Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van chromatinearchitectuur, zoals hoe de 3D-structuur van chromatine de genexpressie en -ontwikkeling kan beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoge resolutie weergave van chromatine architectuur en precies geënsceneerde vliegen embryo's biedt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in chromatineorganisatie en -ontwikkeling, kan men ook bestaande lijnen uit transgene vliegbibliotheken gebruiken om hun effect in chromatineorganisatie te testen.

Om het protocol te beginnen, past u het totale volume van eerder verzamelde embryo's aan op twee milliliter met PBST. Voeg zes milliliter heptaan en 100 microliter van 37% formaldehyde toe aan water. Na het toevoegen van formaldehyde, krachtig schudden de buis op en neer voor een minuut.

De waterige en organische fase zal samen een shampoo-achtige consistentie vormen. Roer het mengsel op een roterende mixer gedurende 10 minuten. Centrifugeren de buis op 500 keer g gedurende een minuut bij kamertemperatuur om embryo's te verzamelen aan de onderkant van de buis.

Aspirate de hele shampoo-achtige vloeistof en gooi het weg, waarbij je ervoor zorgt dat je geen embryo's aanzuit. 15 minuten na de toevoeging van formaldehyde, resuspend de embryo's in vijf milliliter PBST met 125 millimolar glycine. Schud de embryo's een minuut op en neer.

Na het centrifugeren, aspirate de supernatant. Breng met behulp van een pipet van 1.000 microliter een partij van 100 embryo's over naar een klein glazen vat dat geschikt is om te sorteren, bij voorkeur op een donkere achtergrond en plaats deze op ijs. Sorteer embryo's op kerndichtheid en celcyclusstatus met behulp van een naald- of spuitpunt.

Verwijder alle mitotische embryo's herkenbaar aan hun verspreide, niet-nucleaire distributie van EGFP PCNA en embryo's die gedeeltelijk een niet-nucleair GFP-signaal vertonen. Om de sortering te bevorderen, worden referentieembryo's in kerncycli 12, 13 en 14 in elke partij opgesteld om embryo's te matchen met een van de referentieembryo's. Pipette de gewenste embryo's met behulp van een 1.000 microliter pipet.

Breng ze naar een verse buis en leg ze op ijs. Ga door totdat er voldoende embryo's zijn gesorteerd voor het geplande experiment. Spin buizen kort op 100 keer g bij kamertemperatuur.

Verwijder de supernatant en zorg ervoor dat de embryo's zo droog mogelijk zijn om te bevriezen. Flash bevriezen embryo's door het onderdompelen van de buizen in vloeibare stikstof en op te slaan op min 80 graden Celsius. Leg de buizen met ingevroren embryo's op ijs.

De embryo's worden opnieuw opgetrokken in 500 microliters met een ijskoude lysebuffer. Wacht een minuut om het embryo te laten nestelen aan de onderkant van de buis. Maal vervolgens de embryo's met een metalen micro stamper voorgekoeld op ijs dat is ontworpen om strak te passen een 1,5 milliliter microcentrifuge buis.

Om te voorkomen dat de embryo's worden geagiteerd, plaatst u de stamper langzaam totdat deze de onderkant van de buis raakt. Duw naar beneden en maal vervolgens door het draaien van de stamper twee keer in beide richtingen. Til de stamper heel licht op.

Duw nogmaals naar de bodem van de buis en herhaal de slijpprocedure 10 keer of totdat de embryo's volledig zijn gelyseerd. De oplossing moet homogeen zijn en er mogen geen resterende grote stukjes embryo's overblijven. Broed de gehomogeniseerde suspensie op ijs gedurende 15 minuten.

Draai vijf minuten lang op 1.000 g vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en was de pellet door de 500 microliter ijskoude buffer op en neer te brengen. Na een andere spin, gooi de supernatant.

De gewassen pellet opnieuw opblazen in 100 microliter van 0,5%Natrium Dodecyl Sulfaat of SDS. Vervolgens permeabiliseren van de kernen door het uitbroeden van het monster gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius in een verwarmingsblok. Voeg 50 microliter van 10% Triton X100 en 120 microliter water toe.

Veeg op de buis om de inhoud te mengen en de buis 15 minuten in een warmteblok uit te broeden op 37 graden Celsius. Voeg 25 microliter van 10X restrictie enzym buffer en 20 eenheden van vijf eenheden per microliter MBO1. Veeg de buis om de inhoud te mengen en de buis in een hitteblok uit te broeden om het DNA te verteren.

