Name: Visualisatie van corticale Modules in afgeplatte zoogdieren Cortices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer een methode voor het visualiseren van corticale modules in zoogdiercortices door plat te leggen en te kleuren. Deze techniek maakt laagsgewijze analyse mogelijk en helpt onderzoekers bij het vergelijken van corticale architectuur tussen soorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Humboldt-Universität zu Berlin, de Bernstein-Center for Computational Neuroscience Berlijn, het Duitse centrum voor neurodegeneratieve ziekten (DZNE), het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (goedgekeurd, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure, en de Gottfried Wilhelm Leibniz prize van de DFG. Wij danken Shimpei Ishiyama voor uitstekende grafische vormgeving en Juliane Diederichs voor uitstekende technische bijstand.

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de Duitse richtlijnen inzake dierenwelzijn onder toezicht van plaatselijke ethische commissies (LaGeSo). Menselijke en vleermuis hersenen gegevens werden ontleend aan Naumann et al. 5 de volgende procedure wordt uitgevoerd op een mannelijke volwassen Wistar ratten (stam: RJHan:WI).
1. perfusie en extractie van de hersenen
Opmerking: Het verkrijgen van een homogeen vaste en bloed-vrije hersenen, transcardial perfusie van het dier is zeer aangemoedigd, zoals residuele bloed aspecifieke achtergrond signaal tijdens de kleuring toeneemt. Het is echter ook mogelijk verkrijgen van afgevlakte secties uit un-perfused monster en vlekken hen. Het gemak van de behandeling van het model is afhankelijk van de concentratie van fixeerspray gebruikt. Te weinig fixatie verhoogt het risico voor de behandeling van schade aan de hersenen tijdens afvlakken en snijden, terwijl ook hoge concentraties lager de flexibiliteit voor het afvlakken en de kwaliteit van de kleuring signaal.
<ol><li>Transcardially perfuse het dier, met behulp van een naald 23G. Zie voor een meer gedetailleerde gids, Gage et al. 9<ol>
<li>Gebruik van fosfaat buffer zoute10 (PBS 0,02 M; pH 7.4) te spoelen van bloed uit de hersenen en het lichaam van het dier. Totdat infusie vloeistof blijkt duidelijk, met ten minste 150 mL PBS wordt toegediend via het vasculaire systeem. Opmerking: De beste resultaten worden bereikt bij een druk die vergelijkbaar is met het bereik van de fysiologische druk van het bloed van het dier wordt geperfundeerd (bijvoorbeeld, rat: 120-130 mmHg). Desgewenst voegt u heparine (10 U/mL) toe aan de oplossing om te voorkomen dat bloed coagulatie11.</li>
		<li>Om dit te corrigeren de hersenen transcardially infusie van een minimum van 100 mL paraformaldehyde12 (PFA, 4%; in 0,1 M fosfaat buffer (PB)13) totdat de hals van het dier stijf is. Let op: PFA is een potentieel kankerverwekkend. Opmerking: Beste resultaten voor histochemische activiteit kleuring, zoals cytochroom oxidase, zijn behaald, bij het gebruik van 2% PFA. Voor andere kleuring, zoals immunohistochemistry, 4% PFA heeft de voorkeur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het uittreksel van de hersenen van de schedel. Opmerking: Zie Gage et al. 9 voor meer informatie.<ol>
<li>Isoleren van het hoofd met behulp van grote schaar of bot schaar.</li>
		<li>Met behulp van fijn schaar, sneed de huid langs de middellijn van de nek naar de neus. Trek uit elkaar de huid om de schedel bloot te stellen. Verwijder de nek en temporele spieren met behulp van fijn schaar.</li>
		<li>Maak een middellijn die dwars door het interparietal bot vanaf het foramen magnum tot het pariëtale bot.</li>
		<li>Gebruik Rongeurs schil af de interparietal bot. Schuif fijn schaar langs de Sagittaal hechtdraad en verlaagd het achterste einde van de pariëtale tot het anterior einde van de frontale botten.</li>
		<li>Gebruik Rongeurs schil af de pariëtale en frontale botten. Als alternatief, heffen de botten weg met pincet. Gebruik een lepel om te knippen ventrale zenuw koorden en verwijderen van de hersenen. De hersenen overbrengen in PB (0,1 M; pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>VN-perfused hersenen oplossen door onderdompeling in 4% PFA gedurende 1-3 uur bij 4 ° C (afhankelijk van de grootte van de hersenen en de sonde: Shrew: ~ 1 h, mens: ~ 3 h). Opmerking: Voor grote en gyrencephalic hersenen als mens, isoleren en knip uit het gebied van belang zijn voor het verkorten van de fixatie.</li>
	<li>Met het oog op een grotere corticale gebieden in een sectie, het afvlakken van de hersenen vóór verdere na fixatie; Ga verder met stap 2. Echter voor het verkrijgen van secties van moeilijker te bereiken plekken zoals de mediale Entorinale cortex, post bevestigen de hersenen in 4% PFA gedurende 24 uur voordat u verdergaat met stap 2.</li>
</ol>2. brain dissectie en afvlakken
<ol><li>Het scheiden van de hemisferen van de hersenen met behulp van een scheermesje (lissencephalic hersenen) of scalpel (gyrencephalic hersenen). Opmerking: Als de hersenen heeft geen post zijn vastgesteld, is het gevoelig voor schade door behandeling.</li>
	<li>Optionele stap voor medeplichtigheid aan latere sectie registratie en krimp schatting:<ol>
<li>Het doorprikken van de cortex in een gebied van niet-belang, met een 35G naald loodrecht op het glasoppervlak corticale. Herhaal de stap twee keer op gedefinieerde afstanden langs de corticale blad. Om te bepalen van de afstand langs de corticale blad, gebruik een voorgesneden draad op een vaste lengte (bijv., 5 mm) en leg het langs de corticale oppervlak om punten van lekke band.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic hersenen: verwijderen van subcorticale structuren met behulp van een spatel ontleden. Kritische: Houd de hersenen vochtig met PB (0,1 M; pH 7.4) gedurende de hele procedure.<ol>
<li>Houd de hersenen door het cerebellum en zachtjes invoegen de spatel om te openen van een vliegtuig van de dissectie in het corpus callosum. De ronde tip van spatel erop uit de buurt van de cortex.</li>
		<li>Schuif de spatel verder en trek voorzichtig totdat de spatel tussen de thalamus en cortex is. Aparte subcorticale structuren met het krassen van bewegingen.</li>
		<li>Inspecteer het halfrond voor zelfs dikte. Opmerking: Eventuele ongelijke regio's tijdens kunnen ontstaan in een trans-laag verloop segmenteren. Gebruik voor tangentiële afdelen, een scalpel om een schoon gesneden door de hersenen, parallel aan het pial oppervlak van de regio waaruit tangentiële secties zijn gewenst.</li>
		<li>Optionele stappen afvlakken kwaliteit te verbeteren:<ol>
