Name: Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Leer een semi-geautomatiseerde methode voor 16S rRNA-sequencing van menselijke melk en andere low-biomass monsters. Dit protocol vereenvoudigt microbioomanalyse en ondersteunt onderzoek naar gezondheid en ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Helty Adisetiyo, PhD en Shangxin Yang, PhD voor de ontwikkeling van het protocol. Algemene steun voor de internationale moeders Pediatric Adolescent AIDS klinische proeven groep (IMPAACT) werd verzorgd door de nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health (NIH) onder de nummers van de Award UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) en UM1AI106716 (IMPAACT LC), met medefinanciering uit de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling (NICHD) en het National Institute of Mental Health (NIMH). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH.

Goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) gedragen moet worden voor alle stappen van het protocol, en strenge verontreiniging preventie benaderingen dienen te worden genomen. Stroom van het werk van pre amplificatie werkplaatsen aan na versterking werkgebieden te minimaliseren van verontreiniging van monsters te observeren. Alle leveringen gebruikt zijn steriel, gratis RNase, DNase en DNA pyrogeen. Alle Pipetteer tips worden gefilterd. Een stroomdiagram van de stappen van het protocol wordt verstrekt (Figuur 1).
1. steekproef Lysis
Opmerking: De lysis van de steekproef en extractie van de nucleïnezuur worden uitgevoerd met behulp van een DNA/RNA extractie kit in een schone kamer omgeving waar zowel de engineering en de procedurele controles plaats om te minimaliseren van de invoering van milieu bacteriën in de monsters worden.
<ol><li>
Gebied van werkvoorbereiding
	<ol>
<li>Het kabinet van de bioveiligheid (BSC) werken schoon gebied met passende oppervlak cleaner te elimineren elke besmetting van de nucleïnezuur.</li>
		<li>Inschakelen van de temperatuurregeling vortexer, en zet deze op 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Guanidinium kaliumthiocyanaat lysis-buffermengsel bereiden (zie tabel van materialen)
	<ol>
<li>Controleer de lysis-buffermengsel voor precipitaten. Opnieuw los precipitaten door opwarming van de aarde bij 37 ° C.</li>
		<li>600 µL van lysis buffer met 6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) voorbereiden op elk monster. Overwegen een extra 20% volume per monster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de monsters
	<ol>
<li>Als volle melk is bevroren, ontdooien het op ijs. Geheel aliquoot 5 mL melk in een 15-mL of een 5-mL steriele buis in de BSC en bewaar deze op ijs.</li>
		<li>Draai de 5 mL melk aliquoot gedurende 10 minuten bij 5.000 x g bij 4 ° C tot pellet cellen.</li>
		<li>Verwijder de vetlaag, nu de bovenste laag in de buis, met een plastic spatel of grote boring pipette uiteinde.</li>
		<li>Verwijderen zonder de pellet te verstoren, alle het supernatant met uitzondering van 100 µL.</li>
		<li>De pellet wassen door resuspending in 1 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
		<li>Bereiden 1 negatieve controle door toevoeging van 1 mL steriel PBS tot een 5-mL koker.</li>
		<li>Spoel de suspensie tot een schone 1.5-mL centrifugebuis, en draaien in een microcentrifuge voor 1 min (5000 x g bij kamertemperatuur (RT)).</li>
		<li>Gebruik een 1.000 µL steriele gefilterde pipette uiteinde te ontdoen van de volledige laag van de bovendrijvende substantie/vetzuren.</li>
		<li>Als niet uitpakken van dezelfde dag, breek bevriezen de cel pellet door de gegevens in een ethanol/droog ijs drijfmest, en onmiddellijk over te brengen naar de vriezer-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verstoring van de steekproef en homogenisering (Parel-pak slaag)
	<ol>
<li>Voeg 600 µL van lysis buffer met β-ME naar de pellet, en spoel de suspensie tot een koker kraal.</li>
		<li>Elke batch van de extractie van 12 bevat 10 monsters, 1 negatieve controle (bereid in stap 3.7 hierboven) en 1 positieve controle (bereid in de volgende stap).<ol>
<li>1 positieve controle met lysis-buffermengsel en 20 µL van het bacteriële mock monster (de mock Gemeenschap gebruikt heeft een concentratie, eenmaal uitgepakt, van ongeveer 0,2 ng/µL van DNA) voor te bereiden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex alle bead buizen krachtig gedurende 15 s.</li>
		<li>De monsters van de warmte op de temperatuurgevoelig vortexer bij 37 ° C gedurende 10 min, met schudden bij 700-800 rpm.</li>
		<li>Buizen in de geautomatiseerde monster disruptor adapter set laden.</li>
		<li>Kraal verslaan voor 1 min bij 30 Hz.</li>
		<li>Demonteren van de adapter set en handmatig schakelen de adapter instellen met de monster-platen van de linker robotarm tot de rechts robotarm van het instrument.</li>
		<li>Kraal beat voor een andere 1 min bij 30 Hz.</li>
		<li>Centrifuge buizen bij 17,200 x-g, gedurende 3 min bij 25 ° C.</li>
		<li>Alle van het supernatans dat 200 µL Pipetteer voorzichtig niet om om het even welk van de vette laag aan de bovenkant van het monster of de kraal residuele aan de onderkant van het monster, en toepassen van een homogenizer kolom verwijderen.</li>
		<li>Centrifuge homogenizer kolommen ter maximum-vaart, 17,200 x-g, voor 3 min bij 25 ° C.</li>
		<li>350 µL van het eluaat overbrengen van de fabrikant van een 2-mL microcentrifuge buis voor gebruik met de geautomatiseerde instrument voor zuivering van DNA en RNA (gebruik niet een andere buis). Wees voorzichtig niet over te dragen van eventuele resterende vette laag.</li>
		<li>Als het volume doorstroming minder dan 350 µL is, lysis-buffermengsel met β-ME aan een eindvolume van 350 µL toevoegen.</li>
		<li>Laten de monsters op RT voor maximaal 2 uur voordat u verdergaat nucleïnezuur isolatie met behulp van de geautomatiseerde DNA zuivering instrument of bevriezen bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Schoonmaak werkgebied
	<ol>
<li>Schoon alle oppervlakken in gebruik met een oplossing van de niet-enzymatische decontaminatie, laat gedurende 10 minuten, dan spuiten met 70% ethanol en veeg beneden het oppervlak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA/RNA isoleren
<ol><li>
Gebied van werkvoorbereiding
	<ol>
<li>Zet de warmte blok en de temperatuur instellen tot 70 ° C.</li>
		<li>Zet de vortexer temperatuurgevoelig en selecteer de temperatuur tot 37 ° C.</li>
		<li>Opwarmen van de elutie buffer (EB) met 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, in een tube van 50 mL tot 70 ° C.</li>
		<li>Opwarmen van 350 µL van bevroren monster lysates in de buizen 2 mL bij 37 ° C tot volledig ontdooid zonder een eventueel neerslag (ongeveer 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA zuivering
