellige vereist voor klonen analyse. Ook in vivo rijping door transplantatie in pasgeboren muizen, waar de communicatie wordt geacht te zijn meer geschikt voor de ondersteuning van eerdere fasen van HSC precursoren, ook heeft onderzoek van gesorteerde populaties van de dooierzak en AVA / P-Sp (P-Sp is de regio van de voorloper van de AVA) met kenmerken van pre-HSC, maar deze methoden ook niet te voorzien van een robuust platform voor single cell analysis11,12.
Studies van Rafii et al. aangetoond dat Akt-geactiveerde endothelial cel (EG) stroma kan bieden een niche-substraat voor de ondersteuning van volwassen HSC zelf-vernieuwing in vitro13,14,15. We onlangs vastgesteld dat Akt-geactiveerde EG afgeleid van de AVA regio (AGM-EG) een niche geschikt in vitro voor de rijping van hemogenic precursoren biedt, zo vroeg als E9 in ontwikkeling, tot volwassene-enten HSC, evenals de latere geïsoleerd zelf-vernieuwing van de gegenereerde HSC16. Gezien het feit dat dit systeem maakt gebruik van een eenvoudige CO 2-dimensionale cultuur, is het gemakkelijk aanpasbaar voor klonen analyse van het potentieel van de HSC van individueel geïsoleerde hemogenic precursoren.
We hebben onlangs gemeld dat een benadering van het potentieel van de HSC van klonen hemogenic precursoren assay door het combineren van index sortering van individuele hemogenic precursoren van lymfkliertest embryo's met AGM-EG mede cultuur en latere functionele analyse van transplantatie testen van17. Het sorteren van de index is een modus van fluorescentie-activated cell sorting (FACS) dat records (indexen) alle fenotypische parameters (d.w.z., voorwaartse scatter (FSC-A), naast scatter (WS-A), fluorescentie parameters) van elk afzonderlijk gesorteerde cel dat deze functies kunnen met terugwerkende kracht worden gecorreleerd aan latere functionaalanalyse na sorteren. FACS software registreert beide fenotypische informatie voor elke cel en de positie per putje van de 96-wells-plaat waarin het werd geplaatst. Deze techniek is eerder elegant gebruikt voor het identificeren van heterogeniteit in volwassen HSC, fenotypische parameters die verder verrijken voor de lange termijn enten subset van HSC, en fenotypische parameters van HSC correleren met transcriptionele bepalen eigenschappen op de single cell niveau18,19. Hier, bieden wij gedetailleerde methodologie van deze aanpak waarmee identificatie van unieke fenotypische parameters en bloedlijn bijdragen van pre-Help en ondersteuning tijdens de vroege stadia van embryonale ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>AGM-EC kweekmedia </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialen voor de kweek van endotheelcellen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>Gebruiken voor het dissociëren van AGM-EC monolagen</td></tr><tr><td>Gelatine 0,1% in water</td><td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>Gebruiken om AGM-EC monolagen aan plastic te hechten</td></tr><tr><td>96-wells weefselkweekplaten</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Gebruiken voor co-cultuur van AGM-EC monolagen en index gesorteerd klonen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Fosfaat Gebufferd Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Gebruiken voor dissectie en FACS-kleuring</td></tr><tr><td>500 ml filterflessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>9741202</td><td>Gebruiken om Endotheel media steriel te filteren</td></tr><tr><td>AGM-EC kweekmedia (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Gemodificeerd Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg opgelost in 10 ml media</td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Endotheel Mitogen (ECGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>Voeg 10 ml media toe om op te lossen en toe te voegen</td></tr><tr><td>Materialen voor AGM index sorteren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase (0,25%)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>Gebruiken voor dissociatie van embryonale weefsels</td></tr><tr><td>3 ml spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td>Gebruiken om antilichaam oplossingen voor FACS sterieel te filteren</td></tr><tr><td>0,22 &micro;M spuit-gestuurde filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Gebruiken om antilichaam oplossingen voor FACS sterieel te filteren</td></tr><tr><td>5 ml polystyreen buis met cel-strainer dop</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Gebruiken om celklonten te verwijderen voorafgaand aan FACS</td></tr><tr><td>DAPI (bereid als 1 mg/ml voorraad in H2O)</td><td>Millipore</td><td>268298</td><td>Gebruiken om dode cellen van de sortering uit te sluiten</td></tr><tr><td>anti-muis CD16/CD32 (FcR blok)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Gebruiken om niet-specifieke kleuring naar Fc-receptoren te blokkeren</td></tr><tr><td>Antilichamen voor AGM index sorteren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis CD144 PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>Kleuren</td></tr><tr><td>Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>Isotype controle voor CD144 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>Anti-muis CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td><td>eBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>Kleuren</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>Isotype controle voor CD201 PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>Anti-muis CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>Kleuren</td></tr><tr><td>Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>Isotype controle voor CD41 PE</td></tr><tr><td>Anti-muis CD45 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Kleuren</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>Isotype controle voor CD45 FITC</td></tr><tr><td>AGM-serumvrij media (10ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>recombinant muis stamcel factor (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (100 mg/ml voorraad) Eindconcentratie 100 ng/ml</td></tr><tr><td>recombinant humaan FLT3 Ligand (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (100 mg/ml voorraad) Eindconcentratie 100 ng/ml</td></tr><tr><td>recombinant humaan trombopoietine (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (100 mg/ml voorraad) Eindconcentratie 20 ng/ml</td></tr><tr><td>recombinant muis interleukine-3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (100 mg/ml voorraad) Eindconcentratie 20 ng/ml</td></tr><tr><td>Materialen voor het kleuren van co-gecultiveerde cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plaat, V-bodem</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>Gebruiken voor FACS-analyse</td></tr><tr><td>Antilichamen voor analyse van Index gesorteerd klonen co-gecultiveerd met endotheelcellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis CD45 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>Kleuren</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>Isotype controle voor CD45 PerCP-Cyanine5.5</td></tr><tr><td>Anti-muis CD201 (EPCR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td>Kleuren</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>Isotype controle voor CD201 PE</td></tr><tr><td>Anti-muis Ly-6A/E (Sca-1) APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td>Kleuren</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Isotype controle voor Ly-6A/E APC</td></tr><tr><td>Anti-muis F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>Kleuren</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>Isotype controle voor

klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige index sorteren gecombineerd met endothelial niche co celkweek

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

De mogelijkheid te bestuderen van hematopoietische stamcellen (HSC) genesis tijdens de embryonale ontwikkeling heeft is beperkt door de zeldzaamheid van HSC precursoren in het vroege embryo en het ontbreken van tests waarmee functioneel het lange termijn potentieel van de multilineage engraftment van individuele putatief HSC precursoren. Hier beschrijven we een methodologie waarmee de isolatie en de karakterisering van functioneel gevalideerde HSC precursoren op het niveau van één cel. Ten eerste, wij gebruiken index Sorteren om de precieze fenotypische parameter van elke cel afzonderlijk gesorteerde winkel met behulp van een combinatie van fenotypische markers te verrijken voor HSC precursoren met extra markeringen voor experimentele analyse. Ten tweede, elke index-gesorteerd op cel is mede gekweekte met vasculaire niche stroma uit de aorta-gonaden-mesonephros (AVA) regio, die ondersteunt de rijping van niet-enten HSC voorlopers van functionele HSC met multilineage, op de lange termijn engraftment potentieel in transplantatie testen. Deze methode maakt een correlatie van fenotypische eigenschappen van klonen hemogenic precursoren met hun functionele engraftment potentieel of andere eigenschappen zoals transcriptionele profiel, het verstrekken van een middel voor de gedetailleerde analyse van de voorloper van de HSC ontwikkeling op het niveau van één cel.

