Name: Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Leer een ex vivo-cultuurmethode voor Drosophila-larvenhersenen met fluorescentie-tijdsverloopbeeldvorming. Deze techniek maakt circadiane ritmestudies op eencellig niveau mogelijk voor neurogenetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Michael Rosbash voor zijn mentorschap en ondersteuning tijdens de eerste fase van de ontwikkeling van deze methode. Dit werk werd gefinancierd door het JST PRESTO programma, de Swiss National Science Foundation (31003A_149893 en 31003A_169548), de European Research Council (ERC-StG-311194), Novartis Foundation for Medical-biomedisch onderzoek (13A39) en de Universiteit van Genève .

1. voorbereiding van de stamoplossingen onder de motorkap van een cultuur
<ol><li>Bereiden van 400 mL 1 x Schneider actieve Medium (SAM) geoptimaliseerd voor ex vivo cultuur van larvale hersenen (gewijzigd van referentie24,25) (tabel 1). Aliquot tot 5 mL en flash bevriezen in vloeibare stikstof (LN2), op te slaan bij - 80 ° C.</li>
	<li>1 x ontrafeling zoutoplossing (DSS) bereid door verdunning 10 x stockoplossing (gewijzigd van referentie26) (tabel 2).</li>
	<li>Aliquot fibrinogeen 10 mg te bewaren bij 4 ° C voor een eenmalig gebruik. Let op: Weeg fibrinogeen onder laminaire flow, het dragen van handschoenen, want het is schadelijk.</li>
	<li>Bereiden van trombine stockoplossing in SAM (1500 NIH eenheid/mg) en aliquoot aan 10 µL, flash bevriezen in LN2 en houden bij-80 ° C. Let op: Draag handschoenen bij het verwerken van trombine, want het is schadelijk.</li>
	<li>Aliquot stockoplossing van 100 x penicilline-streptomycine. Houden bij-20 ° C.</li>
	<li>Snijd de cirkels van polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan (Zie materialen tabel) naar het formaat dat overeenkomt met de binnenkant van een glazen bodem schotel. Spoel ze in 70% EtOH en vervolgens in een gesteriliseerde met autoclaaf dH2O. Sterilize en droog onder laminaire flow met UV. Houden in een steriele petrischaal. Eenmalig gebruik. Opmerking: PTFE is een poreuze flexibele membraan die staat gasuitwisseling toe en verhindert dat medium verdampen tijdens langdurige opname.</li>
</ol>2. time-lapse microscopie Setup
Opmerking: De volgende installatie is voor een tandem scanner omgekeerde confocal microscoop (Zie materialen tabel) uitgerust met een resonante scanner (8.000 Hz). Het systeem omvat een uiterst gevoelige foto-multiplier detector, die samen met de resonant scanner fototoxiciteit en photobleaching voorkomen. Temperatuur en de vochtigheidsgraad worden gecontroleerd binnen een Microscoop milieu kamer (Zie Materialen tabel) dat behandelt de meeste van de Microscoop.
<ol><li>Plaats een etappe-top vochtigheid kamer.</li>
	<li>Inschakelen van de temperatuur en vochtigheid-controllers equilibreer de Microscoop zaal tot 25 ° C en 80% luchtvochtigheid.</li>
	<li>Voor het uitvoeren van experimenten in constante duisternis (DD), dekken de Microscoop milieu zaal met een ondoorzichtig doek (tenzij de Microscoop kamer is gemaakt van een ondoorzichtig materiaal).</li>
	<li>Als met behulp van een water-onderdompeling doelstelling, plaatst u een Water onderdompeling Micro Dispenser op de top van de doelstelling en een protocol met de Autoimmersion doelstelling Controller-software af te zien van water met een constante snelheid tijdens time-lapse imaging program. Opmerking: Water-onderdompeling doelstellingen samen met een water dispenser of droge objectief worden aanbevolen voor lange termijn levende imaging, zoals andere type van onderdompeling medium zou uitdrogen.</li>
	<li>Plaats een petrischaal houder in het werkgebied, binnenkant van de kamer vochtigheid.</li>
	<li>Start de Microscoop software en selecteer de modus resonant scanner in het eerste dialoogvenster. Kies OK om te initialiseren het werkgebied wanneer daarom wordt gevraagd. Ga naar tabblad Configuratie en Hardware configuratie om over te schakelen op de relevante laserlijnen.</li>
	<li>Gaat naar ophaal tabblad en XY deelvenster selecteren bidirectionele modus en afbeelding overname parameters instellen. Opmerking: De beschreven imaging setup hier gepresenteerd (Figuur 2en Figuur 3 film 1) is geoptimaliseerd voor het observeren van circadiane expressie van specifieke fluorescerende verslaggevers. De volgende parameters werden gekozen tot het beste passen bij onze specificaties: 40 X water onderdompeling doelstelling, 8 X lijn gemiddelde met 512 × 512 beeldresolutie. Voor multicolor imaging, sequentiële Beeldacquisitie is nodig wanneer de golflengte van de emissie van een fluorophore en de golflengte van de excitatie van een andere overlapping (hier, golflengten van gele fluorescerende eiwit (YFP) emissie en tomaat excitatie overlapping). Kies de sequentiële modus "tussen stapel" zoals het is de snelste en het verkeer van klok neuronen te verwaarlozen tijdens de overname van een Z-stack is. Microscopie instellingen moeten worden aangepast aan het doel van elk experiment.</li>
</ol>3. setup van larvale hersenen Explant cultuur
Opmerking: Het hele procédé vanaf dissectie te embedding van hersenen explantaten duurt ~ 30 min.
