Name: Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer hoe laminaire stromingstesten leukocytenadhesie aan vasculaire cellen en bloedplaatjes onderzoeken. Deze kosteneffectieve methode biedt inzicht in ontstekingsmechanismen en is toepasbaar op diverse experimentele omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Martin M. Schmitt en lijn-Fraemohs. Dit werk werd gesteund door de Nederlandse Stichting voor wetenschappelijkonderzoek (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR Nr. 1638) en het Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) toegekend aan R.R.K.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de medisch-ethische en dier ethische Boards van Universiteit Maastricht.
1. op stroming gebaseerde Assay met menselijke cellen
<ol><li>
Isolatie van bloedplaatjes uit menselijk bloed
	<ol>
<li>Citraat (3,2%) antistollingsmiddel veneuze bloed trekken.</li>
		<li>Voeg 1/15 hoeveelheid zuur citraat Dextrose toe (ACD: 80 mM Trinatriumcitraat citraat en citroenzuur 52 mM 183 mM glucose) naar het bloed.</li>
		<li>Centrifugeer bij 350 x g zonder rem voor 15 min te verkrijgen van bloedplaatjes rijk plasma (PRP).</li>
		<li>Het supernatant overbrengen in een conische tube van 15 mL en voeg 1/20 ACD hoeveelheid toe.</li>
		<li>Centrifugeer bij 1.110 g zonder rem voor 15 min te verkrijgen van bloedplaatjes arme plasma (PPP).</li>
		<li>Verwijder het supernatant. Afgesneden van het einde van het uiteinde van de pipet (P-1000), waardoor het brede droeg, welke hulpmiddelen bij de preventie van bloedplaatjes activering en zorgvuldig Suspendeer de pellet bloedplaatjes in hetzelfde volume als PRP in bloedplaatjes buffer pH 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1% bovien serumalbumine en 0,1% glucose). Voeg 1/20 volume van ACD en zachtjes meng.</li>
		<li>Pellet de bloedplaatjes 1.110 g zonder rem gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en Suspendeer zorgvuldig de bloedplaatjes als hierboven in 1 mL bloedplaatjes buffer (pH 7.5).</li>
		<li>Het meten van de concentratie van de bloedplaatjes in een verdunning van 1/10 met een geautomatiseerde hematologie analyzer.</li>
		<li>Regel het volume met bloedplaatjes buffer (pH 7.5) om een telling van 2 x 107/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolatie van polymorfonucleaire cellen uit menselijk bloed (aangepast uit Brinkmann et al. 11 )
	<ol>
<li>Tekenen 24 mL bloed in heparine (10 U/mL) als antistollingsmiddel.</li>
		<li>Voeg 6 mL van 1.077 g/mL dichtheid polysucrose-natrium diatrizoate medium (Zie Tabel van materialen) naar een conische buis 15 mL, en zorgvuldig laag 5-6 mL bloed op de top.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 20 min op 800 x g zonder rem.</li>
		<li>Gecombineerd en negeren de duidelijke gelige toplaag en overdracht van de lagere roodachtig fase met granulocyten in vers 15 mL conische buizen. Wassen cellen door toevoeging van PBS met 2 mM EDTA tot een eindvolume van 14 mL en Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g zonder rem.</li>
		<li>In de tussentijd bereidt een kleurovergang medium dichtheid (bijvoorbeeld, percoll, Zie Tabel van materialen) werkende oplossing door het mengen van 18 mL dichtheid kleurovergang medium met 2 mL 10 x stockoplossing van PBS. Verdun deze werkoplossing met PBS (1 x) te verkrijgen van 4,25 mL elk van 85%, 80%, 75%, 70% en 65% kleurovergang middellange oplossingen.</li>
		<li>Bereiden 2 conische buisjes met het verloop van de dichtheid van 2 mL van elke middelgrote percentage boven op elkaar stapelen. Beginnen met de hoogste concentratie en ga verder in aflopende volgorde. Mark de lagen op de buis met een waterdichte marker.</li>
		<li>Zorgvuldig laag 2 mL van de cel schorsingen op elk van de twee bereid verlopen.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 20 min op 800 x g zonder rem in een zorgvuldig uitgebalanceerde centrifuge.</li>
		<li>Na het centrifugeren, het verwijderen van de bovenste laag en de meeste van de 65% laag (eerste ring) met PBMCs en verzamelen in nieuwe buizen de resterende interfasen tot de 85% laag wit (tweede ring, PMN).</li>
		<li>Wassen cellen door het invullen van de buizen met PBS 2 mM EDTA en Centrifugeer gedurende 10 min op 300 x g zonder rem.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en schorten gesedimenteerd cellen (meestal ≥95% PMN) in 1 mL Henks buffer (pH 7,45), met 10 mM Hepes en 0,2% menselijke albumine (Assay buffer).</li>
		<li>Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en cellen op 1 x 106/mL op te schorten.</li>
		<li>Ga verder met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van aanhangend bloedplaatjes- en vasculaire cel-monolayers
	<ol>
<li>
Cel cultuur schotel voorbereiding (gekweekte cellen)
		<ol>
<li>Vooraf jas de 35 mm cel cultuur gerechten met 1 mL verdunde rat staart collageen (30 µg/mL verdund in PBS gefilterd over een 0,2 µm filter).</li>
			<li>Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, negeren de collageen-oplossing, en wassen van de schotel een keer met PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Cultuur van vasculaire cellen in cultuur gerechten
		<ol>
