Native chromatine Immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest Brain Tumor Neurospheres
29 januari 2018
Epigenetische mechanismen worden regelmatig gewijzigd in glioma. Chromatine immunoprecipitation kan worden gebruikt om de gevolgen van genetische wijzigingen in glioma die voortvloeien uit wijzigingen in histone modificaties tot regeling van de chromatine structuur en gene transcriptie. Dit protocol beschrijft een native chromatine immunoprecipitation op lymfkliertest hersenen tumor neurospheres.
Het algemene doel van deze procedure is om de verrijking van histonmarkeringen op een specifieke genomische locatie te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van epigenetica, zoals hoe mutaties in epigenetische regulatoren die histonmodificaties veranderen, het transcriptoom van tumorcellen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat cellen niet zijn gekruiskoppeld, dus ze bevinden zich in een meer natuurlijke toestand, wat de specificiteit van antilichamen kan bevorderen.
Begin met het dissecteren van de experimenteel geïnduceerde tumor uit de hersenen van een muis in een 10 centimeter Petri-schaal. Als de tumor een fluorescerend eiwit tot expressie brengt, visualiseer de tumor door een fluorescerend dissecterend microscoop ingesteld op het juiste fluorescente kanaal met 0,3 keer vergroting. Gebruik een scalpel en pincetten om het tumorweefsel van de normale hersenen te scheiden en hak de tumor in kleine stukjes in de Petri-schaal.
Breng de gedissecteerde tumor over naar een 1,5 milliliter buis met 300 microliter NSC-medium en gebruik een wegwerpspuit om de tumor voorzichtig te homogeniseren. Voeg vervolgens een milliliter celdetachment medium toe en incubeer het monster gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, passeer de celsuspensie door een 70 micron celzeef in een 50 milliliter centrifugebuis.
Was vervolgens de zeef met 25 milliliter NSC-medium en centrifugeer de suspensie gedurende vijf minuten bij 300 keer G op kamertemperatuur. Na het decanteren van het supernatant, resuspendeer de pellet in zes milliliter NSC-medium en breng de tumorcelsuspensie over in een T25 kweekfles. Kweek de cellen bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator met een atmosfeer van 95% lucht en 5% koolstofdioxide totdat er neurosferen zijn gevormd.
Zodra de neurosferen zijn geoogst, centrifugeer één keer 10 tot zes neurosfeercellen per aminoprecipitatie bij 300 keer G gedurende vijf minuten. Na het centrifugeren, decanteer het supernatant en resuspendeer de neurosfeerpellet in één milliliter gebalanceerde zout oplossing. Breng de suspensie over in lage eiwitbinding 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes en centrifugeer vervolgens zoals eerder.
Decanteer vervolgens het supernatant en resuspendeer de celpellet in 95 microliter verteringsbuffer, aangevuld met één tot 100 met proteaseremmercocktail per één keer 10 tot zes cellen. Pipetteer de cellen onmiddellijk op en neer om klontering te voorkomen en om geen bubbels te maken. Meng vervolgens vijf microliter 0,1X micrococcal nuclease in 145 microliter verteringsbuffer en voeg vijf microliter verdunde micrococcal nuclease toe per één keer 10 tot zes cellen.
Sla de buis om te mengen en plaats de buis gedurende exact 12 minuten in een 37 graden Celsius hitteblok. De micrococcal nuclease vertering om chromatine te fragmenteren is de meest cruciale stap. Goede chromatinefragmentatie is belangrijk voor het bereiken van een hoge resolutie voor ChIP.
Om ervoor te zorgen dat de stap succesvol is, incubeer meerdere monsters één voor één om ervoor te zorgen dat over-vertering niet optreedt. Voeg na 12 minuten 10 microliter 10X micrococcal nuclease stopbuffer toe per één keer 10 tot zes cellen. Vanaf dit punt moeten de monsters op ijs worden bewaard.
