Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Het algemene doel van deze procedure is om met succes een micro-injectie uit te voeren in nasonia vitripennis-embryo's om genomische manipulatie te vergemakkelijken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden met betrekking tot nasonia vitripennis-biologie, zoals bij het produceren van gif en geslachtsbepaling. Het grote voordeel van het gebruik van deze techniek is dat het directe manipulatie van het wespgenoom mogelijk maakt en een breed scala aan geavanceerde genomische modificaties biedt.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Ming Li, een post-doc uit ons laboratorium. Om te beginnen, stelt u verschillende N.vitripennis-kolonies op door 200 tot 500 volwassenen te plaatsen met een verhouding van drie tot één vrouwtjes tot mannetjes in insectendormitoriumkooien. Houd de wespen op 25 plus minus één graad Celsius met 30% relatieve luchtvochtigheid en een 12 op 12 licht/donkercyclus.

Laat de gepaarde vrouwtjes gedurende twee dagen voeden met verse S.bullata-poppen, evenals kleine druppels van een een op tien volume op volume sucrose-wateroplossing. Verwijder voor de volgende twee dagen de daaspoppen om de vrouwelijke wespen van een legstek te beroven, waardoor ze erg zwanger worden. Om S.bullota-poppenvers vers te houden, bewaar ze onmiddellijk na het verkrijgen op 4 graden Celsius en haal ze alleen wanneer nodig.

Maak onderscheid tussen jonge gastheren met een rood gekleurde puparium en oudere gastheren met een donkerder gekleurde puparium. Laat vrouwelijke wespen parasiteren in de jonge gastheer door individuele verse S.bullata-poppen in een schuimstop met een in het midden uitgesneden gat ter grootte van een pop te plaatsen. Voor maximale concentratie van parasitatie en gemakkelijkere embryoverzameling, leg slechts ongeveer 0,2 centimeter van het voorste uiteinde van de gastheer bloot, dat afgerond is, vergeleken met het achterste uiteinde, dat dikker is en een kratervormige opening bevat.

Plaats gastheerpoppen in deze opstelling in de kooi en wacht ongeveer 45 minuten om wespen toe te laten om ze te parasiteren. Verwijder geparasiteerde gastheren door ze met de hand te verwijderen en voorzichtig te tikken of blazen om eventuele resterende wespen af te blazen. Vervang ze ongeveer elke 15 minuten door verse gastheren om vroeg in het stadium eieren te blijven verzamelen tijdens injecties.

Gebruik onder een dissectiescoop pincetten om voorzichtig het achterste uiteinde van het buitenste puparium van een vers geparasiteerde gastheer af te pellen om de N.vitripennis-eieren bloot te leggen. Bereid vervolgens een embryo-uitlijningsschuif voor door een dekglas met vloeibare lijm op een schone glazen schuif te plakken. Poets met een natte, fijnpuntige verfkwast voorzichtig de embryo's van de gastheer af en zorg ervoor dat de zachte pophuid van de gastheer niet wordt beschadigd.

Breng vervolgens met de natte verfkwast ongeveer 20 embryo's één voor één over op de schuif, direct naast de zijkant van het dekglas. Richt het voorste uiteinde van het embryo tegen de rand van de dekglas zodat de achterste uiteinden van het embryo in dezelfde richting wijzen. Dit zal een hogere precisie mogelijk maken om op dezelfde positie in alle embryo's te injecteren.

Na het trekken van injectienaalden volgens het tekstprotocol, schuin de naaldpunt door de punt lichtjes aan te raken aan een diamantschuurplaat bij 25 graden Celsius gedurende ongeveer 10 seconden. Bereid het injectiemengsel voor dat bestaat uit genoommodificatiereagentia en bewaar het op ijs. Gebruik een microloader-tip om de injectienaald te vullen met twee microliters injectiemengsel.

Plaats vervolgens de glazen schuif met de uitgelijnde embryo's op het podium van een samengesteld microscoop. Breng de naald voorzichtig in het achterste uiteinde van het embryo met een verticale hoek van 25 tot 35 graden in. Injecteer vervolgens een tot vijf picoliters injectiemengsel en zorg ervoor dat het embryo lichtjes opzwelt door de injectie.

Als er verstopping optreedt, probeer de naalden opnieuw schuin te maken. Het cytoplasma van N.vitripennis-embryo's is ongewoon viskeus en plakkerig, wat leidt tot frequente naaldbeveiliging. Injecteer ongeveer 20 tot 40 eieren tegelijk en stop dan.

Breng de geïnjecteerde eieren over met een natte verfkwast door de geïnjecteerde eieren lichtjes aan te raken en plaats ze in een gastheer. Ga vervolgens door met het injecteren, met behulp van een vers, nieuw gelegde partij eieren. Idealiter is deze stap het meest effectief wanneer één persoon eieren verzamelt en in een rij zet, terwijl een andere persoon genoommodificatiecomponenten injecteert en geïnjecteerde embryo's transplanteert in gastheerpoppen.

Na micro-injectie, gebruik een natte verfkwast om voorzichtig maximaal 40 geïnjecteerde G nul-embryo's één voor één op een eerder gestoken S.bullata-pop te plaatsen. Plaats de gastheerpoppen in een petrischaal met vochtige filterpapier en wattenbollen en incubeer ze bij 25 graden Celsius met ongeveer 70%vochtigheid tot de geïnjecteerde embryo's in ongeveer een tot twee dagen uitkomen. Belangrijk is dat gastheren met een afgescheurde puparium kunnen worden achtergelaten en de N.vitripennis-eieren normaal zullen ontwikkelen, zolang ze in een bevochtigde kamer worden geïncubeerd om uitdroging te voorkomen.

Nadat G nul-embryo's uitkomen, brengt u de gastheerpoppen over naar een nieuwe petrischaal en incubeert u ze bij 25 graden Celsius en 70%vochtigheid. Bewaak de gastheerpoppen en geïnjecteerde G nul-larven dagelijks. Als de gastheerpoppen een nare geur hebben, brengt u de geïnjecteerde larven over naar nieuwe, gezonde gastheerpoppen.

Voor effectieve naaldpenetratie en micro-injectie in N.vitripennis-embryo's werden verschillende micropipetpullers getest met verschillende soorten capillaire glasnaalden met filamenten, waaronder kwarts, aluminosilicaat en borosilicaat, om een gewenste