<li>Maak een schoon gesneden door het striatum, nucleus accumbens en orbitofrontale cortex, aangezien ze de dikte van de cortex in de laterale regio te verhogen. Ook het toevoegen van een verlichten gesneden aan de basis van de binnenste regio van de prefrontale cortex, waarmee de ontplooiing van de mediale delen van de cortex.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Plaats het halfrond (cortex naar beneden) op een glasplaatje. Ga verder met stap 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gyrencephalic hersenen: verwijderen van de witte stof te ontvouwen van gyri (Zie voor gedetailleerde protocollen,: Sincich et al. 14; Tootell en Silverman15). Kritische: Gebruik PB (0,1 M; pH 7.4) de hersenen om vochtig te houden te allen tijde.<ol>
<li>Zet het interessegebied op een vochtige filterpapier in een grote petrischaal, met de cortex naar boven.</li>
		<li>Verwijder de arachnoideavilli membraan en pia met behulp van twee pincet.</li>
		<li>Gebruik een vochtig wattenstaafje en voeg voorzichtig in elke Sulcus (hersenanatomie) aan het losmaken van verklevingen tussen gyri.</li>
		<li>De hersenen draaien met behulp van een andere vochtige filterpapier.</li>
		<li>Gebruik twee gebogen micro spatels te ontvouwen van één gyri. Gebruik de bolle kant van de spatels te plagen uit elkaar de witte stof tot het bereiken van dicht bij de concaaf einde van de gyrus. Gebruik een vochtig wattenstaafje en ga verder met kronkelende bewegingen te bereiken het concaaf einde van de gyrus.</li>
		<li>Tease uit elkaar één gyri. Zo nodig typt u kleine verlichten snijdt als de spanning te hoog is.</li>
		<li>De ongevouwen hersenen in de petrischaal of een soortgelijk container afvlakken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>U kunt desgewenst plaats grotere hersenen op een filtreerpapier gedekt spons, om ervoor te zorgen dat regio's doen niet uitdrogen.</li>
	<li>Leg twee opgerolde stukjes klei aan beide zijden. Kritische: Als de dikte van de klei hoeveel het halfrond kan worden afgevlakt definieert, ervoor zorgen dat de klei 10-20 is % dunner dan de niet-afgevlakte cortex.</li>
	<li>Zachtjes druk op een tweede glas dia/kleine petrischaal op de cortex totdat het halfrond volledig plat is. Voor de beste resultaten voor een gewenste regio, plaatst u het glasplaatje eerst op het desbetreffende gebied. Voor de beste resultaten voor lissencephalic hersenen, plaatst u het glasplaatje tangentieel op het laterale gedeelte eerst en geconcentreerde druk uitoefenen op deze regio.</li>
	<li>Zet een gewicht (bijvoorbeeld, een keramische horlogeglas) op de dia's / petrischaal van glas en afvlakken van het halfrond gedurende 3-5 uur bij 4 ° C in PB.</li>
	<li>Voor fixatie van de post, laat de druk en de glas-dia's te verwijderen. Zet de afgevlakte halfrond in PFA (vrij zwevend) gedurende 24 uur in een roteerapparaat bij 4 ° C. Opmerking: De beste resultaten voor activiteit histochemische technieken zijn behaald bij het gebruik van 1% PFA. Voor andere technieken, zoals immunohistochemistry, voor un-perfused hersenen, 2% PFA kan worden gebruikt.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Figuur 1: schematische weergave van de werkstroom voor het afvlakken van een rat corticale halfrond en visualisatie van modules in Somatosensorische cortex. Na de transcardial perfusie, het brein van een muis werd ontleed (A). Subcorticale structuren werden verwijderd en cortex was afgeplat tussen twee glazen dia's in de fosfaatbuffer (B). Afgevlakte halfrond (C) was na vaste tangentieel gesegmenteerd en gekleurd voor cytochroom oxidase activiteit (D). Schaal bars = 1 cm. R: Rostral, C: Caudal, L: laterale, M: mediale. Figuur overgenomen van Lauer et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
3. Snij tangentiële secties
Opmerking: Afhankelijk van de vereisten van de kleuring protocollen, de snijden procedure en dikte kunnen worden aangepast. Een vibratome werd gebruikt voor het knippen van de hemisferen voor verdere histochemische verwerking (stap 3.2) bij 80-150 µm. Echter voor de immunohistochemische verwerking, dunner secties zijn gewenst en een bevriezing microtoom werd gebruikt voor vectorafbeeldingsbestanden (stap 3.3) op 10-60 µm. Zie Video 1.
<ol><li>Wassen van de afgevlakte halfrond in PB (0.1M; pH 7.4) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Snijd het halfrond op een vibratome.<ol>
<li>Plaats het halfrond tangentieel op de segmenteringshulplijnen houder. Optioneel, druk nogmaals op zachtjes met een glasplaatje vóór de vaststelling van het in positie (bvmet lijm). Opmerking: Minimaliseren de hoeveelheid lijm gebruikt, omdat het snijden artefacten kunnen ertoe leiden dat als gevolg van de kleine dikte van afgevlakte hemisferen.</li>
		<li>Snijd het halfrond vanaf het einde van het dikker en stabieler dunner eind (posterieure aan anterior, hier) op de gewenste dikte. Ga verder met stap 3.4. Opmerking: Als lage fixatie concentraties werden gebruikt, snijd het op een langzame snelheid en een hoge amplitude.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Snijd het halfrond op een bevriezing microtoom.<ol>
<li>Cryoprotect de hersenen door onder te dompelen in een 30% sacharoseoplossing (in PB) totdat hij zinkt. Opmerking: Afhankelijk van de grootte van het weefsel wordt cryoprotected, tot zinken brengen in de oplossing kan variëren van een paar uur tot een paar dagen. Voor grotere hersenen alternatieve cryoprotection methoden kunnen worden beschouwd (Zie Rosene et al. 16).</li>
		<li>Vormen een ijs baseren op de bevriezing microtoom te monteren de hersenen. Construeer de basis ijs door bevriezing van de PB op het gezicht van het blok van de bevriezing microtoom. Kritische: Zorg ervoor dat het oppervlak van de ijs-base parallel aan de microtoom blade. Om dit te doen, snijd het lege ijs base met behulp van de microtoom blade precies uitlijnen de ijs base parallel aan het snijvlak.</li>
		<li>Insluiten van de hersenen in de bevriezing van medium en dit koppelen aan het gezicht van het blok van de microtoom met het interessegebied parallel aan het gezicht van het blok. Gezicht het pial oppervlak van de hersenen naar het gezicht van het blok van de microtoom. Kritische: Aanpassen de vriestemperatuur afhankelijk van de grootte van de steekproef; hogere temperaturen betere sectie integriteit te garanderen tijdens het segmenteren, maar grotere secties vereisen lagere temperaturen om te monster gelijkmatig te bevriezen.</li>