	<ol>
<li>Vortex en centrifuge de 2-mL buisjes met proeven van kort (3000 x g voor 10 s).</li>
		<li>2 mL buizen in de shaker geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek, per de instructies van de fabrikant na invoegen.</li>
		<li>Krijgen van de rotor-adapters en hen ingesteld op de lade op basis van het aantal monsters.</li>
		<li>Label elke adapter van de rotor op basis van het monster de identificatie (ID).</li>
		<li>Afgesneden de deksels en de randen van individuele spin kolommen vloeiend voor DNA en RNA.</li>
		<li>Voeg de DNA spin kolom zonder de collectie buis in de rotor-adapter. Gooi de collectie buis.</li>
		<li>Label 1,5 mL collectie buizen en rotor adapters invoegen.</li>
		<li>Rotor adapters in de centrifuge na geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek instellen</li>
		<li>Invoegen van fabrikant 1.000 µL filter-tips in tip racks.</li>
		<li>RNase-vrij water aan van de fabrikant van een 2-mL microcentrifuge buis op basis van het aantal monsters (per specifieke machineinstructies protocol) toevoegen.</li>
		<li>Plaats de buis in buis sleuf "A" van microcentrifuge buis "slots".</li>
		<li>Gooi een reagens dat in reagens flessen en vul met een minimaal volume van 10 mL overblijft.</li>
		<li>Reagens flessen invoegen in het reagens Flessenrek (behalve EB fles).</li>
		<li>Warme EB uit een tube van 50 mL toevoegen aan het reagens fles standpunt 6.</li>
		<li>Selectievakje 1,5 mL tubes zijn strak in de rotor adapters geplaatst.</li>
		<li>Sluit het instrument deksel en selecteer: "RNA" → "Extractie kit" → "Dier, weefsels en cellen" → "kit's naam 350 µL deel A Custom DNA" → bewerken Elution Volume 100 µL (standaard) of 50 µL voor lage biomassa monsters → 'Start'.</li>
		<li>Als alles klaar is, verwijder rotor adapters uit de centrifuge en plaats ze in de lade legt.</li>
		<li>Gooi de DNA spin kolom vanaf rotor adapter positie 3.</li>
		<li>Gooi niet rotor adapters, RNA is in positie 2.</li>
		<li>Verwijderen 1,5 mL collectie buizen met geëlueerd DNA op positie 3 en sla op −20 ° c bedragen.</li>
		<li>Verzamelen van monster-bevattende buizen van de shaker en winkel in −20 ° C, als een monster, anders negeren overblijft.</li>
		<li>Ga verder met het protocol "kit's naam 350 µL deel B RNA" voor verdere zuivering van RNA.</li>
		<li>RNA zuivering zal gebeuren van de ongeveer 350 µL doorstroomtest thats in de middelste positie van de rotor-adapters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA zuivering
	<ol>
<li>Voeg de RNA spin kolom zonder collectie buis en deksel in de rotor-adapter.</li>
		<li>Label nieuwe 1,5 mL collectie buizen en voegt u deze in de rotor adapter zoals aangegeven in de handleiding.</li>
		<li>Zet de rotor adapters in de centrifuge na geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument laden grafiek.</li>
		<li>Sluit het instrument deksel en selecteer: "RNA" → "Fabrikant Kit" → "Dier, weefsels en cellen" → "Standaard deel B RNA" → "Start."</li>
		<li>Wanneer voltooid, verwijder rotor adapters uit de centrifuge en plaats ze in de lade legt.</li>
		<li>Gooi RNA spin kolom in positie 3.</li>
		<li>1,5 mL collectie buizen met 30 µL geëlueerd RNA op positie 3 te verwijderen en opslaan bij −80 ° C.</li>
		<li>Verwijder reagens flessen.</li>
		<li>Rotor adapter inhoud via kanalen van de passende gevaarlijk afval afvoeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Schone werkplek
	<ol>
<li>Spray alle geautomatiseerde DNA/RNA zuivering van het instrument accessoires, zoals reagens rekken, lade en elke andere ondergrond in gebruiken met een niet-enzymatische decontaminatie-oplossing, laat gedurende 10 minuten en spoel af met gedeïoniseerd water (DI) en laat ze drogen.</li>
		<li>Spray de geautomatiseerde instrument met alleen fabrikant goedgekeurde niet-enzymatische decontaminatie oplossing, veeg de binnenkant van de centrifuge samen met alle oppervlakken in gebruik, laat gedurende 10 minuten en vervolgens veeg met 70% ethanol. Gebruik geen andere soorten decontaminatie oplossingen als ze schade aan het instrument veroorzaken kunnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gerichte 16S PCR Set-up
Opmerking: De set-up voor de 16S-PCR wordt uitgevoerd in een aangewezen pre amplificatie werkruimte gelegen binnen de schoon-kamer. De reagentia en monsters worden voorbereid en vervolgens geladen op een vloeibare handler voor het uitvoeren van PCR voor elk monster in drievoud (30 monsters, waaronder waar monsters en extractie positieve en negatieve controles, plus 2 PCR van het water controles in drievoud, voor een totaal van 96 gecombineerde monsters en besturingselementen). Zodra de PCR reacties worden geassembleerd en verzegeld, wordt de plaat van het monster overgebracht naar een thermische cycler gelegen in een gebied na versterking voor fietsen.
<ol><li>
Gebied van werkvoorbereiding
	<ol>
<li>Reinig het PCR-werkstation. Spray die alle oppervlakken in gebruik met een DNA RNase, DNase, decontaminant, gevolgd door DI water twee keer, en ten slotte 70% ethanol.</li>
		<li>Het 16S PCR werkblad voorbereiden (Zie gerichte 16S PCR werkblad) met een nauwkeurige monster lijst en toewijzen verschillende barcoded inleidingen op elk monster9. Afdrukken van het werkblad en de kaarten van de plaat (zie plaat 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR master mix voorbereiding Opmerking: 16S primer selectie is gebaseerd op de regio van belang voor de bijzondere studie, en kan veranderen door het type studie of monster. Daarom voor het bestellen van inleidingen, is het belangrijk om te bevestigen wat ruimte van het 16S rRNA beste versterkt de microben van belang voor de bijzondere studie. Dit protocol zoals geschreven is voor versterking van het 16S V4 regio. Als er verschillende inleidingen/regio zijn geselecteerd, kan dan de onthardende temperatuur in de temperatuurcycli aanpassing vereist.<ol>
<li>Werken in het PCR-werkstation te bereiden alles.</li>
		<li>Neem 50-100 µL van DNA-monsters van-20 ° C, en alle van de reagentia die nodig zijn, en hen in de ijskast ontdooien. Vortex en kort draaien naar beneden.</li>
		<li>De inleidingen zijn vooraf verdund tot de concentratie van de werken van 5 µM in een minimale hoeveelheid 20 µL.</li>
		<li>Voorbereiding van de master mix van PCR in de specifieke 5 mL tube met alleen de voorwaartse primer volgens de berekening op het werkblad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiden van de robotic vloeibare handler op geautomatiseerde PCR setup
	<ol>
<li>Bij monsters moet nemen van het instrument van een 32-well monster adapter en laden 50-100 µL van DNA-monsters volgens de 96-wells-plaat kaart volgens de instructies van de fabrikant.<ol>
