Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters
23 maart 2018
Een semi-geautomatiseerde workflow wordt gepresenteerd voor gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA van menselijke melk en andersoortige laag-biomassa monster.
Het algemene doel van deze methode is om 16 SRRNA uit moedermelk en andere monsters met een lage biomassa te versterken met behulp van een semi-geautomatiseerd protocol. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over de ontwikkeling en verstoringen van het menselijk microbioom in verband met zowel gezondheid als ziekte. Het grote voordeel van de techniek is dat deze semi-geautomatiseerd is, relatief eenvoudig uit te voeren en aanpasbaar aan meerdere monstertypen, waaronder secretie, wattenstaafjes en ontlasting.
Na het ontdooien en toewijzen van hele melk volgens het tekstprotocol, centrifugeer de monsters 5000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de cellen te pelleren. Gebruik een plastic spatel of grote boring pipettepunt om de bovenste vetlaag te verwijderen. Verwijder vervolgens, zonder de pellet te verstoren, al het supernatant, behalve 100 microliter.
Met één milliliter PBS, resuspendeer en was de pellet. Bereid vervolgens een negatieve controle voor door één milliliter steriel PBS toe te voegen aan een vijf milliliter buis. Breng de suspensie over naar een schone centrifugeerbuis van een punt vijf milliliter en centrifugeer deze bij kamertemperatuur gedurende één minuut bij 5000 keer G.
Gebruik vervolgens een 1000 microliter steriele gefilterde pipettepunt om de hele supernatante vetlaag weg te gooien. Om het monster te verstoren en te homogeniseren, voeg 600 microliter lysisbuffer met bèta mercaptoethanol toe aan de pellet en breng de suspensie over naar een beadbuisje. Bereid een positieve controle voor met lysisbuffer en 20 microliter van het bacteriële mock-monster.
Vortex alle beadbuisjes krachtig gedurende 15 seconden. Verwarm vervolgens de monsters op een temperatuur gecontroleerde vortexer bij 37 graden Celsius en 700 tot 800 RPM gedurende 10 minuten. Laad de buisjes in de geautomatiseerde sample disrupter adaptor set.
Vervolgens bead beat de monsters gedurende één minuut op 30 hertz. Demonteer de adaptor set en schakel deze handmatig over van de linker robotarm naar de rechter robotarm van het instrument. Bead beat de buisjes nog een minuut op 30 hertz en centrifugeer vervolgens de buisjes gedurende drie minuten bij 17.200 keer G en 25 graden Celsius.
Gebruik een 200 microliter pipettepunt om al het supernatant te verwijderen, zorg ervoor dat u geen vetlaag bovenaan of de bead residu aan de onderkant van het monster neemt. Breng het supernatant aan op homogenisator kolommen. Centrifugeer vervolgens de kolommen bij maximale snelheid en 25 graden Celsius gedurende drie minuten.
Breng 350 microliter eluid over naar een twee milliliter fabrikant microcentrifugebuis. Voor het isoleren van DNA volgens het tekstprotocol, snijd de deksels af en maak de randen van de individuele spin kolommen voor DNA en RNA glad. Breng de DNA spin kolom zonder de verzamelbuis in de rotor adapter.
Gooi vervolgens de verzamelbuis weg. Plaats vervolgens de gevortexte twee milliliter buisjes in een shaker, volgens de laadgrafiek van het geautomatiseerde DNA/RNA zuiveringsinstrument volgens de instructies van de fabrikant. Label een punt vijf milliliter verzamelbuisjes en plaats ze in rotor adapters.
Plaats vervolgens de rotor adapters in de centrifuge volgens de laadgrafiek van het geautomatiseerde DNA/RNA zuiveringsinstrument. Nadat u filter tips, RNase-vrij water en de reagentia in de reagensblokken van het instrument hebt geplaatst, sluit u het deksel van het instrument en voert u het aangepaste DNA-zuiveringsprogramma op het instrument uit. Wanneer de reactie voltooid is, verzamel de monsters bevattende buisjes van de shaker en bewaar eventueel overgebleven monsters bij minus 20 graden Celsius voor kortetermijnopslag of minus 80 graden Celsius voor langetermijnopslag.