<ol><li>
Bereiding van reagentia onder de motorkap van een cultuur.
	<ol>
<li>Ontdooi een aliquoot gedeelte van trombine en houden bij kamertemperatuur totdat de insluiten stap (stap 3.3). Eenmalig gebruik.</li>
		<li>Snel ontdooien van een aliquoot deel van SAM bij 37 ° C en houd op ijs voor een eenmalig gebruik.</li>
		<li>SAM toevoegen aan een hoeveelheid van 10 mg van fibrinogeen tot 10 mg/mL, flick zachtjes en Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten, en tijdens het insluiten stap (stap 3.3). Eenmalig gebruik. Opmerking: Niet broeden de fibrinogeen oplossing meer dan 2 h als het begint te polymeriseren.</li>
		<li>Ontdooi een aliquoot gedeelte van 100 x voorraad penicilline-streptomycine. Bereiden van 2.5 mL van SAM met 1 x penicilline-streptomycine (SAM/antibiotica). Bewaren bij kamertemperatuur. Opmerking: Winkel de resterende 100 x voorraad penicilline-streptomycine bij 4 ° C tot 1 maand.</li>
		<li>Bereiden een aliquoot deel van 500 µL van de resterende SAM. Houd op ijs.</li>
		<li>Voor langdurige imaging, gesteriliseerde met autoclaaf vacuüm vet toepassen op het plastic deel van de onderkant van de glazen bodem schotel (figuur 1A) en steriliseren onder laminaire flow met UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissectie van het centrale zenuwstelsel en ventrale zenuw snoer.
	<ol>
<li>De verlostang en 2 x drie-well glas dissectie gerechten met 70% reinigen EtOH. Giet 400 µL van DSS in 4 putten en 400 µL van SAM in een put. Houd op ijs.</li>
		<li>Schep vliegen opslagmedium met larven en niet-zwerven 3e instar larven (L3) te halen met een pincet. Spoel ze achtereenvolgens in 2 DSS gevulde wells. Houd ze in de 3de DSS gevulde goed op ijs dat anesthetizes van de larven. Opmerking: L3 duurt ongeveer 2 dagen bij 25 ° C. Te observeren de hersenen in fysiologisch relevante tijdsbestek die we gekozen voor het gebruik van niet-zwerven L3 larven. Andere subgroepen van klok neuronen, zoals l-LNvs en DN3s, beginnen te worden gevormd op het zwerven L3 stadium, maar ze nog niet noodzakelijkerwijs fietsen (gegevens niet worden weergegeven). Daarom, hoewel het mogelijk te afbeelding is fietsen klok neuronen in dit stadium (gegevens niet worden weergegeven), is het belangrijk om zorgvuldig de neuronen al functionele larvale klok onderscheiden ontwikkelingslanden voor data-analyse. Non-zwerven L3 verschijnen ongeveer 4 tot 4,5 dagen na ei leggen bij 25 ° C. Voor het gebruik van dit protocol voor het bestuderen van de circadiane ritmes, synchroniseren (later) de ontwikkelingslanden larven in 12 h/12 h LD cycli bij 25 ° C gedurende 3 dagen vóór het verzamelen van L3 larven.</li>
		<li>Ontleden larvale hersenen met fijne pincet in de 4e DSS gevulde put, die niet is gebruikt voor het spoelen van de larven, met behulp van de methode van binnenstebuiten27.<ol>
<li>Kort, de larve in twee gesneden, zachtjes knijpen de mond haken met een paar pincet en oprollen van binnenstebuiten de muur van de lichaam met behulp van de andere paar pincet, dus het blootstellen van de hersenen. Gratis de hersenen door te snijden de luchtpijp en de zenuwen die aan de rest van het lichaam hechten.</li>
			<li>De hersenen in ongeveer 3 µL van DSS gecombineerd met een 20 µL Pipet (vooraf gespoeld met DSS) en afzien in de SAM-gevulde waterput. Herhaal de procedure voor maximaal 7 hersenen. Opmerking: Dissectie moet worden uitgevoerd op een koud oppervlak te houden van de larven verdoofd en de hersenen gekoeld. Bijvoorbeeld de dissectie schotel te plaatsen op een koeling blok verbonden aan een pomp te laten circuleren van ijs-koud water. De dissectie procedure duurt ~ 30 s per hersenen. Het is belangrijk om te houden van het oog/antennal imaginaire schijven aangesloten op de hersenen en het ventrale zenuw snoer intact. Scheuren uit de volgende onderdelen zullen de hersenen beschadigen en de kwaliteit van de cultuur te verminderen. Ook, Vermijd blootstelling van de hersenen naar de lucht. Voordat de eerste hersenen, pipet op en neer de DSS bevattende delen van de ontleed larven, aspirating als het voorkomt dat de hersenen vasthouden aan de muur van de tip.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inbedding van hersenen explantaten in een 3D matrix en montage (~ 20 min).
	<ol>