<li>Voor elke PCR plaat, instellen 2 negatieve controles door het plaatsen van 30 µL van het PCR water in een schone monsterbuisje.</li>
			<li>Plaats alle monsters op het 32-well instrument steekproef adapter met doppen vergrendeld in open positie.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor de omgekeerde inleidingen9<ol>
<li>Verwijder de dop van elke omgekeerde primer met specifieke barcode # 's één tegelijk (verandering handschoenen tussen Kruis-om verontreiniging te voorkomen).</li>
			<li>Plaats een maximum van 32 inleidingen op het instrument reagens adapter.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Neem een plaat van de PCR 96-Wells en geef deze het label met de naam van de studie, monster nummer, datum, en de technicus de initialen.</li>
		<li>Laden van de robot vloeibare handler<ol>
<li>Plaats de adapter reagens in positie B1. Ter vermijding van een randeffect, zorgvuldig plaats een van de randen van de adapter tegen de zijkant van de handgreep en breng de andere rand langzaam naar beneden. Zorg ervoor dat druk op alle hoeken van de adapters.</li>
			<li>Plaats de adapter van de steekproef in positie C1. Zorg ervoor dat druk op alle hoeken van de adapters.</li>
			<li>Vortex de master mix van 5 mL, open het GLB, en plaats het in positie A op de master mix en reagens blok van het instrument.</li>
			<li>Plaats de PCR-plaat op de adapter van de 96-Wells-instrument dat bedoeld is om te houden van half skirted PCR platen.</li>
			<li>De run start en opslaan als een nieuw bestand.</li>
			<li>Volg de aanwijzingen en check Markeer elke prompt: één, tips zijn beschikbaar, twee, afgewerkte doos is beschikbaar, en drie, beginnen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nadat de run voltooid is, controleert u of er geen fouten zijn door het controleren van de machine voor foutberichten.</li>
		<li>Afdichting van de plaat met de 12 of 8 strip caps, vortex krachtig, en spin down voor 1 min met behulp van een 96-wells-plaat spinner en plaats deze op het ijs of in de koelkast.</li>
		<li>Verwijderen van buizen met omgekeerde inleidingen en monsters.</li>
		<li>Neem de 96-wells-plaat naar de kamer na versterking en laden van de plaat op de thermische cycler en de cyclus volgens de tabel van thermisch-Fiet & Mountainbike voorwaarden (Zie tabel 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gerichte 16S Post-PCR kwaliteitscontrole met behulp van Tape-gebaseerd Platform voor de Elektroforese van het Gel
Opmerking: Post-PCR kwaliteitscontrole (QC) en alle volgende stappen worden uitgevoerd in een daarvoor aangewezen gedeelte van de post versterking van het lab. Het DNA wordt geanalyseerd in een geautomatiseerde DNA/RNA fragment analyzer.
<ol><li>
Gebied van werkvoorbereiding
	<ol>
<li>Reinig het werkstation door spuiten die alle oppervlakken in gebruik met een RNase, DNase, DNA decontaminant, gevolgd door DI water twee keer, en ten slotte 70% ethanol.</li>
		<li>Verzamel alle benodigdheden en apparatuur die nodig is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiden van reagentia
	<ol>
<li>Plaats monster buffer en ladder in de vortexer temperatuurgevoelig bij 25 ° C gedurende ten minste 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Terwijl de reagentia zijn warming-up, PCR monsters te bereiden door het bundelen van de 3 PCR wordt gerepliceerd voor elk monster in een enkele buis</li>
	<li>Monsters op instrument laden.</li>
	<li>Kort vortex en spin down buizen met gebundelde PCR product.</li>
	<li>Plaats van het instrument 96-wells-plaat op een rek op RT en geef deze het label.</li>
	<li>Kort vortex en spin down de monster buffer en ladder.</li>
	<li>Voeg 3 µL monster buffer toe aan elk putje van de 96 goed plaat (behoefte ten minste 53 µL/scherm tape).</li>
	<li>Uitvoeren van een even aantal monsters; Als er oneven aantal monsters, Voeg 4 µL van monster buffer aan een lege putje.</li>
	<li>Voeg 1 µL van ladder naar een ladder ook.</li>
	<li>Na de kaart, 1 µL van gebundelde PCR product toevoegen aan haar aangewezen goed.</li>
	<li>Afdekplaat met folie afdichting</li>
	<li>Vortex de plaat met behulp van de vortexer en de adapter van het instrument op 2.000 rpm voor 1 min.</li>
	<li>Spin opnieuw naar positie het monster aan de onderkant van de buis, als er bubbels spin naar beneden.</li>
	<li>Start de software.</li>
	<li>De scherminfo tape en laden in het instrument laden.</li>
	<li>Monsters in de fragment-analyzer met een 96-Wells-adapter te laden.</li>
	<li>Instellen van een run met de controller-software.</li>
	<li>Zorg ervoor dat u zelfs genummerde wells.</li>
	<li>Schrijven monster IDs.</li>
	<li>Controleer dat alle putjes van de cassette scherm grijs zijn gemarkeerd.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de analyzer herkent alle uiteinden van de pipet.</li>
	<li>Selecteer start en geef een bestandsnaam als de resultaten (studie naam, monster getallen en datum) wilt opslaan.</li>
	<li>Verwijzen naar de instructies van de fabrikant voor meer informatie.</li>
	<li>Na de run voltooid is, gooi tip, scherm tape en buizen.</li>
	<li>Analyseren van gegevens voor 16S piek nM (tussen 315-450 bp voor V4). Deze piek hangt af van de inleidingen geselecteerd.</li>
</ol>5. bibliotheek berekening, bundeling, Clean-up, en QC
<ol><li>Na het bepalen van de grootte van de amplicon en molarity van alle monsters, bundelen de bibliotheken om de gewenste eindvolume en nM voor de gepoolde bibliotheek te bereiken (zie voorbeeld berekening).</li>
	<li>Sanering en concentraat de gepoolde bibliotheek met behulp van een zuivering silica membraan-gebaseerde kit voor PCR producten, volgens de fabrikant protocol (Zie Tabel van materialen).<ol>
<li>Elueer het DNA met een eindvolume van 50 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meten van de concentratie van de schoongemaakte bibliotheek onmiddellijk met behulp van een dubbele gestrande DNA hoge gevoeligheid kit voor een Fluorimeter, volgens protocol van de fabrikant.<ol>
<li>Verdun 2 µL van de gebundelde en gereinigd bibliotheek met 198 µL van de verdunning buffer plus kleurstof (1:100 verdunning).</li>
		<li>De gemeten waarde van het fluorimetrische apparaat opnemen en zet het volgens de verdunningsfactor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van de concentratie (ng/µL) lezen voor de gepoolde bibliotheek, berekenen de bibliotheek molarity in nM. 1 µL onverdund bibliotheek gebruiken voor het meten van de OD260/280 op een microvolume spectrofotometer. Opmerking: De waarde van 1.8-2.0 geeft voldoende zuiverheid van de bibliotheek.</li>
	<li>Bewaren de definitieve bibliotheek bij-20 ° C tot klaar voor de volgende generatie sequencing.</li>
</ol>