Nadat u het werkgebied en de PCR master mix hebt voorbereid volgens het tekstprotocol, laadt u 50 tot 100 microliter DNA-monsters in een 32-wel instrument sample adapter, volgens de 96-wel plaat kaart. Voor elke PCR plaat, zet u twee negatieve controles op door 30 microliter PCR water in een schone punt vijf milliliter verzamelbuis te pipetten. Plaats vervolgens alle monsters op de 32-wel instrument sample adapter met de doppen vergrendeld in de open positie.
Verwijder op de reagent adapter van het instrument één voor één de dop van elke reverse primer met specifieke streepjescodenummers. Om de robotische vloeistofhandler te laden, plaatst u de reagent adapter op positie B1. Om een randeffect te voorkomen, plaatst u één rand van de adapter voorzichtig tegen de grijpzijden en brengt u de andere rand langzaam naar beneden. Zorg ervoor dat u op alle hoeken van de adapters drukt.
Plaats de sample adapter op positie C1, zorg ervoor dat u op alle hoeken van de adapters drukt. Vorm vervolgens het vijf milliliter master mix. Open de dop en plaats het op positie A op de master mix en reagent blok van het instrument.
Plaats de PCR plaat op de 96-wel instrument adapter die bedoeld is voor halfrokerige PCR plaatjes. Start vervolgens de run en sla het op als een nieuw bestand. Wanneer de run voltooid is, controleert u of er geen fouten zijn.
Gebruik vervolgens 12 of acht strip doppen om de plaat te verzegelen. Vorm krachtig en gebruik een 96-wel plaat spinner om de plaat één minuut te centrifugeren. Plaats ten slotte de plaat op ijs totdat deze naar de post amplificatieruimte wordt verplaatst en op de thermische cycler wordt geladen.
Na PCR amplificatie, voer kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding uit volgens het tekstprotocol. De eerste QC-stap van het protocol volgt de PCR amplificatie van de 16SV4 regio. Zoals hier getoond, werd één microliter PCR product van elk monster geanalyseerd door middel van elektroforese om te bevestigen dat het binnen het verwachte bereik van 350 tot 450 basenparen viel.
Sommige moedermelk monsters produceerden lagere hoeveelheden specifiek product, wat suggereert dat er ofwel lage niveaus van geëxtraheerd microbieel DNA in die monsters zijn of dat er PCR remmers zijn overgedragen tijdens de extractie. Kwantificering van specifiek product voor elk monster was essentieel om het vereiste volume te bepalen voor gelijke molaire pooling van monsters voor sequencing. Een gepoolde bibliotheek voor gerichte sequencing wordt meestal gedomineerd door een specifiek PCR product.
Als er een significant
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een semi-geautomatiseerde workflow voor de gerichte sequencing van 16S rRNA uit menselijke melk en andere monster-types met een lage biomassa. De methode is erop gericht het begrip van de ontwikkeling van het menselijke microbioom en de implicaties hiervan voor gezondheid en ziekte te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Genomics
- Menselijke gezondheid
Achtergrond
- Moedermelk is een monster met een lage biomassa, wat uitdagingen met zich meebrengt voor microbiomanalyse.
- Het begrijpen van het microbioom is essentieel voor inzichten in gezondheid en ziekte.
- Huidige methoden voor het sequencen van monsters met een lage biomassa kunnen arbeidsintensief zijn.
- Een semi-geautomatiseerde aanpak kan het proces stroomlijnen en de efficiëntie verbeteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het amplificeren van 16S rRNA uit monsters met een lage biomassa.
- Het faciliteren van onderzoek naar het menselijke microbioom.
- Het leveren van een protocol dat aanpasbaar is aan verschillende monstertypen.
Gebruikte methoden
- Het ontdooien en aliquoteren van monsters van volle melk.
- Centrifugatie bij 5000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijderen van de bovenste vetlaag met een spatel of pipetpunt.
- Voorzichtig verwijderen van het supernatant, waarbij een klein volume wordt behouden voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- De semi-geautomatiseerde workflow amplificeert 16S rRNA effectief.
- De methode is aanpasbaar aan verschillende typen monsters met een lage biomassa.
- Het vereenvoudigt het proces van microbioma-analyse.
- Potentiële toepassingen in onderzoek naar gezondheid en ziekte worden belicht.