Bioanalyzer-analyse van het gedigesteerde micrococcal nuclease monster toont aan dat het grootste deel van het DNA is gefragmenteerd in mono-, di- en tri-nucleosomen. Voeg vervolgens 110 microliter 2X ripa-buffer toe, aangevuld met één tot 100 proteaseremmercocktail per één keer 10 tot zes cellen. Sla de buis om te mengen, centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in 1700 keer G. Breng het supernatant dat het chromatine bevat over naar een reguliere 1,5 milliliter microcentrifugebuis en plaats op ijs.
Gebruik ripa-buffer aangevuld met proteaseremmers bij één tot 1000 om het chromatine te verdunnen, zodat elke IP een volume van 100 tot 200 microliter heeft. Verwijder vervolgens een aliquot equivalent aan 10% van het ChIP-volume als de invoermonster. Bereid de invoer voor door 100 microliter TE-buffer toe te voegen, aangevuld met proteinase K, en incubeer gedurende een uur bij 55 graden Celsius.
Na het zuiveren van de invoer met een PCR-zuiveringskit, meet de concentratie van de invoer met behulp van een microvolume spectrofotometer. Noteer de resultaten in een notitieboek. Voeg 10 microliter gewassen protein A en G magnetische kralen toe per IP die op elk monster zal worden uitgevoerd, en incubeer gedurende een uur bij 4 graden Celsius met rotatie bij 20 RPM.
Plaats het monster op een magnetische houder en laat de kralen scheiden, breng vervolgens het vereiste volume over in nieuwe 1,5 milliliter buisjes. Voeg het gewenste antilichaam toe aan elke buis en wikkel vervolgens de doppen af met plastic paraffinefolie om verdamping te voorkomen. Incubeer de monsters een nacht bij 4 graden Celsius met rotatie zoals eerder.
De volgende dag, centrifugeer de buisjes gedurende 10 seconden bij 2000 keer G, voeg vervolgens 10 microliter kralen toe aan elke IP en incubeer gedurende 3 uur bij 4 graden Celsius met rotatie bij 20 RPM. Plaats vervolgens de monsters op een magnetische standaard en laat de magnetische kralen scheiden. Gebruik een pipetteer om het supernatant te verwijderen, voeg vervolgens 150 microliter ripa-buffer met proteaseremmers toe aan elke IP en incubeer gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius bij 20 RPM.
Na de incubatieperiode, plaats de monsters op een magnetische standaard en laat de magnetische kralen scheiden. Gebruik een pipetteer om het supernatant te verwijderen, voeg vervolgens 150 microliter lithiumchloride buffer toe, aangevuld met proteaseremmers in lage concentratie, aan elke IP en incubeer gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius met rotatie bij 20 RPM. Na de incubatieperiode, plaats de monsters op een magnetische standaard en laat de magnetische kralen scheiden, gebruik vervolgens een pipetteer om het supernatant te verwijderen.
Voeg vervolgens 150 microliter koude TE zonder proteaseremmers toe aan de kralen en incubeer gedur
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het bestuderen van epigenetische veranderingen in glioom via native chromatin immunoprecipitatie. Door histonmodificaties te analyseren, kunnen onderzoekers inzicht krijgen in de impact van genetische alteraties op de gentranscriptie in tumorcellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Epigenetica
- Oncologie
Achtergrond
- Epigenetische mechanismen zijn vaak verstoord bij glioom.
- Chromatinestructuur en gentranscriptie worden gereguleerd door histonmodificaties.
- Het begrijpen van deze veranderingen kan inzicht bieden in de tumorbiologie.
- Deze methode maakt het mogelijk om tumoren in een meer natuurlijke staat te bestuderen.
Doel van de studie
- Om de verrijking van histonmarkeringen op specifieke genomische locaties te identificeren.
- Om te onderzoeken hoe mutaties in epigenetische regulatoren het transcriptoom van tumorcellen beïnvloeden.
- Om een techniek te gebruiken die de celintegriteit behoudt voor een betere antilichaamspecificiteit.
