Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases
24 februari 2018
Mitochondriën bevatten verschillende flavin-afhankelijke enzymen die van reactieve zuurstof soorten (ROS produceren kunnen). Controle van ROS is vrijlating uit afzonderlijke sites in mitochondriën uitdagend als gevolg van ongewenste kant reacties. We presenteren een gemakkelijke en goedkope methode voor directe beoordeling van inheemse tarieven voor ROS release met behulp van gezuiverde flavoenzymes en microplate fluorometry.
Het algemene doel van deze procedure is om de superoxide/waterstofperoxide en NADH-productiesnelheid van gezuiverde, flavine-bevattende mitochondriale dehydrogenases te kwantificeren met behulp van microplaat-fluorometrie. Mitochondria kunnen tot 12 verschillende superoxide/waterstofperoxide vormende locaties bevatten die zijn geïdentificeerd met behulp van verschillende substraten en remmercombinaties met geïsoleerde mitochondriën. Er blijven echter enkele moeilijkheden bestaan met betrekking tot het nauwkeurig kwantificeren van de afgiftecapaciteit van individuele productielocaties in geïsoleerde mitochondriën.
En dit gaat gepaard met ongewenste nevenreacties die ook reactieve zuurstofsoorten produceren, maar ook de aanwezigheid van antioxidanten en het gebruik van remmers die geen specificiteit hebben, naast het gebruik van toevoegingen die interfereren met metingen. Hier presenteren we de methode voor de gelijktijdige meting van superoxide/waterstofperoxide en NADH-productie door gezuiverde, flavine-afhankelijke mitochondriale dehydrogenases. Deze methode is voordelig omdat het de directe en nauwkeurige kwantificering van het ROS-producerende potentieel van individuele productielocaties mogelijk maakt door ongewenste nevenreacties en alle systemen voor het dempen van reactieve zuurstofsoorten te elimineren.
De gelijktijdige meting van zowel ROS- als NADH-productie maakt ook een directe vergelijking mogelijk van het superoxide/waterstofperoxide vormende potentieel en de activiteit van individuele enzymen, wat waardevol kan zijn voor het screenen van remmers voor ROS-productie voorafgaand aan het uitvoeren van assays met mitochondriën. Voor onze doeleinden hier, zullen we het pyruvaatdehydrogenasecomplex en het alfa-ketoglutaraatdehydrogenasecomplex van varkenshart als voorbeelden gebruiken. Beide zijn flavine-bevattende enzymen en bekende bronnen van reactieve zuurstofsoorten.
Bovendien kunnen deze twee enzymen gemakkelijk worden gezuiverd. De gelijktijdige meting van superoxide/waterstofperoxide en NADH wordt bereikt door veranderingen in de fluorescentie te volgen. NADH heeft zijn eigen intrinsieke fluorescentie-eigenschappen, wat een eenvoudige meting van zijn productie mogelijk maakt.
Veranderingen in superoxide/waterstofperoxide vereisen daarnaast superoxide dismutatase, mierikswortelperoxidase en amplex ultrarode reagentia. In aanwezigheid van mierikswortelperoxidase en waterstofperoxide wordt amplex ultrarood omgezet van een niet-fluorescent molecuul naar het fluorescente resorufine. Superoxide dismutase zorgt ervoor dat elk superoxide dat wordt gevormd door het onderzochte dehydrogenase wordt omgezet in waterstofperoxide.
Voorafgaand aan het opzetten van de assay worden werkoplossingen bereid. Om de assay te stroomlijnen, worden alle reagentia toegevoegd aan de putjes van een 96-well zwarte plaat in 20-microliter porties. Het volume voor elke reactie in de put is 200 microliter, daarom zijn werkoplossingen 10 keer de concentratie die in de reactieput wordt aangetroffen.
Programmeer vervolgens de microplaatlezer om een kinetiek-assay uit te voeren voor de dubbele meting van NADH-autofluorescentie en resorufine-fluorescentie. Dit wordt gedaan door eerst Procedure te selecteren en deze in te stellen op 25 graden Celsius. Klik vervolgens op Start Kinetiek.
Stel de tijd in om ongeveer vijf minuten te lopen, gevolgd door de selectie van een fluorescente leesinterval van 30 seconden. Klik vervolgens op Lees en stel de fluorescentiemeetparameters voor uw assay in. Hier worden de positie van de sonde, de golflengten die worden gebruikt voor het volgen van veranderingen in fluorescentie en de putjes die worden uitgelezen ingevoerd in de software.
