Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

Het algemene doel van deze methode is om de fenotypische eigenschappen en aanplantpotentieel van clonale hematopoëtische stamcellen of HSC-voorlopers tijdens de muis-embryonale ontwikkeling te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingshematopoëse over de unieke lijnbijdragen van clonale HSC-voorlopers tijdens de embryonale ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat hemogene voorlopers worden geanalyseerd op het niveau van één cel.

Dit maakt het mogelijk om de unieke fenotypische eigenschappen die zeldzame HSC-voorlopers onderscheiden, te identificeren. Begin met het toevoegen van Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, weefsels die zijn verwijderd uit embryo's tussen 9,5 en 11,5 dagen post coitum aan een 15 milliliter conische buis bevattende 10 milliliters PBS aangevuld met 10%FBS op ijs. Wanneer de weefsels op de bodem van de buis zijn bezonken, aspireer de supernatant en voeg onmiddellijk een milliliter van 0,25%collageenase toe aan de monsters.

Na 25 minuten in een 37 graden Celsius waterbad, stop de reactie met een milliliter PBS plus FBS en gebruik een milliliter pipettip om de weefsels 20 tot 30 keer te tritureren tot een enkele cel suspensie is verkregen. Verdun vervolgens de cellen met nog eens acht milliliters PBS plus FBS en verzamel de cellen door centrifugatie. Resuspendeer de pellet in 500 microliters blokkerende buffer gedurende vijf minuten op ijs.

Voeg vervolgens 500 microliters van de cocktail van belangrijke antilichamen toe. Na een incubatie van 15 tot 20 minuten op ijs, was de cellen in acht milliliters PBS plus FBS en resuspendeer de pellet in een milliliter vers PBS plus FBS. Filtreer de cellen door een 35 micrometer celzeef in een vijf milliliter buis, was de zeef met nog eens drie milliliters PBS plus FBS om alle cellen te verzamelen en centrifugeer de cellen opnieuw.

Resuspendeer vervolgens de pellet in 500 microliters PBS plus FBS en plaats de cellen op ijs. Om de poorten voor sortering in enkele cel- en indexsorteringsmodus in te stellen, laad een kleine aliquot van cellen op de flowcytometer en stel de acquisitie in op de laagste stroomsnelheid. Open een voorwaartse verspreidingsgebied versus zijwaarts verspreidingsgebied plot en stel een poort in om cellen van verschillende grootte op te nemen.

Open een voorwaartse verspreidingsgebied versus voorwaartse verspreidingsbreedte plot en een zijwaarts verspreidingsgebied versus zijwaarts verspreidingsbreedte plot en stel een poort in in elk plot om de doubletten uit te sluiten. Stel een voorwaartse verspreidingsgebied versus DAPI plot in om de levende cellen te scheiden. Maak vervolgens een anti-vasculaire endotheel Cadherin versus anti-endotheel eiwit C receptor plot en stel een poort in voor de vasculaire endotheel Cadherin positieve en hoge endotheel eiwit C receptor expresserende cellen.

Om de aorta-gonad-mesonephros cellen te indexsorteren, plaats een 96-well plate voorgecultiveerd met AGM endotheelcellen in AGM serum-vrij medium plus cytokinen in de platenblokken van de flowcytometer en laad het experimentele monster. Begin met de monsteracquisitie en bevestig dat de indexsortering enkele celmodus is geselecteerd om een enkele cel in elke put van de 96-well plate te sorteren. Wanneer één cel in elke put van de plaat is gesorteerd, plaats de plaat in een weefselcultuur incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende maximaal zeven dagen.

Aan het einde van de co-cultuurperiode kunnen hematopoëtische kolonies van verschillende groottes en morfologieën worden gevisualiseerd met behulp van een omgekeerde microscoop met een 100X vergroting. Om de klonen door flowcytometrie te analyseren, gebruik een meerkanaals pipet om de hematopoëtische cellen te dissociëren van de endotheellaag zonder de endotheelcellen los te maken. Breng vervolgens 100 microliters cellen over in afzonderlijke putjes van een nieuwe 96-well v-bodemplaat en breng de originele 96-well plaat met de resterende 100 microliters cellen terug naar de weefselcultuur incubator.

Pellet de cellen in de v-bodemplaat door centrifugatie en verwijder het supernatant door de plaat in een enkele snelle beweging om te draaien en te flikkeren. Resuspendeer de pellets in elk putje met 50 microliters blokkerende buffer bij vier graden Celsius. Voeg na vijf minuten het cocktail van belangrijke antilichamen toe aan elk putje voor een incubatie van 20 minuten bij vier graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, was elk putje met 200 microliters PBS plus FBS, flikker de plaat aan het einde van de centrifugatie om het supernatant weg te gooien. Resuspendeer de pellets in 50 microliters PBS plus FBS en analyseer de cellen volgens standaard flow analyse protocollen om kolonies die hematopoëtisch stamcelpotentieel bevatten te screenen. Selecteer de putjes die cellen met hematopoëtisch stamcelfenotype bevatten door flow analyse, gebruik een meerkanaals pipet om de resterende 100 microliters cellen van de originele co-cultuur te resuspenderen en voeg vijf keer 10 tot de vierde reddingsbeenmergcellen toe in 100 microliters PBS plus 2%FBS aan elk putje.

Na adoptieve overdracht van elke kloon in individuele dodelijk bestraalde congenische ontvangende dieren, verzamel perifeer bloedmonsters van de aangeplante dieren op regelmatige intervallen na de transplantatie. Om de klonen met langetermijnaanplant te identificeren, analyseer de monsters door flowcytometrie volgens standaard flow analyse protocollen. De fenotypische eigenschappen van elke kloon kunnen vervolgens worden gecorreleerd met zijn aanplanteigenschappen.

Pre-hematopoëtische stamcellen kunnen worden verrijkt door vasculaire endotheel Cadherin positiviteit en een hoog niveau van endotheel eiwit C receptor expressie. Kleuring met andere fluorochroom geconjugeerde antilichamen maakt de retrospecieve analyse van aanvullende fenotypische parameters mogelijk die voor elke cel tijdens indexsortering kunnen worden geregistreerd. Na indexsortering in aorta-gonad-mesonephros endotheelcel co-cultures, integreren de individuele klonen in de aorta-gonad-mesonephros endotheelcel laag voordat de klonen beginnen af te ronden en hematopoëtische clusters te vormen.

Na vijf tot zeven dagen co-cultuur, kunnen kolonies van verschillende groottes en morfologieën worden