		<li>Snijd de hersenen tangentieel bij de vereiste dikte (langzamer en uniforme snijsnelheden resulteren in de beste kwaliteit van de sectie).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen van de secties in PB gedurende 15 minuten op een shaker.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Video 1: schematische video van tangentiële segmenteren van een rat mediale Entorinale cortex en de lay-out van de modules parasubicular en Entorinale. De mediale Entorinale cortex van de hersenen van een knaagdier is gelegen aan de achterste eind van de cortex en wordt bewogen naar de mediale en ventrale zijde. Tangentiële secties worden verkregen door een mes langs deze hoek oriënteren. Bijgevolg passende celtype specifieke kleuring onthult modulaire structuren in de mediale Entorinale cortex en de aangrenzende parasubiculum. Video van Ray en Brecht8aangepast. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>
4. visualisatie van corticale Modules met behulp van cytochroom Oxidase kleuring
Opmerking: Verschillende kleuring protocollen zijn ontwikkeld voor histochemische detectie van cytochroom oxidase activiteiten, bijvoorbeeld, eerst door Wong-Riley17 en later bewerkt door Divac et al. 18 dit protocol is gebaseerd op enerzijds door Divac et al. 18, sinds het gebruik van nikkel-ammoniumsulfaat (NiAS) resulteert in een hoger contrast en beter gedefinieerde modules in gekleurde corticale gebieden.
<ol><li>Voorbereiden van het cytochroom-oxidase kleurstofoplossing (Zie Divac et al. 18). voor 10 mL van oplossing toevoegen: 10 mL HEPES buffer (0,1 M, pH 7.4), 400 mg sacharose, 12,5 mg NiAS, 2 mg cytochroom C, 6 mg diaminobenzidine (DAB). Let op: DAB en NiAS zijn kankerverwekkend. Opmerking: Voeg DAB vlak voor de incubatie van secties.</li>
	<li>Wassen van de secties in HEPES-buffer (0,1 M, pH 7.4) op een shaker gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Incubeer de secties in de kleurstofoplossing bij kamertemperatuur op een shaker. Opmerking: Let op de snelheid van de kleuring. Als er geen zichtbare reactie, omzetten in incubatie bij 37 ° C. Afhankelijk van de hoeveelheid fixatie, kan kleuring worden waargenomen na 10 min of in enkele uren.</li>
	<li>Zet de reactie stop door het toevoegen van 4% PFA; Hiermee voorkomt u dat ongewenste opnieuw sterven en verhoging van de achtergrond signaal.</li>
	<li>Wassen in de secties drie keer gebruik van HEPES-buffer gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Monteren en drogen van de secties op glas dia's.</li>
	<li>Uitdrogen van de secties met een toenemende rij van alcohol:<ol>
<li>De dia's in 60% ethanol voor 1 min. Wash de dia's in wassen 80% ethanol 1 min. wassen de dia's in 96% ethanol 2 min. wassen de dia's in 100% ethanol 3 min. wassen de dia's in isopropanol en 5 min. de dia's in xyleen gedurende 5 minuten wassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Onmiddellijk een snelle verharding-montage-medium, en voeg toe een dekglaasje aan. Kritische: Gebruik geen montage waterbasis mediums, zoals NiAS zal worden uitgewassen en de kleuring degraderen.</li>
	<li>Houd de secties bij 4 ° C voor lange termijn opslag.</li>
</ol>5. visualisatie van corticale Modules met behulp van immunohistochemische kleuring
Opmerking: Meerdere protocollen zijn beschikbaar voor immunohistochemistry, geoptimaliseerd voor het model en de soort sonde. Aanpassingen kunnen worden gemaakt zoals vereist, in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van antilichamen, permeabilizing agenten en incubatie tijden. Het volgende protocol leidt tot goede resultaten voor het opsporen van een groot scala aan antilichamen en visualisatie door fluorescerende sondes.
<ol><li>Wassen van de secties in PBS (0,1 M; pH 7.4) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Optioneel: Uitvoeren antigeen ophalen om het ontmaskeren van een epitoop met behulp van een waterbad (op basis van Jiao et al. 19; Zie Pileri et al. voor alternatieve methoden, 20).<ol>
<li>Verwarm een waterbad tot 80 ° C. Bereiden van tri-natrium citraat buffer19 (pH 8.0) en verwarm het in het waterbad tot 80 ° C.</li>
		<li>De secties naar tri-natrium citraat buffer overbrengen. Incubeer de secties gedurende 30 minuten bij 80 ° C</li>
		<li>De secties tot kamertemperatuur afkoelen</li>
		<li>Wassen van de secties in PBS gedurende 15 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen van de secties twee keer in PBS-X (0,5% Triton-X, in 0,1 M PBS) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Aspecifieke epitopes blokkeren door het broeden van de secties in een oplossing van bovien serumalbumine (BSA; 2,5%) en Triton-X (0,75%) in PBS voor 2 h.</li>
	<li>Incubeer de secties in primair antilichaam, bijvoorbeeldCalbindin - D28k (1:5, 000, 1% BSA in PBS-X), voor 2-3 dagen in een roteerapparaat bij 4 ° C. Opmerking: Optimale verdunning voor het primaire antilichaam afhankelijk van het specifieke antilichaam gebruikt. Raadpleeg fabrikant informatie te verkrijgen van verdunning criteria voor een specifiek antilichaam. Meerdere antilichamen kunnen samen worden gebruikt maar moeten worden verhoogd tegen verschillende soorten.</li>
	<li>Wassen van de secties drie keer in PBS voor elke 15 min.</li>
	<li>Incubeer de secties overnachting in secundair antilichaam (1:200, 1% BSA in PBS) bij 4 ° C op een shaker. Opmerking: Meerdere secundaire antilichamen kunnen worden gebruikt op verschillende spectra als meerdere primaire antilichamen werden gebruikt.</li>
	<li>Het secundaire antilichaam afwassen door het wassen van de secties drie keer in PBS voor elke 10 min.</li>
	<li>Monteren en drogen van de secties op een glasplaatje voor microscopie. Opmerking: De secties moeten nog steeds vochtig voorafgaand aan de montage van het dekglaasje aan.</li>
	<li>Montage medium geschikt voor fluorescentie kleurstoffen op de weefselsecties toepassen en breng een dekglaasje aan.</li>
	<li>Droog de secties voor 1 h.</li>
	<li>Voor lange termijn opslag, zegel het dekglaasje aan met behulp van nagellak en houden in het donker bij 4 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrodmann%2C+K+%22Vergleichende+Lokalisationslehre+der+Grosshirnrinde+in+ihren+Prinzipien+dargestellt+auf+Grund+des+Zellenbaues%22">Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues</a>. , Barth. (1909).</li>
<li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(15)00218-3">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li>
<li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+columns%2C+modules%2C+and+domains+in+the+neocortex+of+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li>