<li>Loskoppelen van de primaire (bijvoorbeeld, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) of vereeuwigd vasculaire cellen (bijvoorbeeld, EA. Hy926, SVEC) uitgegroeid tot samenvloeiing in een maatkolf van T75 met 1,5 mL cel detachement (bijvoorbeeld, accutase). Voeg 4.5 mL passende groeimedium neutraliseren de mobiele-detachement oplossing te bepalen van de concentratie van de cel met een cel tellen kamer. Opschorten van de cellen bij 0,5 x 105 cellen/mL in passende groeimedium (b.v., het groeimedium volledig endothelial cel).</li>
			<li>Voeg 2 mL celsuspensie aan elk gerecht van 35 mm. De cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2 cultuur tot samenvloeiing (waarbij 24-48 h, afhankelijk van het celtype).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Glas dekglaasje aan voorbereiding (aanhangend bloedplaatjes)
		<ol>
<li>Dompel het glas dekglaasje aan eens in de HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).</li>
			<li>Spoel het dekglaasje aan 2 keer in ultrazuiver water.</li>
			<li>Droog het dekglaasje aan onder N2.</li>
			<li>Pre jas het dekglaasje glas aan met 100 µL, overeenkomstig het standpunt van het kanaal van de kamer van de perfusie van verdunde rat staart collageen type I (30 µg/mL verdund in PBS gefilterd over een 0,2 µm filter).</li>
			<li>Incubeer gedurende 30 min op RT, negeren de collageen-oplossing en wassen het dekglaasje aan 3 x met PBS.</li>
			<li>Blok de collageen gecoat dekglaasje aan met 1% BSA in HEPES voor 0.5 h op RT.</li>
			<li>Wassen en drogen van het dekglaasje aan en dit koppelen in de bedwelmingsruimte perfusie. Bloedplaatjes van menselijke of muis bloed zoals beschreven in stap 1.1 of 2.1, respectievelijk te isoleren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immobilisatie van bloedplaatjes
		<ol>
<li>Voeg 70 µL van een schorsing van 2 x 107/mL bloedplaatjes per kanaal en incubeer gedurende 1,5 uur op 37 ° C en 5% CO2.</li>
			<li>Zorgvuldig vervangen door niet-aanhanger bloedplaatjes blokkerende oplossing (5% BSA in HEPES) voor minstens 30 min op RT. doorgaan met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Stimulatie van vasculaire cel enkelgelaagde
		<ol>
<li>De vasculaire cellen stimuleren door het vervangen van de media met verse medium met 10 ng/mL Tumornecrosefactor α (TNFα) voor 4 uur bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. stroom gebaseerde Assay met lymfkliertest cellen
<ol><li>
Isolatie van bloedplaatjes uit bloed van de muis
	<ol>
<li>Loting bloed door cardiale punctie met behulp van een naald 21 G (~ 1 mL) van verdoofd (ketamine 80 mg/kg en medetomidine 0,3 mg/kg) 6 – 8 week-oude muizen (C57Bl/6) in citraat (3,2%) als antistollingsmiddel.</li>
		<li>Voeg 1/6 ACD hoeveelheid toe.</li>
		<li>Centrifuge op 220 x g, middellange rem voor 5 min te verkrijgen van bloedplaatjes rijk plasma (PRP).</li>
		<li>Het supernatant (~ 600 µL) plus 1/3 van de rode bloedcellen overbrengen in een nieuwe buis</li>
		<li>Centrifugeer bij 95 x g zonder rem voor 6 min.</li>
		<li>Het supernatant (PRP) overbrengen en meten van de concentratie van de bloedplaatjes in een verdunning van 1/10 in Tyrode de buffer (TH buffer: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0.42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, 0,1% bovien serumalbumine en 0,1% glucose) met een geautomatiseerde hematologie analyzer.</li>
		<li>Wassen van de bloedplaatjes door het toevoegen van 1/25 volume van ACD + 0,1 U/mL apyrase, samen en centrifugeer bij 2.870 g, middellange rem gedurende 2 minuten.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en 600 µL TH buffer, 1/10 volume van ACD en 0.1 U/mL apyrase toevoegen. Afgesneden de Pipetteer tip (P-1000), droeg waardoor het brede, die helpt bij het voorkomen van bloedplaatjes activering, en zachtjes schorten de pellet.</li>
		<li>Centrifugeer bij 2.870 g, middellange rem gedurende 2 minuten</li>
		<li>Verwijder het supernatant en voorzichtig het opschorten van de bloedplaatjes in TH buffer.</li>
		<li>Regel het volume met TH buffer om een telling van 2 x 107/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van aanhangend bloedplaatjes monolayers
	<ol>
<li>Glas dekglaasje aan (aanhangend bloedplaatjes) per 1.3.3 voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immobilisatie van bloedplaatjes
	<ol>
<li>Voeg 100 µL van een schorsing van 2 x 107/mL bloedplaatjes per kanaal en incubeer gedurende 1,5 uur op 37 ° C en 5% CO2.</li>
		<li>Zorgvuldig vervangen door niet-aanhanger bloedplaatjes blokkerende oplossing (5% BSA in HEPES) voor minstens 30 min op RT. doorgaan met fluorescerende labeling en perfusie van leukocyten (stap 3.3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimulatie van muis bloedplaatjes enkelgelaagde
	<ol>
<li>Voorafgaand aan de perfusie van leukocyten (stap 3.3), de bloedplaatjes te stimuleren door perfusie van trombine (0,5 nM) in HHHSA buffer gedurende 3 minuten bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fluorescerende Labeling en perfusie van leukocyten (PMN of THP-1 voor mens en RAW264.7 of primaire muisknop monocyten voor lymfkliertest Flow gebaseerde Assay)
<ol><li>
Fluorescerende etiketten
	<ol>