<li>Dompelen een ontleed hersenen in fibrinogeen werkoplossing (fibrinogeen eindconcentratie ~3.3 mg/mL, 10.5 µL per hersenen) als volgt:</li>
		<li>3.5 µL van SAM/antibiotica gecombineerd (met de dezelfde tip gebruikt in punt 3.2.3). Gecombineerd een ontleed hersenen van de dissectie ver in de dezelfde pipette uiteinde zonder verstrekking van het medium van de SAM/antibiotica in de tip.</li>
		<li>Afzien van de hersenen en het medium op het deksel van een steriele petrischaal. Voeg een ander 3.5 µL van SAM/antibiotica en 3,5 µL van warme fibrinogeen/SAM 10 mg/mL oplossing op de daling met de hersenen. Meng de oplossing rond de hersenen zachtjes door pipetteren met een 20 µL pipette uiteinde. Opmerking: Met behulp van een precisiepipet in plaats van de verlostang in deze stap vermijdt het benadrukken van de hersenen.</li>
		<li>Neem 2 µL van de werkoplossing fibrinogeen uit het drop- en toe te passen op het dekglaasje aan van de schotel onder glas als een klein rondje. Voeg 0.8 µL van trombine en meng heel snel met een pipet tip. De fibrinogeen wordt omgezet tot fibrine en begint te polymeriseren.</li>
		<li>De hersenen die zit in de fibrinogeen werkoplossing (stap 3.3.1) tussen een paar pincet te nemen en plaats deze op de matrix zodra een witte matrix van fibrine zichtbaar is. Oriënteren de hersenen anterior zijde naar beneden (voor imaging-klok neuronen). Duw het zo dicht mogelijk aan het glas van de cover. Fibrine clot bestaat uit lagen van fibrine. Kies één laag en vouw het op de top van de hersenen met kleine en zachte bewegingen zonder loskoppelen van de matrix.<ol>
<li>Herhaal 2 tot 3 keer uit verschillende delen van de klonter te stabiliseren van de hersenen. Opmerking: Bij de behandeling van de hersenen met een tang, wees voorzichtig niet te droog het of het een fysieke stress op te leggen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voeg 20 µL van SAM/antibiotica op de top van de ingesloten hersenen om te stoppen met de werking van trombine.</li>
		<li>Herhaal de procedure voor het monteren van de resterende hersenen. Het is mogelijk om het insluiten van maximaal 5 tot 6 hersenen op een glazen bodem schotel.</li>
		<li>Voor langdurige levende imaging, voeg 600 µL van SAM/antibiotica in de innerlijke put (het glazen gedeelte). Plaats een voorgesneden PTFE-membraan op de top van het medium en vasthouden aan het vacuüm vet toegepast op het plastic deel van de bodem (3.1.5) (figuur 1A).</li>
		<li>Voor farmacologische testen, vult u de schotel met 2 mL van SAM/antibiotica (figuur 1B). Opmerking: Het is zeer belangrijk om de verdamping van het medium, zoals de osmolaliteit van het medium essentieel voor de levensvatbaarheid van neuronen is. Voor langdurige imaging experimenten daarom noodzakelijk voor het afdichten van de cultuur-schotel met PTFE-membraan. Overwegende dat voor de korte termijn experimenten, afdichten membraan niet vereist is, zolang de schotel is gevuld met 2 mL van medium en gecontroleerd in een bevochtigde kamer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. time-lapse Beeldacquisitie
<ol><li>Zet de glazen bodem schotel op de petrischaal houder binnen de fase-top vochtigheid kamer.</li>
	<li>Ga naar z-stack panel op het tabblad ophaal en ingesteld van de z-sectie stappen via de Microscoop software (2 µm × ~ 40 in de experimenten weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3, en film 1). Het begin van een z-stapel vastgesteldop het vliegtuig het verst van het dekglaasje aan en het einde aan het oppervlak van de hersenen explant, dicht bij het dekglaasje aan. Hoewel de hersenen bewegingen zijn te verwaarlozen, extra z-secties toevoegen aan het begin en einde van de z-stack.</li>
	<li>Ga naar Mark & paneel en set-up multi-positie Beeldacquisitie vinden. Met een 40 X doelstelling kan 1 hersenhelft worden vastgelegd in een gezichtsveld</li>
	<li>Ga naar overname modus paneel en selecteer xyzt (z-stack time-lapse). Ga naar tijd overname panel en de gewenste tijd interval en frequentie parameters instellen. Opmerking: Verwerven time-lapse beelden met de gewenste frequentie. Merk op dat op lange termijn live beeldbewerking (24-72 uur) met time lapse interval korter dan 2 h neiging om resultaten in minder fietsen neuronen, waarschijnlijk omdat het vermindert de levensvatbaarheid van neuronen. Het datavolume breidt als de koers van de verhogingen van de overname van de afbeelding, waardoor data-analyse en opslag uitdagender.</li>