<li>Woolsey, T. A., Van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+organization+of+layer+IV+in+the+somatosensory+region+%28SI%29+of+mouse+cerebral+cortex%3A+the+description+of+a+cortical+field+composed+of+discrete+cytoarchitectonic+units%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units.</a> Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).</li>
<li>Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+size+and+periodicity+of+pyramidal+patches+in+layer+2+of+medial%2Fcaudal+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex.</a> J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).</li>
<li>Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grid-layout+and+theta-modulation+of+layer+2+pyramidal+neurons+in+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex.</a> Science. 343 (6173), 891-896 (2014).</li>
<li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+oxidase%3A+an+endogenous+metabolic+marker+for+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity.</a> Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).</li>
<li>Ray, S., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+development+and+dorsoventral+maturation+of+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex.</a> Elife. 5, e13343(2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-buffered+saline+%28PBS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).</li>
<li>Olson, S. T., Chuang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+activates+antithrombin+anticoagulant+function+by+generating+new+interaction+sites+%28exosites%29+for+blood+clotting+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases.</a> Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/12/pdb.rec12044.full">Paraformaldehyde (PFA; 4%).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec8303.full">Sodium phosphate (PB).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).</li>
<li>Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+flatmounting+of+the+macaque+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex.</a> Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).</li>
<li>Tootell, R. B., Silverman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+flat-mounting+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Two methods for flat-mounting cortical tissue.</a> J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).</li>
<li>Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryoprotection+method+that+facilitates+cutting+frozen+sections+of+whole+monkey+brains+for+histological+and+histochemical+processing+without+freezing+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact.</a> J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+contrast+in+histochemical+detection+of+cytochrome+oxidase%3A+metallic+ions+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol.</a> J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).</li>
<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li>
<li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry%3A+comparison+of+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).</li>
<li>Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomical+studies+of+the+SmL+face+cortex+with+special+reference+to+the+occurrence+of+%22barrels%22+in+layer+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV.</a> J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).</li>
<li>Krubitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+neocortex+in+mammals%3A+are+species+differences+really+so+different%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?</a> Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).</li>
<li>Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+selected+size+differences+and+conserved+sexual+monomorphism+of+genital+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex.</a> J Comp Neurol. , (2017).</li>
<li>Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+bundles+of+dendrites+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol%22%5BJournal%5D)">Vertical bundles of dendrites in the neocortex.</a> Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).</li>
<li>Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+trajectories+between+mouse+somatosensory+thalamus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex.</a> J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).</li>
<li>Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+Modular+Microcircuits+of+the+Rat+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex.</a> Front Syst Neurosci. 11, (2017).</li>
<li>Livingstone, M. S., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+inputs+to+cytochrome+oxidase-rich+regions+in+monkey+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).</li>
<li>Land, P. W., Simons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+oxidase+staining+in+the+rat+SmI+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).</li>
<li>Welker, C., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+layer+IV+in+the+somatosensory+neocortex+of+the+rat%3A+description+and+comparison+with+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse.</a> J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).</li>
<li>Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).</li>
<li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+SR+%22Histologie+du+Systeme+Nerveux+de+l%27Homme+et+des+vert%C3%A9br%C3%A9s%22">Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés</a>. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).</li>
<li>Chapin, J. K., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+body+representation+in+the+SI+cortex+of+anesthetized+and+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats.</a> J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).</li>
<li>Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+organization+of+the+orientation+column+system+in+large+flat-mounts+of+the+cat+visual+cortex%3A+A+2-deoxyglucose+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study.</a> J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+rat+parasubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the rat parasubiculum.</a> J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).</li>
<li>Snyder, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnyder%2C+JP+%22Map+projections--A+working+manual+%28Vol.+1395%29%22">Map projections--A working manual (Vol. 1395)</a>. , US Government Printing Office. (1987).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van eventuele commerciële of financiële relaties kan worden opgevat als een mogelijke belangenconflicten.