<ol><li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental%2C+tongue%2C+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2(2017).</li>
<li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990(2016).</li>
<li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects%3A+Tools%2C+techniques%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li>
<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+human+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52(2017).</li>
<li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing%3A+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561(2017).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li>
<li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatr+Scand%22%5BJournal%5D)">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li>
<li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li>
<li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li>
<li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Lact%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li>
<li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li>
<li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+DNA%2FRNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588(2016).</li>
<li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100(2016).</li>
<li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li>
<li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29(2016).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87(2014).</li>
<li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26(2015).</li>
<li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24(2016).</li>
<li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564(2014).</li>
<li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+human+lower+airways%3A+a+next+generation+sequencing+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organ+J%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23(2015).</li>
<li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li>
<li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487(2014).</li>
<li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19(2015).</li>
<li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li>
<li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73(2016).</li>
<li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Genetics+and+Gut+Microbiome%3A+Challenges+and+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li>
<li>ATCC. Mock microbial communities. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gerichte volgende-generatie sequentiebepaling van het 16S rRNA is een veel gebruikte, snelle techniek voor microbiome karakterisering18. Echter kunnen vele factoren, met inbegrip van de effecten van de batch, milieuverontreiniging, monster kruisbesmetting, gevoeligheid en reproduceerbaarheid negatief beïnvloeden van experimentele resultaten en beschamen hun interpretatie7,19 , 20. om beste robuuste 16S an...