<li>Label de leukocyten (1 x 106/mL) met de cel-permeant groen fluorescent nucleïnezuur vlek (1 µM). Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>De cellen met PBS door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen en schorten cellen tot een concentratie van 0,5 x 106 cellen/mL (5 mL per testvoorwaarde, afhankelijk van het debiet) in assay buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Flow kamer assay voorbereiding
	<ol>
<li>Voor de hechting van de leukocyten op een cel enkelgelaagde, negeren het kweekmedium van de cel van de schotel, en omgezet in stroom aanwezig. Buizen verbinden met de spuit. Voor de hechting van de leukocyten op geïmmobiliseerdet bloedplaatjes, verbinden met de micro dia de spuit. Vooraf warm een waterbad 37 ° c.</li>
		<li>Neem een perfusie spuit (50 mL), installeren spuit op de spuit houder, en de pomp op trekken modus. Stelt het volume van de pomp tot 0 mL, en de diameter tot 26.70 mm voor de 50 mL spuit.</li>
		<li>Sluit een kniestuk luer aan één uiteinde van de buis. Plaats een luer lock koppelstuk aan de spuit en verbind de slang met de elleboog luer aansluiting om de luer lock koppelstuk. Sluit het uiteinde van de gratis buis aan de kamer van de stroom.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leukocyten perfusie en hechting
	<ol>
<li>Voor de hechting van de leukocyten op een cel enkelgelaagde, negeren het kweekmedium van de cel van de schotel, en omgezet in stroom aanwezig. Buizen verbinden met de spuit. Voor de hechting van de leukocyten op geïmmobiliseerdet bloedplaatjes, verbinden met de micro dia de spuit.</li>
		<li>Voor leukocyten perfusie en hechting over een vasculaire- of bloedplaatjes enkelgelaagde, plaats van de tweede buis in een conische buis van 50 mL, met assay buffer en vul buizen met 1 mL pipet, dan knijp van de buis en sluit u deze aan een stroom-kamer.</li>
		<li>Voorafgaand aan de leukocyten perfusie,2 CaCl 3 mM en 2 mM MgCl2 toevoegen aan de celsuspensie en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Perfuse assay buffer vóór perfusie van cellen te verwijderen mogelijk lucht uit de kamer en buizen.</li>
		<li>Nauwe buis eindigt door knijpen ze strak en schakelaar buizen uit assay buffer te celsuspensie, luchtbellen voorkomen overlappingsbreedte. Perfuse cellen met passende stroom tarief/schuifspanning totdat de eerste cellen aankomen.</li>
		<li>Perfuse cellen met passende stroom tarief/schuifspanning gedurende 2 minuten, en ten minste 6 foto's tussen 2 – 6 min etappen te verwezenlijken, Adherente cellen met een omgekeerde fase contrast/fluorescentie Microscoop (bijvoorbeeldEVOS-FL) vastleggen met behulp van 100 X vergroting aangesloten voor een digitale CCD of CMOS camera. Opmerking: Flow rate/schuifspanning hangt flow kamer afmetingen en viscositeit van perfusaat. Voor perfusie kamer hier gebruikt (Zie Tabel van materialen): Τ =η* 97.1*Φ Τ: schuifspanning (1 dyn/cm2) Η: viscositeit (0,015 dyn * s/cm2) Φ: debiet (0,67 mL/min)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leukocyten ambtshalve hechting
	<ol>
<li>Voor de-adhesion, schakelen buis van celsuspensie aan assay buffer door uitknijpen de slang, luchtbellen voorkomen steeds gevangen</li>
		<li>Loskoppelen cellen door perfusie met assay buffer met een passende stroom tarief/schuifspanning (zie 3.3.7 Opmerking).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leukocyten zielsverhuizing
	<ol>
<li>Voor leukocyten zielsverhuizing, perfuse leukocyten (stap 3) totdat een voldoende hoeveelheid van leukocyten houden (~ 50 cellen/weergaveveld).</li>
		<li>Leukocyten schorsing vervangen door assay buffer.</li>
		<li>Record transmigrating cellen tegen tijd vervallen elke 10-15 s gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+engagement+of+platelet+glycoprotein+Ibalpha+via+the+integrin+Mac-1+is+critical+for+the+biological+response+to+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury.</a> Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).</li>
<li>Zhao, Z., Vajen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+junctional+adhesion+molecule+A+from+platelets+increases+early-stage+neointima+formation+after+wire+injury+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice.</a> Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).</li>
<li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα.</a> Nature communications. 8, 15559(2017).</li>
<li>Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016793170200494X">PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications.</a> Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).</li>
<li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386106013061">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze in vitro -test is een eenvoudige methode om te onderzoeken van de onderliggende mechanismen van leukocyten aanwerving tijdens vasculaire ontsteking, maar er zijn een aantal kritische punten te worden opgemerkt. De eerste voorwaarde voor het succesvol uitvoeren van deze test is de perfusie van leukocyten over een intact en confluente vasculaire of bloedplaatjes enkelgelaagde. Dit kan worden bereikt door voorafgaande coating van de oppervlakken met collageen type I. In het algemeen, bij het werken met primair...