Modulariteit in de hersenschors heeft geïdentificeerd met behulp van een verscheidenheid van technieken. De vroegste corticale modules van de studies die normaal gesproken aangeduid door beide visualiseren cel dichte regio's, of een gebrek aan vezels1. Volgende methoden hebben gebruikt de aanwezigheid van dendritische bundels24, afferents van een bepaalde regio25, of de verrijking van neurotransmitters26. Wij tonen hier twee t...

Enkele van de belangrijkste veranderingen in de hersenstructuur over fylogenie kunnen worden waargenomen in de hersenschors. Ondanks aanzienlijke verschillen, de cortex van de dieren volgt een gemeenschappelijk patroon en kan grofweg worden verdeeld in twee verschillende manieren, door lagen en gebieden1. Corticale lagen liggen evenwijdig aan het oppervlak van de hersenen en variëren in getal van 3 lagen in reptiel cortices2 tot 6 lagen in zoogdieren cortices1. Corticale gebieden aan de andere kant zijn verschillende regio's van de cortex, die grotendeels overeenkomen met verschillende functies, bijvoorbeeld, de Somatosensorische cortex is betrokken bij het gevoel van aanraking of de visuele cortex bij de verwerking van visuele ingangen. Deze corticale gebieden kunnen vaak worden onderverdeeld in patches of modules3, die regelmatig anatomische structuren herhalen, in wezen gevonden parallel aan het pial oppervlak van de hersenen. Corticale modules kunnen worden beperkt tot een bepaalde laag4of uitbreiden over meerdere lagen5.
Standaard vectorafbeeldingsbestanden methodes van de hersenen omvatten secties loodrecht op het glasoppervlak van de hersenen, zoals coronale of Sagittaal. Terwijl deze methoden kunnen worden gebruikt om te visualiseren corticale modules, kan een veelheid van interessante eigenschappen worden onthuld wanneer de corticale modules worden gevisualiseerd tangentieel, in een vlak evenwijdig aan het oppervlak van de hersenen. Bijvoorbeeld, somatosensorische modules in de knaagdier hersenen vertegenwoordigen snorharen, worden weergegeven als vaten wanneer gevisualiseerd loodrecht op het glasoppervlak van de hersenen, en dus de regio's de naam vat cortex ontlenen. Echter, op het visualiseren van de vaten in de stand van een tangentiële, onthullen ze een Bakkebaard-kaart, met de vaten wordt vastgelegd in een topografische oriëntatie spiegeling van de exacte indeling van de snorharen op het oppervlak van de externe instantie. In bepaalde gevallen, modulaire regeling is zelfs ontsnapt aan de detectie voor een aanzienlijke periode, wanneer gevisualiseerd op een niet-tangentiële wijze. De mediale Entorinale cortex, staat bekend om de aanwezigheid van cellen van de grid, neuronen die brand in een regelmatige zeshoekig patroon wanneer een dier is het doorlopen van een omgeving. Hoewel het is een zwaar onderzochte gebied, tot onlangs, de aanwezigheid van patches of modules van cellen in de mediale Entorinale cortex, die fysiek zijn neergelegd in een zeshoekig patroon6, was ontsnapt aan detectie. De aanwezigheid en de opstelling van deze modules, in de rat hersenen, werd vergemakkelijkt door het maken van tangentiële secties van de mediale Entorinale cortex en de cytoarchitecture op een layer-wise wijze te onderzoeken.
Na het segmenteren, kan het specifieke aspect van visualisatie van corticale modules ook worden gerealiseerd op meerdere manieren. Klassiek, hebben studies afgebakend modules gebaseerd op cel dichtheid of glasvezel lay-out1. Een andere populaire benadering is het gebruik van cytochroom oxidase histochemie, die gebieden van hogere activiteit8 onthult. Nieuwere benaderingen omvatten kijken naar genetisch bepaalde celtypen, onderscheiden op grond van hun eiwit expressie profielen6,8.
In deze studie markeren we methoden voor het isoleren van de cortex van de hersenen van zoogdieren, verkrijgen van afgevlakte tangentiële secties, en visualiseren van corticale modules op basis van cytochroom oxidase histochemie en immunohistochemistry van celtype specifieke proteïnen.