De verschillende kanalen voor de fluorescente metingen worden ook geselecteerd, waarbij een is gewijd aan de autofluorescentie van NADH, die is ingesteld op 376 nanometer excitatie en 450 nanometer emissiegolflengten. Veranderingen in resorufine-fluorescentie worden gevolgd bij 565 nanometer en 600 nanometer. Nadat de assaycondities zijn ingesteld, worden individuele putjes geladen met buffer en verschillende reagentia die nodig zijn om zowel NADH als superoxide/waterstofperoxide tegelijkertijd te meten.
De volgorde voor het laden van de putjes met verschillende reagentia is als volgt. Eerst wordt de vereiste hoeveelheid buffer aan de put toegevoegd, gevolgd door de toevoeging van 20 microliter gezuiverde enzymoplossing. Het enzym wordt enkele minuten in de buffer geëquilibreerd in het instrument.
Vervolgens worden de resterende reagentia toegevoegd in de volgende volgorde. Zodra het substraat is toegevoegd, drukt u op Start. De plaatdrager komt de lezer binnen en het protocol wordt gestart.
Tijdens de assay kunnen realtime uitvoer van ruwe relatieve fluorescentie-eenheden, of RFU's, worden gevolgd met behulp van de software. De gebruiker kan tussen de verschillende fluorescente metingen schakelen door de tab Gegevens boven de putlay-out te gebruiken. Merk op dat curven voor de verschillende fluorescente metingen kunnen worden geselecteerd.
Bovendien kan door Control in te houden op het toetsenbord en met de linkermuisknop op de putjes te klikken, een samengesteld grafiek worden verkregen waarmee de verschillende reacties realtime kunnen worden vergeleken. Na voltooiing van het experiment verlaat de microplaatdrager het instrument. Op dit punt worden de resultaten in de representatieve grafiek voor veranderingen in RFU geëxporteerd naar Excel.
Ruwe RFU-waarden worden geëxporteerd door eerst op Gegevens te klikken op de representatieve RFU-grafiek. Dit levert een tabel op van ruwe RFU-waarden voor NADH- en resorufine-fluorescentie. Merk op dat ruwe RFU-nummers die overeenkomen met veranderingen in NADH of resorufine-fluorescentie niet gelijktijdig kunnen worden geëxporteerd.
Eenmaal geëxporteerd, worden de resultaten georganiseerd voor analyse. Met behulp van standaardcurven voor NADH- en resorufine-fluorescentie die vóór het uitvoeren van de assay zijn gegenereerd, kan de hoeveelheid NADH in micromol en superoxide/waterstofperoxide in picomol gevormd over tijd worden berekend. Dit kan worden gevolgd door het berekenen van de snelheid van NADH- en superoxide/waterstofperoxide-productie.
Voor deze procedure is het van vitaal belang om de zuiverheid van uw geïsoleerde, flavine-bevattende dehydrogenase te controleren voordat u assays uitvoert. Dit kan worden bereikt door een eenvoudige coomassie-kleuring voor eiwitten uit te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het kwantificeren van de productiesnelheden van superoxide/waterstofperoxide en NADH vanuit gezuiverde flavine-bevattende mitochondriale dehydrogenasen met behulp van microplaat-fluorometrie. De methode biedt een oplossing voor de uitdagingen bij het meten van de afgifte van reactieve zuurstofverbindingen (ROS) vanuit individuele mitochondriale locaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Mitochondriale biologie
Achtergrond
- Mitochondriën bevatten diverse flavine-afhankelijke enzymen die ROS genereren.
- Nauwkeurige kwantificering van de ROS-vrijgave vanuit individuele sites is moeilijk.
- Ongewenste nevenreacties en de aanwezigheid van antioxidanten compliceren de metingen.
- Verschillende combinaties van substraten en inhibitoren zijn gebruikt om ROS-productieplaatsen te identificeren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor de gelijktijdige meting van superoxide/waterstofperoxide- en NADH-productie.
- Het elimineren van ongewenste nevenreacties bij de kwantificering van ROS.
- Het bieden van een directe beoordeling van het ROS-producerende potentieel van mitochondriale locaties.
Gebruikte methoden
- Gezuiverde flavine-afhankelijke mitochondriële dehydrogenases werden gebruikt.
- Voor de metingen werd microplaat-fluorometrie toegepast.
- Er werd een gelijktijdige kwantificering van superoxide/waterstofperoxide en NADH uitgevoerd.
- Specifieke inhibitoren en substraten werden gebruikt om individuele productieplaatsen te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een nauwkeurige kwantificering van de ROS-productiesnelheden mogelijk.
- Ongewenste nevenreacties werden effectief geminimaliseerd.
- Individuele locaties van ROS-productie werden succesvol beoordeeld.
- De aanpak biedt een helderder inzicht in de dynamiek van mitochondriale ROS.
Conclusies
- Deze methode verbetert de mogelijkheid om de productie van mitochondriale ROS te bestuderen.