Figuur 1A blijkt een schematische voorstelling van de proefopzet. Zodra P-Sp/AGM weefsels zijn ontleed, gebundeld en losgekoppeld in collagenase, zijn ze gekleurd met antilichamen tegen VE-cadherine en EPCR voor het sorteren van de index. Pre-HSC zijn verrijkt met cellen gesorteerd op VE-cadherine+EPCRhoge (figuur 1B). Andere fluorescerende-geconjugeerde antilichamen kunnen worden opgenomen om te analyseren ...

Hier presenteren we methodologie voor de klonale analyse van hematopoietische stamcellen precursoren tijdens lymfkliertest embryonale ontwikkeling. Wij combineren index sortering van afzonderlijke cellen uit de embryonale aorta-gonaden-mesonephros regio met endothelial co celkweek en transplantatie te karakteriseren de fenotypische eigenschappen en het engraftment potentieel van één hematopoietische precursoren.

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Het algemene doel van deze methode is om de fenotypische eigenschappen en aanplantpotentieel van clonale hematopoëtische stamcellen of HSC-voorlopers tijdens de muis-embryonale ontwikkeling te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingshematopoëse over de unieke lijnbijdragen van clonale HSC-voorlopers tijdens de embryonale ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat hemogene voorlopers worden geanalyseerd op het niveau van één cel.Dit maakt het mogelijk om de unieke fenotypische eigenschappen die zeldzame HSC-voorlopers onderscheiden, te identificeren. Begin met het toevoegen van Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, weefsels die zijn verwijderd uit embryo's tussen 9,5 en 11,5 dagen post coitum aan een 15 milliliter conische buis bevattende 10 milliliters PBS aangevuld met 10%FBS op ijs. Wanneer de weefsels op de bodem van de buis zijn bezonken, aspireer de supernatant en voeg onmiddellijk een milliliter van 0,25%collageenase toe aan de monsters.Na 25 minuten in een 37 graden Celsius waterbad, stop de reactie met een milliliter PBS plus FBS en gebruik een milliliter pipettip om de weefsels 20 tot

clonal-analysis-embryonic-hematopoietic-stem-cell-precursors-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

This video describes the protocol for isolating HSPCs from the bone marrow and sorting them using a fluorescent activated cell sorting technique, which is a method to obtain singly-sorted HSPCs. We culture these sorted cells to obtain HSPC clones.

Culturing and Harvesting of HSPC Clones: A Method to Obtain the Singly-Sorted HSPC Clones

RNA-sequencing en bioinformatica analyses werden significant verschillend tot expressie en transcriptiefactoren in Lin-CD34 + en CD34-Lin subpopulaties van muis EMLcells identificeren. Deze transcriptiefactoren kunnen een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de switch tussen zelfvernieuwende Lin-CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerd Lin-CD34-cellen.

Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse

We beschrijven een betrouwbare methode om primaire tumorspecifieke endotheelcellen te isoleren en te kweken van genetisch gemanipuleerde muismodellen.

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van fluorescentie-geactiveerde celsortering van menselijke mesenchymale stamcellen met behulp van de single-cell sorteermethode. In het bijzonder kan het gebruik van eencellige sortering een zuiverheid van 99% van de immunofenogetypeerde cellen uit een heterogene populatie bereiken in combinatie met een op multiparametrische flowcytometrie gebaseerde benadering.

Eencellige sortering van immunofenogetypeerde mesenchymale stamcellen van menselijke geëxfolieerde bladverliezende tanden

Leer klonale analyse van hematopoëtische stamcelprecursoren tijdens embryonale ontwikkeling bij muizen. Deze methode combineert index sorteren met endotheliale co-cultuur om fenotypische eigenschappen en engraftment potentieel te beoordelen.

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek (Video) | JoVE Journal

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

Meer video's verkennen