<table><tbody><tr><td>Cytochrome oxidase staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochroom c uit paardenhart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium nikkel(II) sulfaat hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Antigen retrieval</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitraat dihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citroenzuurmonohydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer/fosfaatbuffer met zoutoplossing/prefix/PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdiwaterstoffosfaat</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Natriumwaterstoffosfaatdihydraat</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Immunohistochemie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k gezuiverd uit kippendarmen, muismonoklonaal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k van recombinant rat calbindin D-28k, konijnenpolyklonaal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Albumine fractie V, biotinevrij</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Montage- of vriesmedia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt (histochemische)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Weefselvriesmedium</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Alcoholdehydratie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Xyleensubstituut</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparaten/gereedschappen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Botenschaar - 24 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar - grote lussen</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van corticale modules in afgeplatte zoogdieren cortices

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

De cortex van de hersenen van zoogdieren is parcellated in verschillende substructuren of modules. Corticale modules meestal parallel aan de corticale blad liggen, en kunnen worden afgebakend door bepaalde histochemische en immunohistochemische methoden. In deze studie markeren we een methode om te isoleren van de cortex van de hersenen van zoogdieren en hen om te verkrijgen van secties parallel aan de corticale blad plat. We verder hoogtepunt geselecteerd histochemische en immunohistochemische methoden voor het verwerken van deze afgeplatte tangentiële secties om te visualiseren corticale modules. Wij voeren in de Somatosensorische cortex van verschillende zoogdieren, cytochrome oxidase histochemie te onthullen lichaam kaarten of corticale modules vertegenwoordigen verschillende delen van het kadaver van het dier. In de mediale Entorinale cortex, een gebied waar raster cellen worden gegenereerd, maken we gebruik van immunohistochemical methoden om te markeren van modules van genetisch bepaalde neuronen die zijn gerangschikt in een rasterpatroon in de corticale blad over verschillende soorten. Wij bieden over het algemeen een kader te isoleren en te bereiden layer-wise afgevlakt corticale secties, en visualiseren van corticale modules met behulp van histochemische en immunohistochemische methoden in een breed scala van zoogdieren hersenen.