Conclusies
- De semi-geautomatiseerde methode is een waardevol instrument voor microbiome-onderzoek.
- Het pakt de uitdagingen aan die gepaard gaan met monsters met een lage biomassa.
- Toekomstige studies kunnen deze methode benutten om de menselijke gezondheid te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode pakt een kritiek knelpunt in microbiomeonderzoek aan: de betrouwbare analyse van monsters met een lage biomassa, zoals menselijke melk, waarbij contaminant DNA de werkelijke biologische signalen kan maskeren. Door de integratie van contaminatiecontroles en semi-geautomatiseerde workflows wordt de reproduceerbaarheid van gegevens verbeterd en het aantal fout-positieve resultaten bij vroege targetvalidatie verminderd. Dit ondersteunt een betrouwbaardere mechanistische risicoanalyse bij het koppelen van microbiële taxa aan de gezondheid van de gastheer of ziektepaden in preklinische ontdekking.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door contaminatie-gecontroleerde microbiële profielen te leveren uit humane monsters met een lage biomassa.
- Operationele waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door gestandaardiseerde lysis-, extractie- en amplificatiestappen met ingebouwde positieve en negatieve controles.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door kwantificeerbare, groottebevestigde 16S V4-amplicons te leveren die geschikt zijn voor equimolaire pooling.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays via semi-geautomatiseerde bead beating, purificatie en PCR-opzet op robotplatforms.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de afstemming van translationele biomarkers door consistente profilering van microbiële gemeenschappen over verschillende monstertypen (bijv. melk, swabs, ontlasting) mogelijk te maken voor longitudinale of cross-sectionele studies.
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door sequencing-klare bibliotheken te genereren met minimale batch-effecten, zoals aangetoond door de stabiele prestaties van een mock-community.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van monsterinname tot genetische analyse, wat cultuuronafhankelijke microbiële profilering mogelijk maakt die bijdraagt aan de selectie van doelwitten en de verduidelijking van pathways in studies naar gastheer-microbe interacties.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van pathways door het genereren van taxonomische data met een hoge diversiteit uit menselijke melk, een model voor gastheer-geassocieerde mucosale microbiomen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via QC-bevestigde amplicon-opbrengsten (350–450 bp) en inhibitor-resistente extractie, wat een betrouwbare library-preparatie voor sequencing mogelijk maakt.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (bijv. amplicon-concentratie, sequencing read counts) die vergelijking tussen experimentele condities en controles mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt discovery met preklinische continuïteit door reproduceerbare microbiële profilering mogelijk te maken in menselijke secreties met een lage biomassa, relevant voor studies naar mucosale immuniteit en metabole gezondheid.
- Enterprise Reuse: Ontworpen als een herbruikbare capaciteit voor verschillende monstertypen (swabs, feces, bevroren neat) en aanpasbaar aan variërende throughput-behoeften via semi-geautomatiseerde instrumentatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door het verminderen van fout-positieven als gevolg van reagens- of omgevingscontaminatie in workflows met een lage biomassa.
- Operationele waarde: Standaardisatie en schaalbaarheid via semi-geautomatiseerde stappen en gedefinieerde controlestrategieën die toepasbaar zijn over verschillende locaties en projecten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het minimaliseren van biologische ruis bij targetscreening in relatie tot het microbioom, waardoor falen bij de-risking in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door betrouwbare microbiële gegevens die de kwalificatie van biomarkers en de selectie van verbindingen op basis van het mechanisme ondersteunen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie, aseptische technieken en het beheer van PCR-workflows om contaminatiecontrole te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot geautomatiseerde monstercellyse-apparatuur, magnetische scheidingsinstrumenten en thermocyclers met programmeerbare vloeistofbehandeling voor semi-geautomatiseerde uitvoering.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor het volgen van reagentia-lots, omgevingsmonitoring en de inclusie van controlemonsters om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan monstertypes (bijv. viskeuze secreties versus swabs), terwijl consistente lysis- en bead-beating-parameters worden gehandhaafd.
- Praktische beperking: monsters met een lage biomassa kunnen nog steeds variabele opbrengsten vertonen, wat normalisatie op basis van kwaliteitscontrole vereist vóór het poolen, zoals vermeld in het protocol.