</ol>5. farmacologische behandeling van hersenen explantaten met Short-term Live Imaging
Opmerking: De volgende procedure is in wezen hetzelfde als voor langdurige imaging maar hoeft niet een PTFE-membraan. Om te voorkomen dat bloot de hersenen blauw licht wanneer de chemische stof wordt toegevoegd aan de cultuur, moet de Microscoop worden geplaatst in de donkere kamer met rood licht.
<ol><li>Ga naar tijd overname deelvenster en stel het gewenste tijdsinterval en aantal scan om de basislijngegevens vóór de toepassing van de drug te verkrijgen. Scan starten.</li>
	<li>Na de basislijn scan is voltooid, til de scan hoofd van het systeem van de Microscoop. Verwijder het deksel van de fase-top vochtigheid controller en zeer zorgvuldig en verwijder het deksel van de schotel glazen bodem zonder het te verplaatsen.</li>
	<li>De juiste hoeveelheid kweekmedium indien nodig verwijderen. Toevoegen van de experimentele oplossing in het medium, en zorgvuldig en zeer zacht, meng met een steriele Pipet van Pasteur zonder te raken de hersenen explantaten. Opmerking: Voor de toepassing van de bad van PDF, gebruik 2 µM PDF-stockoplossing (in 10% DMSO).</li>
	<li>Vervang de deksels van de glazen bodem schotel en de vochtige kamer, en het hoofd van de scan. Als gebruikt, verplaatst de zwarte ondoorzichtig doek rond de Microscoop kamer.</li>
	<li>Controleer of de hersenen op hun oorspronkelijke posities in levende scanmodus. Pas indien nodig.</li>
	<li>Ga naar tijd overname deelvenster en stel het gewenste tijdsinterval en aantal scan. Scan starten. Opmerking: Hier we getest time-lapse beelden verkregen van elk uur voor maximaal 10 uur.</li>
</ol>

<ol><li>Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+circadian+pacemaker+circuit%3A+Pas+De+Deux+or+Tarantella%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).</li>
<li>Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clock+shop%3A+coupled+circadian+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The clock shop: coupled circadian oscillators.</a> Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+Y+%22Insect+molecular+biology+and+biochemistry%22">Insect molecular biology and biochemistry</a>. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).</li>
<li>Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+circadian+timekeeping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila.</a> Adv Genet. 74, 141-173 (2011).</li>
<li>Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+clocks+in+the+brain%3A+an+update+of+the+morning+and+evening+oscillator+model+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila.</a> Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).</li>
<li>Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+synchronization+and+rhythmicity+in+larval+photoperception-defective+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila.</a> J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).</li>
<li>Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+circadian+imaging+reveals+a+PDF-dependent+transcriptional+regulation+of+the+Drosophila+molecular+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock.</a> Sci Rep. 7, 41560(2017).</li>
<li>Hyun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+GPCR+Han+is+a+receptor+for+the+circadian+clock+neuropeptide+PDF%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF.</a> Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).</li>
<li>Lear, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G+protein-coupled+receptor%2C+groom-of-PDF%2C+is+required+for+PDF+neuron+action+in+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior.</a> Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).</li>
<li>Mertens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDF+receptor+signaling+in+Drosophila+contributes+to+both+circadian+and+geotactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors.</a> Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).</li>