Wij verkregen van afgevlakte corticale secties van de Somatosensorische cortex in een verscheidenheid van hersenen en verwerkt ze voor cytochroom oxidase histochemie te visualiseren de somatotopic modules vertegenwoordigen verschillende lichaamsdelen. Deze vergelijkende benadering biedt het bestuderen van de evolutionaire krachten die vorm cortex, bijvoorbeeldzeer geconserveerde vertegenwoordiging van mystacial snorharen in knaagdieren en haasachtigen tonen als vaten<sup class="x...

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het verkrijgen van afgevlakte tangentiële secties van zoogdieren afkomstig cortices en visualiseren van corticale modules met behulp van histochemische en immunohistochemische methoden.

Visualisatie van corticale Modules in afgeplatte zoogdieren Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

Het algemene doel van deze procedure voor cortexplatmaken en kleuring is om cellulaire modules in de corticale gebieden op een gelaagdse manier te visualiseren. Deze methode kan belangrijke vragen in de neurowetenschap beantwoorden, zoals hoe de corticale structuur zich verspreidt in de hersenen, en hoe dit zich kan verhouden tot de functie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat je de corticale architectuur op een laminaire manier kunt vergelijken en verschillende aspecten ervan kunt vergelijken, zoals hoe het is geconserveerd tijdens de klasse-evolutie, of hoe het varieert in functie.De techniek wordt gedemonstreerd door Simon Lauer en Undine Schneeweib, een student en een technicus uit het lab van Professor Michelle Black. Om te beginnen, perfundeer het dier transcardiaal om een homogeen gefixeerd en bloedvrij brein te verkrijgen. Na het verwijderen van het brein, dompel het onder in 0,1 molair fosfaatbuffer.Als secties met grote corticale gebieden gewenst zijn, plat je het brein voor verdere postfixatie. Om echter secties van moeilijker bereikbare gebieden te verkrijgen, zoals de mediale entorhinale cortex, postfixeer je het brein in 4% PFA gedurende 24 uur voordat je het platmaakt. Bereid je voor om het brein gedurende de hele dissectie met buffer vochtig te houden.Om te beginnen, scheid de hemisferen met een scalpel. Als het brein niet is gepostfixeerd, wees voorzichtig bij het hanteren. Vervolgens, terwijl je het brein door het cerebellum vastzet, steek je voorzichtig de spatel in om een dissectievlak in het corpus callosum te openen.De ronde punt van de spatel moet van de cortex afwijzen. Vervolgens manipuleer je de spatel om de thalamus en cortex te verdelen. Scheid vervolgens de subcorticale structuren met een scheermes.Vervolgens scheid je de subcorticale structuren met een scalpel of de rand van de spatel. Om het platmaken te verbeteren, maak je een schone snede door het striatum, nucleus accumbens en orbitale frontale cortex, omdat ze de dikte van de cortex in het laterale gebied verhogen. Voeg vervolgens een ontlastingssnede toe aan de basis van de binnenste regio van de prefrontale cortex.Dit zal het ontvouwen van mediale delen van de cortex mogelijk maken. Leg nu een hemisferencortex op een glasplaat. Plaats vervolgens twee kleicylinders aan beide zijden van het weefsel.De klei moet 10 tot 20% dunner zijn dan het hersenweefsel, omdat de klei de mate van platmaken bepaalt. Plaats vervolgens een glaszijde tangencieel op de cortex, waarbij de laterale portie eerst wordt aangeraakt. Zet vervolgens een gewicht op het glas, waarbij de massa gecentreerd is over de laterale portie.Laat de samenstelling nu drie tot vijf uur zitten in fosfaatbuffer bij vier graden Celsius. Het echte sleutelpunt van deze voorbereiding is om het brein zo plat mogelijk te krijgen, omdat dit de grootste impact heeft op het bekijken van de corticale kaart. Ten slotte, indien nodig, postfixeer je het brein.Breng de platgemaakte hemisfeer over naar 1% PFA, of 2% PFA als deze niet van een geperfundeerd dier is genomen. Laat het vervolgens 24 uur fixeren bij 4 graden Celsius, met zachte agitatie. Was eerst de platgemaakte hemisfeer 15 minuten in fosfaatbuffer.Snijd vervolgens de hemisfeer tangencieel op een Vibratome. Bevestig het weefsel in positie met een kleine hoeveelheid cyanoacrylaat en druk zachtjes. Wees voorzichtig, want te veel lijm kan leiden tot snij-artefacten.Snijd nu de hemisfeer van het dikkere en stabielere uiteinde naar het dunnere uiteinde op de vereiste dikte. Als lage fixatieconcentraties zijn gebruikt, snijdt u het weefsel langzaam met een hoge amplitude. Was vervolgens het gesneden weefsel gedurende 15 minuten met zachte agitatie in hepesbuffer.Tijdens de wassing, bereid je een verse cytochroomoxidase-kleuringsoplossing voor. En voeg de DAB-component toe net voor gebruik. Incubeer nu de secties in de vers gemaakte kleuringsoplossing bij kamertemperatuur met schudder en houd toezicht.Afhankelijk van de hoeveelheid fixatie, kan kleuring in 10 minuten waarneembaar zijn of kan het enkele uren duren. Als de reactie te langzaam verloopt, verhoog de temperatuur tot 37 graden Celsius. Om de reactie te stoppen, breng je de secties over naar een bad met 4% PFA en laat je ze 15 minuten incuberen met zachte agitatie.Was vervolgens de secties drie keer, met hepesbuffer gedurende 10 minuten per wasbeurt. Monteer en droog nu de secties op glasplaten. En dehydrateer ze met progressief sterkere ethanolbaden.Was vervolgens de platen vijf minuten in Isopropanol, gevolgd door vijf minuten in Xyleen. Na het Xyleenbad, voeg je onmiddellijk een snelhardend, niet op water gebaseerd montagemedium toe. Op water gebaseerde media zullen de kleur verstoren.Na het toevoegen van een dekglas, bewaar de platen bij vier graden Celsius tot ze worden geïmager. Corticale secties van de somatosensorische cortex in een verscheidenheid van hersenen werden verwerkt, met behulp van de beschreven procedures. Deze vergelijkende aanpak maakt de studie mogelijk van de evolutionaire krachten die de cortex vormen, zoals de sterk geconserveerde representatie van mistacial vibrissaer bij knaagdieren en lagomorfen als vaten.De architectuur van de mediale entorhinale cortex werd waargenomen in secties parallel aan het schiloppervlak, met behulp van tangencieel snijden van de mediale entorhinale cortex bij muizen, ratten en Egyptische fruitvleermuizen. Bovendien werden menselijke hersenen verwerkt met behulp van zachte platmaking van de cortex en tangenciële plakjes. Alle hersenen werden cryobewaard en gesneden op een cryostaat bij 60 micrometer.Immunokleuring werd gebruikt om calbindine-positieve parameatale celmodules te labelen. In de entorhinale cortex tonen de calbindinemodules een opmerkelijke periodiciteit in elke soort, en variëren in grootte slechts met een factor 10, over een 20.000-voudige variatie in hersengrootte. Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je tangenciële secties voor analyse kunt verkrijgen.Eenmaal onder de knie, kan deze