De microbiële gemeenschappen die mens koloniseren worden verondersteld te zijn kritisch belangrijk voor menselijke gezondheid en ziekte beïnvloeden metabolisme, immuunsysteem ontwikkeling, gevoeligheid voor ziekte en reacties op vaccinatie en drug therapie1, 2. inspanningen om te begrijpen van de invloed van de microbiota op de menselijke gezondheid op dit moment benadrukken de identificatie van microben gekoppeld omschreven anatomische compartimenten (d.w.z.huid, darmen, oral, etc.), evenals gelokaliseerde sites binnen Deze compartimenten3,4. Grondslag van deze investigative inspanningen is het snelle ontstaan en de grotere toegankelijkheid van volgende-generatie sequencing (NGS) technologieën die een massaal parallelle platform te voor analyse van de microbiële genetische inhoud (microbiome) van een steekproef bieden. Voor veel fysiologische monsters, de bijbehorende microbiome is zowel complexe en overvloedige (d.w.z., ontlasting), maar voor sommige monsters, het microbiome wordt vertegenwoordigd door lage microbiële biomassa (dat wil zeggenmenselijke melk, lagere luchtwegen) waar gevoeligheid, experimentele artefacten en mogelijke verontreiniging worden belangrijke kwesties. De gemeenschappelijke uitdagingen van microbiome studies en passende proefopzet hebben het voorwerp geweest van meerdere review artikelen5,6,7,8.
Hierin gepresenteerd is een robuuste NGS experimentele pijpleiding gebaseerd op gerichte sequentiebepaling van het rRNA 16S V4 regio9 te karakteriseren van de microbiome van menselijke melk. Microbiome analyse van menselijke melk is ingewikkeld, niet alleen door een inherent lage microbiële biomassa10, maar bovendien door hoge niveaus van menselijk DNA achtergrond11,12,13,14 en potentiële overdracht van PCR remmers15,16 in de uitgepakte nucleïnezuur. Dit protocol is afhankelijk van verkrijgbare extractie kits en semi-geautomatiseerde platformen die kunnen helpen bij het minimaliseren van de variabiliteit in de sample voorbereiding batches. Het bevat een welomschreven bacteriële mock Gemeenschap dat naast de monsters wordt verwerkt als een kwaliteitscontrole te valideren van elke stap in het protocol en het bieden van een onafhankelijke metric van de robuustheid van de pijpleiding. Hoewel het protocol als beschreven specifiek voor de menselijke melkmonsters is, het is gemakkelijk aan te passen aan andere steekproef vormen, met inbegrip van de ontlasting, rectaal, vaginale, huid, areolar en mondelinge swabs10,17, en kan dienen als uitgangspunt voor onderzoekers die willen microbiome analyses uitvoeren.

```html
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>AllPrep RNA/DNA Mini Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>80204</td>
 <td>DNA/RNA extractiekit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eliminase</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>435532</td>
 <td>RNase, DNase, DNA decontaminant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermo Mixer</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td></td>
 <td>temperatuurgestuurde vortexer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Buffer RLT plus</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>1053393</td>
 <td>guanidiniumthiocyanaat lyse buffer/ Onderdeel van Allprep kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&szlig;-Mercaptoethanol</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>63689-25ML-F</td>
 <td>&szlig;-ME is een reducerend middel dat RNases onomkeerbaar denatureert door disulfidebindingen te verminderen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LME Beads</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>116914050</td>
 <td>kralenbuisje</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAgen TissueLyzer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>85300</td>
 <td>geautomatiseerde set voor monsterverstoreradapter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAshredder kolom</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79654</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAgen RB buis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>microcentrifugebuis van de fabrikant in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAcube en gerelateerde plasticwaren</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001292</td>
 <td>geautomatiseerd instrument voor DNA/RNA-zuivering</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA exitus plus</td>
 <td>Applichem</td>
 <td>A7089</td>
 <td>niet-enzymatische decontaminatieoplossing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EB Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19086</td>
 <td>elutiebuffer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAgility en gerelateerde plasticwaren</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001532</td>
 <td>robotische vloeistofhandelaar</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR water</td>
 <td>MO BIO</td>
 <td>17000-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5PRIME HotMasterMix</td>
 <td>Quantabio</td>
 <td>2200400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barcoded reverse primers</td>
 <td>Eurofin</td>
 <td>Geen catalogusnummers</td>
 <td>ontworpen en besteld</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well PCR plate</td>
 <td>USA scientific</td>
 <td>1402-9708</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tapestation 2200 en gerelateerde plasticwaren</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>G2964AA</td>
 <td>geautomatiseerde DNA/RNA-fragmentanalyzer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D1000 reagents voor Tapestation</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>5067-5585</td>
 <td>Staalbuffer en ladder maken deel uit van deze kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>OneStep PCR Inhibitor Removal Kit</td>
 <td>Zymo Research</td>
 <td>50444470</td>
 <td>Verwijdering van PCR-remmers gebeurt volgens de instructies van de fabrikant.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104</td>
 <td>DNA opruimingskit: silica-membraangebaseerde zuivering van PCR-producten</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>Q32854</td>
 <td>dimethylsulfoxide-gebaseerde verdunningsbuffer en kleurstof maken deel uit van deze kit.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qubit Fluorometer</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>Q33216</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NanoDrop</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td></td>
 <td>microvolume spectrofotometer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MiSeq 300 V2 kit</td>
 <td>Illumina</td>
 <td>15033624/15033626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MiSeq</td>
 <td>Illumina</td>
 <td>Geen catalogusnummers</td>
 <td>next generation sequencer</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
```