<li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Zschatzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+branching+dynamics+by+axon-intrinsic+asymmetries+in+Tyrosine+Kinase+Receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling.</a> Elife. 3, e01699(2014).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+evokes+rapid+circadian+network+oscillator+desynchrony+followed+by+gradual+phase+retuning+of+synchrony%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony.</a> Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).</li>
<li>Sehadova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+entrainment+of+Drosophila%27s+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fluminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).</li>
<li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca%282%29%28%2B%29+rhythms+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo.</a> Science. 351 (6276), 976-981 (2016).</li>
<li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Series+of+Suppressive+Signals+within+the+Drosophila+Circadian+Neural+Circuit+Generates+Sequential+Daily+Outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs.</a> Neuron. , (2017).</li>
<li>Kuppers-Munther, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+culturing+strategy+optimises+Drosophila+primary+cell+cultures+for+structural+and+functional+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses.</a> Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Larval+Drosophila+Eye-Antennal+Discs+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro.</a> J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li>
<li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85(2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains%3A+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327(2015).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497(2015).</li>
<li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li>
<li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li>
<li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschreven we de methode voor de lange termijn fluorescentie time-lapse microscopie van gekweekte larvale hersenen. Het succes van dit soort experimenten hangt van meerdere factoren, zoals de gezondheid van de cultuur, methode voor immobilisatie van de hersenen explant, fluorescentie intensiteit en signaal-/ ruisverhouding van de verslaggever, temporele en ruimtelijke resolutie, en toegankelijkheid van de explant. Deze factoren kunnen uitsluiten. Bijvoorbeeld, verhogen van time-lapse frequentie beïnvloedt de gezondh...

Circadiane klokken helpen organismen aan te passen aan de periodieke veranderingen in het milieu die zijn gegenereerd door de 24u draaiing van de aarde. De interlocked transcriptionele-translationeel feedbacklussen vaak ten grondslag liggen de moleculaire machine van circadiane klokken over soorten1. Het circuit van de circadiane pacemaker bestaat uit de klok-bevattende neuronen integreert tijd van de dag informatie overgebracht door middel van de ecologische signalen, zoals de licht/donker (LD) en temperatuur cycli, om te orkestreren de ritmes van een overvloed aan dagelijks fysiologische en gedragsmatige processen2,3. De coördinatie van de moleculaire ritmes met neuronale inputs en outputs is uitermate belangrijk voor de werking van de circadiane circuit maar blijft slechts ten dele begrepen.
In Drosophila, de kern van de moleculaire klok, de klok/cyclus (CLK/CYC) heterodimer activeert de transcriptie van periode (per) en tijdloze (tim). PER TIM vormen een complex en voeren de kern, waar ze transcriptionele activiteit van CLK/CYC en daarmee hun eigen transcriptie remmen. Post-transcriptional en posttranslationele verordeningen veroorzaken vertragingen tussen CLK/CYC-gemedieerde transcriptie en repressie door PER / TIM, zorgen voor de generatie van circa 24 uur moleculaire oscillaties1,3,4 . Ongeveer 150 neuronen die deze moleculaire klokken-formulier bevat vliegt een circuit tot controle circadiane gedrag van volwassene5. Een veel eenvoudiger maar volledig functionele circadiane circuit dat bestaat uit 3 groepen van neuronen van de klok - 5 ventrale laterale neuronen (LNvs; 4 PDF-positieve LNvs en één PDF-negatieve LNv, zie hieronder), 2 dorsale Neuron 1s (DN1s) en 2 dorsale Neuron 2s (DN2s) - is aanwezig in het larvale hersenen6,7.