Op verwonding, ontsteking of infectie beantwoorden leukocyten snel aan pathogen - of schade-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs, DAMPs) omzetten in een geactiveerde staat, en verlaat de bloedstroom naar sites van ontsteking en weefsel schade. Het vermogen van leukocyten om te interageren met hun omgeving cellulaire en moleculaire is essentieel voor de juiste functie als immune cellen, zoals benadrukt door genetische afwijkingen zoals leukocyte hechting deficiëntie1. Leukocyten hechting is het onderwerp van intensief onderzoek de afgelopen decennia geweest en dit heeft geresulteerd in het concept van de leukocyten hechting cascade in de vroege jaren 19902,3. Leukocyten hechting wordt geïnitieerd door de selectine-gemedieerde vangst van leukocyten aan het endotheel, waardoor de cellen om te rollen over de vasculaire oppervlak. Deze rollen kan leukocyten te scannen voor endotheel-afhankelijke trekkende signalen, bijvoorbeeld, chemokines, die de activering van de integrins induceren. Vervolgens bemiddelen de geactiveerde verschijnsel de binding aan endothelial liganden, wat resulteert in krachtige leukocyte arrestatie. Leukocyten kunnen vervolgens bereiden op extravasate door kruipen en verspreiden, voordat het endotheel enkelgelaagde doordringen en transmigrating in het onderliggende weefsel. Het basisconcept van de canonieke leukocyte cascade heeft grotendeels onveranderd gebleven sinds de invoering ervan, met enkele tussenstappen toegevoegd4. Niettemin, de exacte moleculaire mechanismen en de rol van de vele spelers die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten nog niet zijn opgehelderd tot nu toe, en leukocyten werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en (auto-) immuun onderzoek.
Bijvoorbeeld verhoogd tijdens vasculaire ontstekingsziekten zoals atherosclerose, leukocyte inlijving in het vaartuig muur stations plaque ontwikkeling. Unstable atherosclerotische plaques kunnen scheuren, leidt tot massale activering van bloedplaatjes en het systeem van de coagulatie, en vervolgens tot occlusie van het vaartuig5. Dit kan resulteren in ernstige cardiovasculaire uitkomsten zoals een hartinfarct of beroerte. Daarnaast endothelial denudatie als het optreedt klinisch, bijvoorbeeld na stenting van een kransslagader, leidt tot een veelheid van interacties van leukocyten en trombocyten naar de blootgestelde vaartuig muur binnenland (b.v., matrix onderdelen en glad spier cellen) en leukocyten met bloedplaatjes die betrekking hebben op de vasculaire verwonding. Deze interacties zijn belangrijk voor de verdere ontwikkeling van de ziekte zoals monocyt-bloedplaatjes interacties6,7van de vorming van de neointima zou rijden. Bovendien, bloedplaatjes-leukocyte interacties gemedieerd door leukocyten integrine Mac-1 (αMβ2) en bloedplaatjes GPIbα hebben onlangs geïdentificeerd als roman bestuurders van trombose in muizen8.
Gezien de brede beschikbaarheid van mens en dier bloed als een bron van leukocyten en trombocyten voor onderzoek en het brede spectrum van moleculen van geïsoleerde matrix en vereeuwigd cellijnen van leukocyten en vasculaire oorsprong, is het mogelijk te simuleren van leukocyten interacties onder stroom in een laboratorium instellen, met behulp van speciaal ontworpen stroom perfusie kamers. Vele varianten hebben ontwikkeld in de afgelopen decennia, variërend van vacuüm-gedreven aan zelfklevende perfusie kamers. Alle varianten hebben gemeen dat het onbeweeglijke gedeelte (bijvoorbeeld, gekweekte vasculaire cellen of matrix eiwitten) is geassembleerd tot een grotere lekvrije kamer uitgerust met een vooraf gedefinieerde kanaal perfusie van vloeistoffen inschakelen via het onbeweeglijke gedeelte. Vooruitgang in technologie molding ingeschakeld bovendien de ontwikkeling van op maat gemaakte oplossingen op basis van silica polymeren9. De viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal voornamelijk de schuifspanning kenmerken van de stroom perfusie apparaat10te bepalen. In dit artikel presenteren we een studie van de onderliggende mechanismen van de hechting-, ambtshalve hechting is de methode van in vitro en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. Het voordeel van de methoden die hier gepresenteerd is dat ze kunnen worden uitgevoerd met behulp van een gemeenschappelijk camera-aangesloten fluorescentie Microscoop, en geen een onderzoekers vereisen te hoge technische bekwaamheid bezitten. De in vitro -assay kan worden gemanipuleerd in vele opzichten (bijvoorbeelddoor het toevoegen van remmers of blokkeren van antilichamen), en is dus die van toepassing zijn in verschillende modellen van vasculaire ontsteking en laat het onderzoek wrijvingscoëfficiënt eiwitfuncties of de evaluatie van specifieke verbindingen.