een methode voor gerichte 16s sequentiebepaling van menselijke melkmonsters

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Studies van microbiële gemeenschappen geworden wijdverbreide met de ontwikkeling van relatief goedkope, snelle en hoge doorvoer sequencing. Echter, zoals met al deze technologieën, reproduceerbare resultaten hangen af van een laboratorium-werkstroom waarin passende voorzorgsmaatregelen en over besturingselementen. Dit is vooral belangrijk met lage-biomassa monsters waar besmetting van bacteriële DNA kan misleidende resultaten genereren. In dit artikel een overzicht van een semi-geautomatiseerde workflow voor het identificeren van de microben van menselijke borst melkmonsters met behulp van gerichte sequentiebepaling van het 16S ribosomaal RNA (rRNA) V4 regio op een schaal voor de lage en Midden throughput. Het protocol beschrijft de bereiding van de monsters van volle melk inclusief: proeven van lysis, nucleic zuur extractie, versterking van de V4-regio van het 16S rRNA gen, en de voorbereiding van de bibliotheek met kwaliteitscontrole maatregelen. Nog belangrijker is, het protocol en de discussie punten in overweging nemen die meest opvallende aan de voorbereiding en analyse van lage-biomassa monsters zijn, met inbegrip van passende positieve en negatieve controles, de verwijdering van de Inhibitor van de omwenteling van de PCR, monster besmetting door milieu-, reagens, of experimentele bronnen, en experimentele praktijken ter verzekering van de reproduceerbaarheid. Terwijl het protocol zoals beschreven specifiek voor menselijke melkmonsters is, is het aan te passen aan de talrijke lage - en hoge-biomassa monster soorten, met inbegrip van monsters die op de wissers, bevroren puur of gestabiliseerde in een buffer van behoud.

Het hier gepresenteerde protocol omvat belangrijke kwaliteitscontrole (QC) stappen om ervoor te zorgen dat de gegevens die zijn gegenereerd meet benchmarks voor de gevoeligheid, specificiteit en besmetting control protocol. Van het protocol eerste QC stap volgt PCR versterking van het 16S V4 regio (Figuur 2). Één µL van het PCR-product van elk monster werd geanalyseerd door elektroforese om te bevestigen dat er binnen het bereik van de verwachte grootte van 3...

Een semi-geautomatiseerde workflow wordt gepresenteerd voor gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA van menselijke melk en andersoortige laag-biomassa monster.

Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Het algemene doel van deze methode is om 16 SRRNA uit moedermelk en andere monsters met een lage biomassa te versterken met behulp van een semi-geautomatiseerd protocol. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over de ontwikkeling en verstoringen van het menselijk microbioom in verband met zowel gezondheid als ziekte. Het grote voordeel van de techniek is dat deze semi-geautomatiseerd is, relatief eenvoudig uit te voeren en aanpasbaar aan meerdere monstertypen, waaronder secretie, wattenstaafjes en ontlasting.Na het ontdooien en toewijzen van hele melk volgens het tekstprotocol, centrifugeer de monsters 5000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de cellen te pelleren. Gebruik een plastic spatel of grote boring pipettepunt om de bovenste vetlaag te verwijderen. Verwijder vervolgens, zonder de pellet te verstoren, al het supernatant, behalve 100 microliter.Met één milliliter PBS, resuspendeer en was de pellet. Bereid vervolgens een negatieve controle voor door één milliliter steriel PBS toe te voegen aan een vijf milliliter buis. Breng de suspensie over naar een schone centrifugeerbuis van een punt vijf milliliter en centrifugeer deze bij kamertemperatuur gedurende één minuut bij 5000 keer G.Gebruik vervolgens een 1000 microliter steriele gefilterde pipettepunt om de hele supernatante vetlaag weg te gooien. Om het monster te verstoren en te homogeniseren, voeg 600 microliter lysisbuffer met bèta mercaptoethanol toe aan de pellet en breng de suspensie over naar een beadbuisje. Bereid een positieve controle voor met lysisbuffer en 20 microliter van het bacteriële mock-monster.Vortex alle beadbuisjes krachtig gedurende 15 seconden. Verwarm vervolgens de monsters op een temperatuur gecontroleerde vortexer bij 37 graden Celsius en 700 tot 800 RPM gedurende 10 minuten. Laad de buisjes in de geautomatiseerde sample disrupter adaptor set.Vervolgens bead beat de monsters gedurende één minuut op 30 hertz. Demonteer de adaptor set en schakel deze handmatig over van de linker robotarm naar de rechter robotarm van het instrument. Bead beat de buisjes nog een minuut op 30 hertz en centrifugeer vervolgens de buisjes gedurende drie minuten bij 17.200 keer G en 25 graden Celsius.Gebruik een 200 microliter pipettepunt om al het supernatant te verwijderen, zorg ervoor dat u geen vetlaag bovenaan of de bead residu aan de onderkant van het monster neemt. Breng het supernatant aan op homogenisator kolommen. Centrifugeer vervolgens de kolommen bij maximale snelheid en 25 graden Celsius gedurende drie minuten.Breng 350 microliter eluid over naar een twee milliliter fabrikant microcentrifugebuis. Voor het isoleren van DNA volgens het tekstprotocol, snijd de deksels af en maak de randen van de individuele spin kolommen voor DNA en RNA glad. Breng de DNA spin kolom zonder de verzamelbuis in de rotor adapter.Gooi vervolgens de verzamelbuis weg. Plaats vervolgens de gevortexte twee milliliter buisjes in een shaker, volgens de laadgrafiek van het geautomatiseerde DNA/RNA zuiveringsinstrument volgens de instructies van de fabrikant. Label een punt vijf milliliter verzamelbuisjes en plaats ze in rotor adapters.Plaats vervolgens de rotor adapters in de centrifuge volgens de laadgrafiek van het geautomatiseerde DNA/RNA zuiveringsinstrument. Nadat u filter tips, RNase-vrij water en de reagentia in de reagensblokken van het instrument hebt geplaatst, sluit u het deksel van het instrument en voert u het aangepaste DNA-zuiveringsprogramma op het instrument uit. Wanneer de reactie voltooid is, verzamel de monsters bevattende buisjes van de shaker en bewaar eventueel overgebleven monsters bij minus 20 graden Celsius voor kortetermijnopslag of minus 80 graden Celsius voor langetermijnopslag.Nadat u het werkgebied en de PCR master mix hebt voorbereid volgens het tekstprotocol, laadt u 50 tot 100 microliter DNA-monsters in een 32-wel instrument sample adapter, volgens de 96-wel plaat kaart. Voor elke PCR plaat, zet u twee negatieve controles op door 30 microliter PCR water in een schone punt vijf milliliter verzamelbuis te pipetten. Plaats vervolgens alle monsters op de 32-wel instrument sample adapter met de doppen vergrendeld in de open positie.Verwijder op de reagent adapter van het instrument één voor één de dop van elke reverse primer met specifieke streepjescodenummers. Om de robotische vloeistofhandler te laden, plaatst u de reagent adapter op positie B1. Om een randeffect te voorkomen, plaatst u één rand van de adapter voorzichtig tegen de grijpzijden en brengt u de andere rand langzaam naar beneden. Zorg ervoor dat u op alle hoeken van de adapters drukt.Plaats de sample adapter op positie C1, zorg ervoor dat u op alle hoeken van de adapters drukt. Vorm vervolgens het vijf milliliter master mix. Open de dop en plaats het op positie A op de master mix en reagent blok van het instrument.Plaats de PCR plaat op de 96-wel instrument adapter die bedoeld is voor halfrokerige PCR plaatjes. Start vervolgens de run en sla het op als een nieuw bestand. Wanneer de run voltooid is, controleert u of er geen fouten zijn.Gebruik vervolgens 12 of acht strip doppen om de plaat te verzegelen. Vorm krachtig en gebruik een 96-wel plaat spinner om de plaat één minuut te centrifugeren. Plaats ten slotte de plaat op ijs totdat deze naar de post amplificatieruimte wordt verplaatst en op de thermische cycler wordt geladen.Na PCR amplificatie, voer kwaliteitscontrole en bibliotheekvoorbereiding uit volgens het tekstprotocol. De eerste QC-stap van het protocol volgt de PCR amplificatie van de 16SV4 regio. Zoals hier getoond, werd één microliter PCR product van elk monster geanalyseerd door middel van elektroforese om te bevestigen dat het binnen het verwachte bereik van 350 tot 450 basenparen viel.Sommige moedermelk monsters produceerden lagere hoeveelheden specifiek product, wat suggereert dat er ofwel lage niveaus van geëxtraheerd microbieel DNA in die monsters zijn of dat er PCR remmers zijn overgedragen tijdens de extractie. Kwantificering van specifiek product voor elk monster was essentieel om het vereiste volume te bepalen voor gelijke molaire pooling van monsters voor sequencing. Een gepoolde bibliotheek voor gerichte sequencing wordt meestal gedomineerd door een specifiek PCR product.Als er een significant