Het eenvoudige larvale circadiane circuit biedt een uitstekend model voor het bestuderen van de interacties tussen Inter neuronale communicatie en de moleculaire uurwerk. Met behulp van onze nieuw ontwikkelde fluorescerende verslaggever PER-TDT, die de hoeveelheid PER eiwit en haar subcellular locatie bootst, wilde wij karakteriseren de dynamiek van de moleculaire uurwerk in verschillende klok neuron subgroepen in het larvale circadiane circuit 8. Bovendien, te weten de sleutelrol van de neuropeptide pigment-dispersing factor (PDF) geproduceerd door 4 LNvs bij het reguleren van de circadiane ritmen bij de neuronale niveau9,10,11, we wilden onderzoeken van de directe effect van de PDF op de moleculaire klokken. Te dien einde ontwikkelden we een methode voor het controleren van de circadiane genexpressie ritmes in larvale hersenen over meerdere dagen door time-lapse confocale microscopie explant. Het protocol is ook aangepast voor farmacologische testen om te testen van het effect van PDF of andere verbindingen op het niveau van de PER-TDT. Dus, de aanpassing bestaat uit de hersenen explant cultuur toegankelijk maken voor toepassing van de drug, verhoging van de temporele resolutie en imaging voor een kortere duur.
Ex vivo cultuur van Drosophila hersenen van verschillende ontwikkelingsstadia geweest tevoren vastgelegde12,13,14,15,16,17 ,18. Overwegende dat deze protocollen zijn gebruikt voor imaging-verschillende biologische fenomenen, sommige van hen zijn niet compatibel met beeldvorming bij eencellige resolutie of bieden geen ondersteuning voor de cultuur voor meer dan enkele uren. Alternatieve methoden voor het uitvoeren van langdurige live beeldvorming van circadiane neuronen in Drosophila omvatten bioluminescentie beeldvorming van moleculaire ritmes19,20,21 en fluorescentie beeldvorming van calcium-indicator met licht blad microscopie22,23. Hoewel bioluminescentie imaging hogere temporele resolutie bereiken kan en lichte blad microscopie aangepast voor in vivo imaging worden kan, ze zijn beperkt op de ruimtelijke resolutie en vereisen gespecialiseerde Microscoop systemen.
De hier beschreven methode is toegesneden op het visualiseren van fluorescerende signalen in de hele hersenen cultuur bij eencellige resolutie over meerdere dagen. Deze facile en veelzijdige methode kan worden aangepast naar afbeelding gekweekte volwassen vliegen hersenen en farmacologische experimenten veel verschillende problemen in Drosophila neurobiologie te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>Ik weet niet zeker of het precies dezelfde is die we in het lab hebben. Ik koos voor "geschikt voor insectencelcultuur" wanneer beschikbaar</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&minus;)-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>Fumaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Ketoglutaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>E&amp;K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>VOORZICHTIG: Schadelijk bij inademing, bij contact met de huid en bij inslikken. Hanteer onder laminaire stroming</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>VOORZICHTIG: Gezondheidsrisico, gebruik handschoenen</td></tr><tr><td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &mu;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td><td>Dupont</td><td>200A Teflon FEP Film</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&nbsp;&micro;m, PVDF, 33&nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&nbsp;&micro;m, PVDF, 33&nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Three-well glass dissection dish</td><td>Any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, size 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature control chamber</td><td>Life Imaging Services</td><td>The CUBE &amp; BOX temperature control system, custom designed</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top humidity controller</td><td>Life Imaging Services</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td><td>ImageJ software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x iterative deconvolution</td><td>AutoQuant and Imaris software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Het circuit van de circadiane pacemaker regisseert ritmische gedrags- en fysiologische uitgangen gecoördineerd met milieu signalen, zoals dag/nacht cyclus. De moleculaire klok binnen elke pacemaker neuron genereert circadiane ritmen in genexpressie, ten grondslag liggen, de ritmische neuronale functies noodzakelijk zijn voor de werking van het circuit. Onderzoek naar de eigenschappen van de individuele moleculaire oscillatoren in verschillende subklassen van pacemaker neuronen en hun interactie met de neuronale signalering levert een beter begrip van het circadiane pacemaker-circuit. Hier presenteren we een time-lapse fluorescent microscopie aanpak ontwikkeld voor het controleren van de moleculaire uurwerk in klok neuronen van gekweekte Drosophila larvale hersenen. Deze methode staat de meerdaagse opname van de ritmes van genetisch gecodeerde fluorescerende circadiane verslaggevers bij eencellige resolutie. Deze setup kan worden gecombineerd met farmacologische manipulaties nauw analyseren real-time respons van de moleculaire klok op verschillende verbindingen. Buiten de circadiane ritmes biedt deze multifunctionele methode in combinatie met krachtige Drosophila genetische technieken de mogelijkheid om te bestuderen van de diverse neuronale of moleculaire processen in levende hersenweefsel.