visualization-of-cortical-modules-in-flattened-mammalian-cortices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Haakse microprisma ingebracht in de muis neocortex maakt diepe beeldvorming van meerdere corticale lagen met een standpunt typisch gevonden in slice. One-millimeter microprisma bieden een breed veld-of-view (~ 900 um) en ruimtelijke resoluties voldoende om dendritische spines op te lossen. We demonstreren laag V neuronale beeldvorming en neocorticale vasculaire beeldvorming met behulp van microprisma.

In vivo beeldvorming van Deep Corticale lagen met behulp van een microprisma

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor...

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

Source: Lauer, S. M., et al. Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates a method to visualize the cortical modules in flattened brain sections using histochemical staining. Pre-fixed sections are treated with a straining reagent that highlights active neural clusters, forming dark, high-contrast regions. After mounting and dehydration, cortical modules appear under a bright-field microscope as dark, patchy patterns.

Histochemical Imaging of Cortical Modules in Flattened Brain Sections

Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een ​​functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

Met behulp van meerdere hoeken om de muis pup hersenen snijden, verbeteren we op een eerder beschreven acute hersenen slice, die de verbindingen tussen de meeste van de grote auditieve middenhersenen en de voorhersenen structuren vangt.

Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming

Hier presenteren we een procedure voor het uitvoeren van grootschalig Ca 2+ beeldvorming met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrij bewegende muizen. Honderden actieve cellen kunnen tegelijkertijd worden waargenomen met behulp van een miniatuur kop microscoop gekoppeld met een geïmplanteerde prisma sonde.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Beeldvorming in vrij bewegende muizen met prisma sonde en geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopie

Dit protocol beschrijft een methode voor gelijktijdige beeldvorming van thalamocortical axon vertakking en de synapse formatie in organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri. Individuele thalamocortical axonen en hun presynaptische terminals worden gevisualiseerd door een eencellige electroporation techniek met DsRed en synaptophysin van GFP-gelabeld.

Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Hier presenteren we twee protocollen voor de registratie van micro-elektrocorticografie met hoge dichtheid (μEcoG) bij ratten en muizen, inclusief chirurgische, implantatie- en registratiemethoden. μECoG-opnames worden uitgevoerd in combinatie met laminaire polytrode-opname in de auditieve cortex van de rat of met optogenetische manipulatie van neurale activiteit in de somatosensorische cortex van de muis.

Multischaalonderzoek van corticale verwerking door integratie van laminaire polytrodes en optogenetica met micro-elektrocorticografie bij knaagdieren

Leer een methode voor het visualiseren van corticale modules in zoogdiercortices door plat te leggen en te kleuren. Deze techniek maakt laagsgewijze analyse mogelijk en helpt onderzoekers bij het vergelijken van corticale architectuur tussen soorten.

Visualisatie van corticale Modules in afgeplatte zoogdieren Cortices

Meer video's verkennen