Tel daar nog eens 20 eenheden MBO1 bij op. Zet de incubatie gedurende 90 minuten voort. Na de tweede incubatie van 90 minuten, incuberen de steekproef bij 62 graden Celsius gedurende 20 minuten om de MBO1 inactief.

Voeg vervolgens 18 microliter van 0,4 millimolar biotine 14-dATP, 2,25 microliter van een ongewijzigde 3,3 millimolar dCTP-dGTP-dTTP-mix toe en acht microliter van vijf eenheden per microliter DNA polymerase I Klenow-fragment. Veeg op de buis om de inhoud te mengen en het monster gedurende 90 minuten op 37 graden Celsius uit te broeden. Voeg vervolgens 657 microliter water toe, 120 microliter 10x T4 DNA-ligasebuffer, 100 microliter van 10%Triton X100, zes microliter van 20 milligram per milliliter runderserum albumine en tenslotte vijf microliter van vijf eenheden per microliter T4 DNA-ligase.

Draai vervolgens de buis twee uur zachtjes bij 20 RPM bij kamertemperatuur. Voeg nog eens vijf microliter van vijf eenheden per microliter T4 DNA ligase toe. Blijf nog twee uur draaien en draai vervolgens vijf minuten naar beneden op 2, 500 keer g.

Na centrifugatie, gooi de supernatant. Resuspend de pellet in 500 microliters van extractie buffer en voeg 20 microliter van 20 milligram per milliliter proteinase K.Flick de buis en incubeer de buis om het eiwit te verteren. Voeg 130 microliter van vijf molaire natriumchloride toe en broed 's nachts aan de-crosslink.

De volgende dag, pipette het monster in een nieuwe twee milliliter buis met lage DNA-binding kenmerken. Voeg 0,1x volume van drie molaire natriumacetaat en twee microliter van 15 milligram per milliliter GlycoBlue. Voeg 1,6 volumes pure absolute ethanol toe en keer de inhoud om en ontcubeer het monster 15 minuten bij min 80 graden Celsius.

Na incubatie, centrifugeren de inhoud. Zoek de DNA-pellet die alleen kan worden gespot door de GlycoBlue. Verwijder de supernatant voorzichtig, het verplaatsen van de pipet tip in de buis langs de tegenoverliggende muur van de DNA-pellet.

Was de pellet met 800 microliter van 70% ethanol. Meng het monster door het om te keren en centrifuge het op 20,000 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Verwijder de resterende druppels tijdens deze stap en de volgende wast door ze te duwen uit de buizen met een P10 tip, dan open deksel aan de lucht drogen voor maximaal vijf minuten.

Zodra er geen vloeistof overblijft, voeg 50 microliter van 10 millimolar trischloride toe. Herhaaldelijk pipette de oplossing over het gebied waar de pellet zich bevond om het DNA op te nemen. Voeg een microliter van 20 milligram per milliliter RNase A.Mix door flicking de buis.

Incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten te verteren RNA. Tot slot, bewaar het monster in de vriezer of koelkast tot de bibliotheek voorbereiding. Afbeeldingen van het EGFP PCNA-signaal van elke gesorteerde embryobatch tonen nauwkeurige fase- en celcyclusstatussen van elk embryo voor downstream-experimenten.

Bioanalyzer sporen tonen aan dat de grootteverdeling van DNA-fragmenten na grootteselectie tussen 300 en 700 basisparen is met een maximum op ongeveer 450 basisparen. Hi-C interactie kaarten blijkt dat op nucleaire cyclus 12, weinig Topologically Associated Domains of TAC's worden gedetecteerd die drastisch verandert op nucleaire cycli 13 en 14 wanneer TAC's zijn steeds prominenter en niet-specifieke lange afstand contacten worden uitgeput. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de kralen grondig te wassen en niet om incubatietijden onnodig te verlengen, vooral bij hoge temperaturen, omdat dit kan leiden tot lage kwaliteit Hi-C bibliotheken.

Deze techniek die nauwkeurige enscenering en chromatinebevestigingstoewijzing met hoge resolutie combineert, maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van epigenetica om de rol van driedimensionale chromatineorganisatie in een in vivo ontwikkelingsomgeving te verkennen.