Hier, laten we de representatieve resultaten van het langdurige opname van een circadiane fluorescerende verslaggever in ex vivo larvale hersenen cultuur, en de levende imaging resultaten van PDF Bad toepassing op verslaggever expressie.
Non-zwerven L3 larven uiting geven aan de moleculaire klok verslaggever PER-TDT en UAS-mCD8::YFP gedreven door een klok neuron driver Clk (856)-gal4 (Figuu...

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Het algemene doel van deze procedure is om Drosophila-larvehersenen te kweken voor meerdaagse time-lapse fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van Drosophila-neurogenetica, zoals veranderingen in genexpressie die optreden in specifieke neuronale populaties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de beeldvorming van fluorescente sondes bij enkele celresolutie in levend hersenweefsel mogelijk maakt gedurende enkele uren tot dagen.Bij het voorbereiden van de reagentia voor deze procedure, werk onder een kweekkap. Zowel een aliquot van SAM-medium als van trombine moet worden ontdooid om te beginnen. Leg de trombine opzij.Neem een 2,5 milliliter aliquot van SAM, en zet de resterende SAM op ijs en zet het opzij. Doe dan penicilline-streptomycine in het aliquoteerde SAM en bewaar het op kamertemperatuur. Voor langetermijnbeeldvormingsexperimenten, bereid een beeldvormingskamer voor, breng gesteriliseerde vacuümvette op de plastic gebieden rond de put van een glazen bodemschaal aan.Steriliseer vervolgens de ingevette schaal met UV-licht onder de kap. Meng nu een aliquot van SAM in de fibrinogeen en breng het mengsel over naar 37 graden Celsius, waar het gedurende twee uur niet zal polymeriseren. Voor de dissectie, maak de pincetten schoon in twee drie-welke glazen dissectieschalen met 70% ethanol.Laad vervolgens vier putjes met 400 microliter DSS, en één putje met 400 microliter SAM. Houd de dissectieschalen op een gekoelde plaat. Schep uit een fles met vermeerderingsvliegen wat medium met niet-ronddwaaierende derde instar larven, en breng er tot zeven met pincetten over naar een putje met koud DSS.Breng vervolgens de larven door drie van de vier DSS-geladen putjes om ze schoon te maken. Laat ze in het laatste putje tot ze worden gedissected. Gebruik het vierde putje van DSS om de larvenhersenen te dissecteren met een paar schone fijne pincetten.Gebruik de goed gevestigde binnen-buiten methode. Met vakmanschap kan elke larve in ongeveer 30 seconden worden verwerkt. Gebruik na elke dissectie een 20 microliter pipettentip vooraf gespoeld met DSS om de hersenen over te brengen in ongeveer drie microliter DSS naar de met SAM gevulde put.Bereid maximaal zeven hersenen voor voor de inbeddingsprocedure. Nadat de hersenen in werkoplossing zijn overgebracht, verdeel de hersenen en het medium op het deksel van een steriele petrischaal. Voeg vervolgens nog eens 3,5 microliter SAM met antibiotica toe, en voeg 3,5 microliter warm SAM met fibrinogeen toe.Het is belangrijk om het SAM-medium met fibrinogeen gedurende de hele procedure op 37 graden te houden. Meng vervolgens de oplossing rond de hersenen door voorzichtig te pipetten met dezelfde pipettentip en aspireer twee microliter van de oplossing om op een dekglas voor een glazen bodemschaal te deponeren. Voeg vervolgens 0,8 microliter trombine toe aan de druppel en meng zeer snel om de polymerisatie te initialiseren die wit zal verschijnen.Gebruik vervolgens pincetten om voorzichtig de hersenen op te pakken en plaats deze op de polymeriserende fibrinematrix. Ik denk dat de trombine, nadat de hersenen naar de druppel zijn overgebracht, niet wordt aanbevolen, omdat het veel van de procedure compliceert. Orienteer de hersenen zoals nodig en duw de hersenen heel voorzichtig zo dicht mogelijk bij het dekglas.Pak vervolgens