- Het biedt een betrouwbaar instrument voor onderzoekers die de mitochondriale functie onderzoeken.
- De bevindingen kunnen implicaties hebben voor het begrip van oxidatieve stress in cellen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Nauwkeurige kwantificering van de productie van reactieve zuurstofcomponenten (ROS) door individuele mitochondriale enzymen is van cruciaal belang voor targetvalidatie bij geneesmiddelenonderzoek gerelateerd aan oxidatieve stress. Deze methode maakt een directe vergelijking mogelijk tussen de vorming van ROS en de enzymactiviteit, wat bijdraagt aan het mechanische de-risking van flavine-gekoppelde dehydrogenase-targets. Door storende antioxidant-systemen en nevenreacties te elimineren, biedt het voorspellende zekerheid voor inhibitor-screening voorafgaand aan complexe mitochondriale of cellulaire assays.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de natuurlijke ROS-afgiftesnelheden van gezuiverde flavine-afhankelijke dehydrogenases te kwantificeren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe meting van superoxide/waterstofperoxide- en NADH-productie vanuit individuele enzymplaatsen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door screening van de selectiviteit en effectiviteit van inhibitoren voor ROS-productie mogelijk te maken voorafgaand aan mitochondriale assays.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarzetting van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door gestandaardiseerde, kwantitatieve ROS- en NADH-uitlezingen te verschaffen.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van microplaatfluorometrie met gedefinieerde excitatie-/emissiegolflengten (NADH: 376/450 nm; resorufine: 565/600 nm) voor consistente signaaldetectie.
- Schaalbaarheid: Maakt high-throughput screening van inhibitoren mogelijk met gebruik van een 96-wells plaatformaat met reactievolumes van 200 µL.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Dient als opstap naar meer geavanceerde experimenten met geïsoleerde mitochondriën of gepermeabiliseerde spiervezels door het vaststellen van basisrelaties tussen ROS en enzymen.
- Ziekterelevant systeem: Maakt gebruik van het pyruvaatdehydrogenasecomplex (PDHC) en het alfa-ketoglutaraatdehydrogenasecomplex (KGDHC) afkomstig uit varkenshart als modellen voor mitochondriale ROS-bronnen die relevant zijn voor metabole en cardiovasculaire aandoeningen.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of de waargenomen ROS-veranderingen voortkomen uit de activiteit van het doelenzym of uit off-target effecten of antioxidantinterferentie.
Pipeline- & Workflow-integratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie en levert kwantitatieve ROS- en activiteitsgegevens die go/no-go-beslissingen onderbouwen voordat men overgaat naar complexe fenotypische of preklinische modellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests door de ROS-productie van specifieke flavine-gekoppelde dehydrogenasen te isoleren, waardoor mechanistische ambiguïteit in padanalyse wordt verminderd.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde, gelijktijdige detectie van NADH-autofluorescentie en resorufine-fluorescentie, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maakt.
- Analytics: Genereert kwantitatieve outputs (NADH in micromoles, superoxide/waterstofperoxide in picomoles over de tijd) die de berekening van productiesnelheden mogelijk maken voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt discovery met preklinische continuïteit door de natuurlijke ROS-vrijgave-snelheden voor individuele enzymen te definiëren voordat deze in intacte mitochondriale systemen worden getest.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van flavine-afhankelijke enzymdoelen over projecten heen, waardoor redundante assay-ontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit bij de toeschrijving van de ROS-bron te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door een gedefinieerde volgorde van reagentia, kinetische instellingen en scheiding van fluorescentiekanalen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege inhibitor-screening mogelijk te maken, waardoor falen in een laat stadium door onvoorziene ROS-gemedieerde toxiciteit wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door het ROS-producerende potentieel van individuele enzymplaatsen te kwantificeren, wat bijdraagt aan beslissingen over targetselectie en verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in enzymzuivering en het opzetten van fluorometrische assays, inclusief validatie van de zuiverheid van flavine-bevattende dehydrogenases via Coomassie-kleuring of activiteitsassays.
- Afhankelijk van een microplate reader die in staat is tot kinetische metingen op twee golflengten (376/450 nm voor NADH, 565/600 nm voor resorufine) met temperatuurregeling op 25°C.
- Maakt uitsluiting van reducerende middelen zoals DTT noodzakelijk, aangezien deze kunnen fungeren als substraten voor de productie van superoxide/waterstofperoxide en de resultaten kunnen beïnvloeden.
- Vereist de bereiding van werkoplossingen in een 10x concentratie vanwege het uiteindelijke volume van 200 µL vanuit aliquots van 20 µL in 96-well platen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van superoxide dismutase om superoxide om te zetten in waterstofperoxide voor detectie via het amplex ultrared/mierikwortelperoxidase-systeem.