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het karakteriseren van microbiële gemeenschappen is een al lang bestaand doel in de milieumicrobiologie. Methoden voor next-generation sequencing maken nu de karakterisering van microbiële gemeenschappen mogelijk op een ongekende diepte met minimale kosten en arbeid. We beschrijven hier onze aanpak om bacteriële 16S ribosomale RNA-genen te sequencen met behulp van een tafelsequencer.

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

De cystic fibrosis luchtwegen als voorbeeld, het manuscript presenteert een uitgebreide workflow omvattende een combinatie van metagenomic en metatranscriptomic benaderingen van de microbiële en virale gemeenschappen in dieren door monsters te karakteriseren.

Zuiveren van de Onzuivere: Sequencing metagenomes en Metatranscriptomes van Complex-Animal geassocieerd Samples

We beschrijven een efficiente en rendabele methode voor het extraheren van nucleïnezuur uit uitstrijkjes ter karakterisering van bacteriële 16S rRNA gen gebruiken amplicon sequencing. De methode maakt het mogelijk voor een gemeenschappelijke aanpak voor de verwerking van meerdere soorten monster en herbergt een aantal downstream-analytische processen.

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde gestandaardiseerde protocol voor high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. Het protocol introduceert een protocol van het geïntegreerde, geüniformeerde haalbaar en goedkoop vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Dit protocol maakt analyse van grote aantallen monsters met strenge normen en diverse besturingselementen.

Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Hier beschrijven we de high-throughput detectie en kwantificering van fucosylated menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) met behulp van een geheel-cel biosensor. We ook laten zien hier, de aanpassing van dit platform naar analyse van HMO productie stammen, gericht op het verbeteren van de signaal / ruisverhouding.

Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

Moedermelk zendt humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hoewel slechts ~ 15% van zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd raken. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel deze cellen zijn onderonderzocht. Hier beschrijven we de isolatie van moedermelk leukocyten en een analyse van hun fagocytische capaciteit.

Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten

In dit artikel wordt beschreven hoe u een apparaat in elkaar zet dat kan worden gebruikt om melk van laboratoriummuizen op te vangen. Dit apparaat is betaalbaar, draagbaar en maakt het mogelijk om 0,1-0,5 ml melk op te halen door één getraind persoon. Er is ook een gedetailleerd melkprotocol opgenomen.

Een efficiënte eenpersoonstechniek voor het bemonsteren van melk van laboratoriummuizen

Het artikel beschrijft een protocol voor het reconstitueren van gepasteuriseerde donormelkmicrobiota met behulp van de eigen melkmicrobiota van de moeder in praktische, real-world omgevingen. Het vertoont effectieve bacteriegroei en microbioommodulatie, wat de haalbare toepassing van deze procedure ondersteunt binnen de routinematige zorg van een kraamkliniek en de bijbehorende moedermelkbank.

Geïndividualiseerde reconstitutie van de microbiota van moedermelk: een haalbare aanpak in de praktijk

Dit protocol is ontworpen om de effectieve isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijke moedermelk met hoge zuiverheid te versnellen en mogelijk te maken.

Snelle isolatie van extracellulaire blaasjes afkomstig van menselijke moedermelk

Dit protocol maakt een snelle, kosteneffectieve evaluatie van de microbiële samenstelling in zuivelproducten mogelijk door culturomics te combineren met MALDI-TOF MS. Het levert taxonomieresultaten die vergelijkbaar zijn met 16S rRNA-sequencing met een kortere doorlooptijd dan traditionele kweekmethoden.

Evaluatie van de microbiële veiligheid van zuivelfabrieken met behulp van bacteriële proteomische profilering via de MALDI-benadering

Leer een semi-geautomatiseerde methode voor 16S rRNA-sequencing van menselijke melk en andere low-biomass monsters. Dit protocol vereenvoudigt microbioomanalyse en ondersteunt onderzoek naar gezondheid en ziekte.

Een methode voor gerichte 16S sequentiebepaling van menselijke melkmonsters

Meer video's verkennen