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pump bijv. model: 210-CE</td><td>&nbsp;world precision instruments</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC-behandelde Easy-Grip Style Cell Cultuur Dish</td><td>corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL spuit</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen slang&nbsp;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Elbow Luer Connector Male</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer Lock Coupler</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Flow chamber</td><td>University Hospital RWTH Aachen</td><td></td><td>Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&ouml;mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml;ngen an Zelloberfl&auml;chen. 2005.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ibidi sticky slide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Dekvlakken voor sticky slides&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Collagene Type I, rat staart</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-&alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 groene fluorescerende nucleïnezuurvlek</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&rsquo; Balanced Salt Solution 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES bufferoplossing 1M, vloeibaar</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE Albumine, 25%&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Water voor injectie</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydraat</td><td>Merck</td><td>102382&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydraat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel Groei Medium (Klaar-voor-gebruik)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Cell Basal Medium&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Endotheelcel Groei Kit-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelial cell line, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Human monocytic cell line, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 met Ultra-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monocyte/macrophage RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp;Vacutainer Plastic Bloedopvangbuisjes met Natrium Heparien</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%&nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>HCl/EtOH mengsel (1,2 mol/L HCl en 50% ethanol) in water</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Bereid door 0,3L HCl (4 mol/L) te mengen met 0,7L van 70% v/v ethanol in een afzuigkap</td><td></td></tr></tbody></table>

laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

De aanwerving van de leukocyten op letsel of ontsteking naar sites van letsel of weefselbeschadiging van het is onderzocht tijdens de afgelopen decennia en heeft geleid tot het concept van de leukocyten hechting cascade. Echter, de exacte moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten hebben niet nog volledig geïdentificeerd. Aangezien leukocyte werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en immuun onderzoek (auto-), presenteren we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde bepaling aan de studie van de onderliggende mechanismen van de hechting, ambtshalve adhesie, en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. De in vitro -assay kan worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners in verschillende modellen van vasculaire ontsteking. Dit protocol beschrijft een laminaire flow gebaseerde bepaling met behulp van een parallel-flow kamer en een omgekeerde fasecontrastmicroscoop aangesloten op een camera te bestuderen van de interacties van leukocyten en endotheliale cellen of Trombocyten, die kunnen worden gevisualiseerd en vervolgens geregistreerd off line geanalyseerd. Endotheliale cellen, bloedplaatjes of leukocyten kunnen worden voorbehandeld met remmers of antilichamen te bepalen van de rol van specifieke moleculen tijdens dit proces. Schuintrekken voorwaarden, d.w.z. arteriële of veneuze schuifspanning, kunnen gemakkelijk worden aangepast door de viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal.

Studeren endotheel-leukocyte hechting, werden fluorescently geëtiketteerde THP-1 cellen over een TNFα - of niet-gestimuleerd endothelial enkelgelaagde gedurende 2 minuten op 3 dyne/cm2geperfundeerd. Het totale aantal aanhangend monocytic cellen werd vastgesteld na 2 min van perfusie door het vastleggen van 6 onafhankelijke velden over een periode van 2-6 min. De Adherente cellen werden gekwantificeerd in ten minste 6 foto's gevangen met een omgekeerde fase contrast/fluorescenti...

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Het algemene doel van dit experiment is om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de interacties van leukocyten met adherente vasculaire cellen of bloedplaatjes onder stromingsomstandigheden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de immunologie, zoals hoe leukocyten worden gerekruteerd naar ontstekingsplaatsen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kosteneffectief is, gebruiksvriendelijk en toelaat om een grote verscheidenheid aan experimentele omstandigheden te onderzoeken.Deze methode kan inzicht geven in leukocytenadhesie. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals de adhesie van tumorcellen aan geïmmobiliseerde cellen of substraten onder stromingsomstandigheden. Het demonstreren van de procedure zal Annemiek Dickhout zijn, een ingenieur en een promovendus die in mijn laboratorium werkt.Na het verkrijgen van bloedmonsters, voeg 1/15de volume zuur citraat dextrose toe aan het bloed. Centrifugeer vervolgens het bloedmonster door de remmen uit te zetten bij 350 keer g gedurende 15 minuten om bloedplaatjesrijk plasma te verkrijgen. Breng vervolgens het verkregen supernatant over naar een 15 mil

