Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Het algemene doel van deze procedure is om de reparatiemogelijkheden van het plasmamembraan in patiëntencellen met spierdystrofie te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over spierdystrofie, zoals wat de relatie is tussen een bepaalde mutatie en de kinetische eigenschappen van het herstel van het membraan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de mogelijkheid biedt om de kinetische eigenschappen van het herstel van het membraan in realtime in levende cellen te kwantificeren.

Begin met het kweken van fibroblastcellen in een T225 flacon met 40 milliliter groeimedium in een koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Wanneer de cultuur 70 tot 80% confluency bereikt, spoel de cellen twee keer met 40 milliliter PBS per spoeling, gevolgd door de toevoeging van vijf milliliter 0,05% trypsine gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen loslaten, stop de reactie met 40 milliliter vers groeimedium en zaai twee milliliter cellen met een concentratie van 100.000 cellen per milliliter in 35 millimeter collageen-gecoate glazen bodemplaten voor een overnachte incubatie bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Voeg 150 microliter vers serum-vrij medium toe aan één 1,5-milliliter buisje per transfectiecultuur. Voeg vervolgens drie microliter transfectie reagens toe aan elke buis en incubeer de buisjes gedurende minimaal vijf minuten op kamertemperatuur. Terwijl de buisjes incuberen, voeg 175 microliter serum-afgeleid medium en 3,5 microgram dysferline plasmide DNA toe aan een extra 1,5-milliliter buisje per plaat.

Combineer vervolgens 150 microliter van de plasmide DNA-oplossing met 150 microliter van het transfectie reagens in één nieuw buisje per plaat voor een incubatie van 20 minuten op kamertemperatuur. Vervang de volgende ochtend het groeimedium door twee milliliter serum-afgeleid medium. Aan het einde van de incubatie, verdeel de volledige 300 microliter plasmide oplossing gelijkmatig over elke plaat en incubeer de platen gedurende 24 uur in de koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius.

De volgende dag, vervang het plasmide supernatant door vers groeimedium en plaats de platen terug in de incubator voor nog eens 24 uur. Om de cellen voor te bereiden op een twee-foton wondgenezingstest, spoel de getransfecteerde culturen eenmaal met één milliliter Tyrode's oplossing. Voeg vervolgens één milliliter verse Tyrode's oplossing aanvulling met één microliter van 2,5-millimolaire FM4-64 kleurstof toe aan de cellen.

Gebruik vervolgens een omgekeerde confocale microscoop om een doelwit van 0,2 bij twee micrometer te maken in de software van de microscoop en plaats het doelwit aan de rand van het celmembraan zodat de doellijn overlapt en loodrecht op het celmembraan ligt. Selecteer een 543-nanometer helium neon laser om het FM-kleurstoffsignaal te exciteren en een 488-nanometer argonlaser om het GFP-signaal te exciteren en stel de detectiebereiken in op respectievelijk 600 tot 760 nanometer en 500 tot 550 nanometer. Maak vervolgens een tijdreeks van vijf minuten van sequentiële beeldscans.

Om een membraanlaesie te genereren, gebruik een twee-foton laser tot 820 nanometer bij 15% laservermogen met 10 herhalingen om de cellen 25 seconden na het begin van de tijdreeks te bleken. Om de FM4-64 kleurstoffluorescentie te kwantificeren, gebruik de software om een gebied van interesse van zes bij zes micrometer te tekenen en plaats het gebied van interesse naast de wondlocatie binnen de cel. Trek vervolgens de achtergrondwaarde af en deel de netto toename door de fluorescentiewaarde op tijd nul om de relatieve fluorescentiewaarden voor elk tijdstip te berekenen.

Gezonde menselijke fibroblastcellen vertonen lage niveaus van FM4-64 fluorescentieactivatie na laserwonden, terwijl niet-behandelde patiëntfibroblasten een hoge mate van relatieve fluorescentie-intensiteit vertonen na letsel. Patiëntcellen die getransfecteerd zijn met volledige dysferline plasmide vertonen een verminderde relatieve FM4-64 fluorescentie-intensiteit in vergelijking met niet-behandelde patiëntcontroles, maar vergelijkbaar met de fluorescentiewaarden die waargenomen worden in gezonde controles. Terwijl je deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat de cellen langzaam zullen afsterven in de bufferoplossing, dus werk snel en ververs regelmatig naar verse cellen.

Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je de membraanlaesies kunt regenereren met behulp van een twee-foton microscoop en hoe je het membraanherstel in realtime kunt kwantificeren.