Gebruikte methoden
- Dissectie van neurosferen van muizentumoren in de hersenen.
- Visualisatie van tumorweefsel met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- Scheiding van tumorweefsel van normaal hersenweefsel.
- Fijnmalen van de tumor in kleine stukjes voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van specifieke histonmodificaties geassocieerd met glioom.
- Inzichten in de rol van epigenetische veranderingen bij tumorprogressie.
- Demonstratie van de effectiviteit van native chromatine-immunoprecipitatie.
- Potentiële implicaties voor doelgerichte therapieën bij de behandeling van glioom.
Conclusies
- Native chromatine-immunoprecipitatie is een waardevolle tool voor het bestuderen van glioom.
- Inzicht in histonmodificaties kan bijdragen aan therapeutische strategieën.
- Deze methode verhoogt de specificiteit van antilichaaminteracties met chromatine.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de sector
Native chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) in neurosferen van muize hersentumoren maakt nauwkeurige mapping van histonmodificaties op specifieke genomische loci mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in vroege oncologische discovery. Door de natuurlijke staat van het chromatine te behouden, verbetert deze methode de antilichaamspecificiteit en levert ze biologisch relevantere inzichten op in de epigenetische regulatie in glioommodellen. Deze mogelijkheden zijn cruciaal voor targetvalidatie en voor het informeren van risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen in neuro-oncologisch R&D.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar de verrijking van histonmerkeren bij ziekterelevante genloci in tumormodellen.
- Ondersteunt functionele validatie van epigenetische regulatoren die betrokken zijn bij de pathogenese van gliomen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door de chromatinestatus te koppelen aan veranderingen in genexpressie.
- Verhoogt het voorspellend vertrouwen voor het verder ontwikkelen van epigenetische targets in oncologische pipelines.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerde workflow voor het prepareren van uit neurosferen afgeleid chromatine voor immunoprecipitatie-assays.
- Levert kwantitatieve resultaten via qPCR voor de verrijking van histonmodificaties in controle- en doelregio's.
- Maakt een reproduceerbare beoordeling van antilichaamspecificiteit en assay-prestaties in natuurlijke chromatinestructuren mogelijk.
- Ondersteunt downstream aanpassing voor genoombrede ChIP-gebaseerde screeningsplatformen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt histonmodificatieprofielen uit met ziekterelevante genexpressie in preklinische glioommodellen.
- Maakt continuïteit mogelijk van epigenetische bevindingen in de ontdekkingsfase naar preklinische biomarker-validatie.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van epigenetische targets op basis van mechanistisch bewijs.
- Faciliteert integratie met genoombrede benaderingen voor bredere translationele inzichten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit native ChIP-protocol bevindt zich binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek en slaat een brug tussen mechanistische targetvalidatie en translationele biomarkerontwikkeling in het neuro-oncologisch onderzoek.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over de functionele impact van histonmodificaties in tumorneurosferen.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare verrijkingsgegevens voor assay-standaardisatie en evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Maakt qPCR-gebaseerde meting van histonmerkverrijking in specifieke genomische regio's mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de epigenetische status met genexpressie en ziekterelatie in preklinische modellen.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een herbruikbare workflow voor chromatinanalyse binnen diverse neuro-oncologische onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van epigenetische targets en vermindert mechanische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door middel van native chromatinepreparatie.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door de chromatinestatus te koppelen aan functionele genregulatie in tumormodellen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van epigenetische targets in neuro-oncologische pipelines.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neurosfeer-kweek, chromatinebiologie en immunoprecipitatie-technieken.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor chromatinefragmentatie en qPCR-analyse.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie tussen teams wat betreft antilichaamselectie en assay-controles.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende tumormodellen of chromatine-geassocieerde eiwitten.
- Beperkt tot de analyse van histonen of eiwitten die sterk aan DNA gebonden zijn, conform de beperkingen van native ChIP.