laminar-flow-based-assays-to-investigate-leukocyte-recruitment-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De hechting van bloedplaatjes cascade vindt plaats in het bijzijn van shear flow, een factor niet goed voor in conventionele (statisch) goed-plaat assays. In dit artikel wordt verslag gedaan van een bloedplaatjes-aggregatie assay gebruik maakt van een microfluïdisch goed plaat formaat om fysiologische afschuifstroming omstandigheden na te bootsen.

Bloedplaatjes adhesie en aggregatie Onder Flow met behulp van Microfluïdische Flow Cellen

We beschrijven een methode om onder hechtende cellen aan laminaire stroming shear stress in een steriele continue stroom circuit. De cellen 'hechting, kan morfologie worden bestudeerd door de transparante kamer, monsters verkregen van het circuit voor de metaboliet-analyse en-cellen geoogst na afschuiving blootstelling voor toekomstige experimenten of cultuur.

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

This video demonstrates a laminar flow-based assay to characterize the interaction of leukocytes and cellular partners such as endothelial cells. This method provides dynamic insights into adhesion, deadhesion, and transmigration of leukocytes when perfused over an intact and confluent layer of vascular cells.

A Laminar Flow-Based Assay to Study the Interactions Between Leukocytes and Endothelial Cells

The video demonstrates a method for investigating the impact of stromal cells on leukocyte recruitment. In a parallel plate flow chamber model, pro-inflammatory cytokines induce the expression of adhesion receptors by endothelial cells, facilitating neutrophil recruitment and migration. The cross-talk between stromal cells and endothelial cells diminishes neutrophil recruitment to the endothelial cells.

An In Vitro Flow Investigation of the Effect of Stromal Cells on Leukocyte Recruitment

Leukocyten rekrutering naar de lever plaatsvindt binnen de gespecialiseerde kanalen van de lever sinusoïden die worden omzoomd door unieke lever sinusoïdale endotheelcellen. Fasecontrastmicroscopie van werving leukocyten over humane lever sinusvormige endotheel onder omstandigheden van fysiologische shear stress kan de ontrafeling van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces te vergemakkelijken.

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Hier presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker leukocytaantrekking dynamiek ex vivo evaluatie door er een kamer bekleed met endotheliaalverkregen adhesiemoleculen aan het circulatiesysteem van een muis. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen, omdat het zorgt voor leukocyten beoordeling op grond van de relatieve biologische omstandigheden.

Het beoordelen Leukocyte-endotheliale Interacties Onder stroomtoestanden in een Ex Vivo Autoperfused microflow Kamer Assay

Het vermogen van ontstoken endotheel om leukocyten werven van stroom wordt geregeld door mesenchymale stromale cellen. We beschrijven twee in vitro modellen die primaire humane cellen die kunnen worden gebruikt om neutrofielen werving beoordelen van stroom en onderzoekt de rol van mesenchymale stromale cellen spelen in het reguleren van dit proces.

Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methode voor het bestuderen van bloedplaathechting, verspreiding en afscheiding onder stroming. Dit veelzijdige platform maakt het mogelijk om bloedplaatjesfunctie te onderzoeken voor mechanistisch onderzoek naar trombose en hemostase.

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.

Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Dit stapsgewijze protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van de experimentele opstelling en data-analyse voor de beoordeling van inflammatoire reacties in hiPSC-ECs en de analyse van leukocyten hechting onder fysiologische stroom.

Microfluidic Assay voor de beoordeling van leukocyten hechting op menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide endotheliale cellen (hiPSC-ECs)

Leer hoe laminaire stromingstesten leukocytenadhesie aan vasculaire cellen en bloedplaatjes onderzoeken. Deze kosteneffectieve methode biedt inzicht in ontstekingsmechanismen en is toepasbaar op diverse experimentele omstandigheden.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes (Video) | JoVE Journal

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Meer video's verkennen