een laag gepolymeriseerd fibrine en vouw deze bovenop de hersenen met kleine en zachte bewegingen die de matrix niet losmaken. Blijf lagen gepolymeriseerd fibrine over de hersenen vouwen vanuit verschillende delen van het stolsel om de hersenen te stabiliseren. Deponeer vervolgens 20 microliter SAM met antibiotica over de ingebedde hersenen om de trombine-activiteit te stoppen.Gebruik deze procedure om vijf tot zes hersenen in te bedden op een glazen bodemschaal. Voor langetermijnbeeldvorming, dompel de ingebedde hersenen in 600 microliter SAM met antibiotica. Leg vervolgens een stuk PTFE-membraan over het medium en plak de randen van het membraan op de ingevette delen van de schaal.Voor korte tests, vul de schaal met twee milliliter SAM met antibiotica, dompel de hersenen en vermijd het gebruik van de PTFE-membraan. Met behulp van de beschreven procedures, werden hersenen die een moleculaire klokreporter tot expressie brachten, aangedreven door een klokneuron-driver, getraind in licht-donker en vervolgens voorbereid als explantcultuur. De langetermijncultuur werd ingesteld tijdens de lichtfase, net voordat het donker werd.Een SUM-stack bevattende de neuron van belang werd gemaakt in de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het gebied dat overeenkomt met de neuron werd gemeten na achtergrondsubtractie. Om de ritmiciteit van de reporterexpressie te bepalen, werden zowel maximale entropie spectrale analyse als handmatige inspectie gebruikt. Vervolgens werden larven van hetzelfde genotype gedissecteerd, één uur na subjectieve dageraad, of één uur na subjectieve schemering.De hersenen werden twee keer binnen een uur geïmager om een basislijn te krijgen. Vervolgens werd PDF of voertuig toegevoegd aan het cultuurmedium en werden de hersenen elk uur gedurende zes uur geïmager. In hersenen geoogst kort na het donker, vertoonde het PER-TDT expressieprofiel in LNvs een tijdsafhankelijke toename in fluorescentie-intensiteit bij toevoeging van PDF.Dit gebeurde ook in de DN1s en in mindere mate op de DN2s. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ex vivo hersencultuur van Drosophila-larven kunt maken met behulp van een 3D-matrix van fibrine. Eenmaal beheerst, duurt de hele procedure ongeveer 30 minuten, van dissectie tot inbedding.Voordat u begint met de dissecties, bereid de beeldvormingsopstelling voor, zodat de hersenen onmiddellijk na inbedding kunnen worden geïmager. Volgens deze procedure kunnen ook volwassen Drosophila-hersenen worden gekweekt voor fluorescentie time-lapse beeldvorming om aanvullende vragen te beantwoorden.

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Source: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. J. Vis. Exp. (2018). This video demonstrates the procedure to embed the Drosophila brain in a fibrin matrix, followed by time-lapse fluorescence imaging of circadian clock neurons to analyze rhythmic activity synchronized with light/dark cycles.

Embedding Drosophila Brain in a Matrix for Time-Lapse Imaging of the Circadian Clock Neurons

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Hier bespreken we een workflow om levende explant-hersenen van Drosophila melanogaster derde instarlarven voor te bereiden, te ontleden, te monteren en in beeld te brengen om de cellulaire en subcellulaire dynamiek onder fysiologische omstandigheden te observeren.

Live-Cell Imaging van Drosophila melanogaster Derde Instar Larvale Hersenen

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Leer een ex vivo-cultuurmethode voor Drosophila-larvenhersenen met fluorescentie-tijdsverloopbeeldvorming. Deze techniek maakt circadiane ritmestudies op eencellig niveau mogelijk voor neurogenetisch onderzoek.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Meer video's verkennen