Name: Native chromatine Immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest Brain Tumor Neurospheres (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer native chromatine immunoprecipitatie voor epigenetisch onderzoek naar gliomen met behulp van murine hersentumor-neurospheres. Deze methode behoudt de natuurlijke toestand van cellen voor betere antilichaamspecificiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid/National Institute of Neurological Disorders & beroerte (NIH/NINDS) subsidies R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 naar M.G.C.; NIH/NINDS verleent R01-NS076991, R01-NS082311 en R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; de Afdeling Neurochirurgie; Leahs Happy Hearts, en Tsjaad hoewel Stichting M.G.C. en P.R.L. RNA biogeneeskunde Grant F046166 aan M.G.C. F.M.M. wordt ondersteund door een F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. wordt ondersteund door de NIH / NIGMS verlenen 5T34GM007821-37.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. generatie van hersentumor NS en voorwaarden te kweken.
<ol><li>Neurale stamcellen Medium (NSC) met Dulbecco van bewerkt Eagle Medium/F12B27 toeslag (1 x), N2 toeslag (1 x), en een antimicrobiële reagens te bereiden. NSC medium een aanvulling vormen op de dag van gebruik met menselijke recombinante endothelial groei factor (EGF) en basic-fibroblast groeifactor (FGF) op een eindconcentratie van 20 ng/mL elke.</li>
	<li>De hersentumor in muis met behulp van de schone slaapster transposon systeem waarin plasmiden codering oncogenen of shRNA gericht op tumor suppressors wordt geïnjecteerd in de laterale ventrikels van pasgeborenen voor het genereren van spontane hersenen tumoren9induceren. Selecteer een muis met een grote tumor, die wordt bevestigd met bioluminescentie beeldvorming. Opmerking: Meer gedetailleerde informatie over de Sleeping Beauty Transposon systeem en plasmide constructies die gebruikt kan worden gevonden in Calinescu et al. 9.<ol>
<li>Naar het image van de muizen, injecteren 100 µL van 30 mg/mL luciferine oplossing intraperitoneally met behulp van een naald van 26 meter.</li>
		<li>5 min na injectie van luciferine, anesthetize het dier een verdoving kamer met zuurstof/Isofluraan stroom ingesteld op 2% Isofluraan.</li>
		<li>Wanneer de dieren zijn verdoofd (meestal 2-3 min), plaats van de dieren in de Bioluminescentie zaal met zuurstof Isofluraan ingesteld op 2% Isofluraan. Als de dieren onder verdoving langer dan 5 min, gebruik maken van een oogheelkundige zalf om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.</li>
		<li>Afbeelding van de muizen met behulp van een in vivo optisch imaging systeem met de volgende parameters: automatische belichting, grote weggooien en diafragma f = 1. De parameter om het te overwegen een grote tumor is een bioluminescentie > 106 fotonen/s/cm2/sr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanaseren van de muis met een overdosis van Isofluraan inademing verdoving in een gesloten kamer, Controleer door teen snuifje dat het dier wordt verdoofd, en het onthoofden van de muis.</li>
	<li>Extract van de hersenen en het ontleden, zoals eerder is beschreven in Calinescu et al. 9.</li>
	<li>Plaats de hersenen in een 10 cm petrischaal. Als de tumor-geïnduceerde spreekt een fluorescente proteïne, gebruik een TL ontrafeling van Microscoop ingesteld op het juiste TL kanaal en 0.3 X vergroting, anders identificeren tumor massa door de verschillen in weefsel kleur en textuur. Gebruik de scalpel en pincet te scheiden van de tumor weefsel van de normale hersenen.</li>
	<li>Mince de tumor in kleine stukjes in de petrischaal. Plaats de ontleed tumor in een 1,5 mL tube met 300 µL van het NSC-medium.</li>
	<li>Gebruik een wegwerp plastic pellet stamper die bij de muren van een conische microcentrifuge buis past te voorzichtig het homogeniseren van de tumor. Voeg 1 mL van cel detachement medium toe en Incubeer het monster gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Opmerking: Het gebruik van een stamper kan sommige cellen doden. Als de lezer wil maximaliseren van de levensvatbaarheid van de cellen, kan het gebruik van een stamper achterwege blijven.</li>
	<li>Passeren van de celsuspensie van stap 1.7 door een 70 µm cel zeef en wassen van de zeef met 25 mL van NSC medium.</li>
	<li>Centrifugeer de schorsing bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, decanteren het supernatant en resuspendeer de pellet in 6 mL van NSC medium.</li>
	<li>Plaat van de tumor celsuspensie uit stap 1.9 in een maatkolf van T-25 cultuur en cultuur het bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met een sfeer van 95% lucht en 5% CO2. Meestal na 3 dagen, zal er een mengsel van sommige dode cellen, zelfklevend cellen en sommige cellen vormen van NS die in het medium zweven.</li>
	<li>De celsuspensie Breng in een conische tube van 15 mL, verzamelen alleen de cellen bevat die zinken naar de bodem met behulp van een micropipet en hen opnieuw plaat op een T-75 weefselkweek kolf.</li>
	<li>Het handhaven van de cellen bij relatief hoge dichtheid (1-3 X 106 cellen in een T-25). Passage van de cellen die confluente. Opmerking: Confluentie wordt bepaald door de grootte van de bollen. Zwarte centra van grote bollen betekenen dat er zijn dode cellen in het midden en aan te geven dat de cellen onmiddellijk moeten worden gepasseerd.</li>
	<li>Toevoegen van de groeifactoren (EGF en basic-FGF; 20 ng/mL elk) elke drie dagen. Het medium wijzigen wanneer de cellen niet heuvels en de middellange draait licht oranje.</li>
	<li>Als u wilt wijzigen het medium, verzamelen de oud medium en Centrifugeer het bij 300 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet cel in NSC medium aangevuld met EGF en FGF op de concentratie in stap 1.1 hebt opgegeven. Opmerking: Als de bollen staan midden-tot hoge confluentie, maar niet klaar om te worden gepasseerd (bol grootte is klein met een diameter van < 100 µm), dan de pellet kan worden gesplitst in twee maatkolven.</li>
	<li>Om de passage van de cellen, centrifugeren van de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, de bovendrijvende vloeistof decanteren en Incubeer de cellen in cel detachement medium voor 5 minuten bij 37 ° C.<ol>
<li>Voeg 5 mL van evenwichtige zout oplossing verdund detachement medium samen en Centrifugeer het bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof decanteren, resuspendeer de pellet cel in 18 mL van NSC medium en de schorsing gelijkelijk verdelen in drie T-25 kolven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als u wilt blokkeren de aliquots van cellen, distantiëren van de cellen zoals in stap 1.15 en bevriezen van de cellen in 1 mL aliquots van 90% foetale runderserum met 10% dimethylsulfoxide. Langzaam afkoelen van de cellen door het plaatsen van de cellen op het ijs gedurende 10 minuten, dan houden van de cellen-20 ° C gedurende 30 minuten, en -80 ° C voor 1 dag. De volgende dag, worden de cellen overbrengen in een opslagcontainer vloeibare stikstof.</li>
</ol>2. eigen ChIP
<ol><li>Chromatine voorbereiding<ol>
<li>Cultuur na het maken van voorraad van afgeleide NS, NS in een T-75 in 15 mL van NSC medium bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek met een sfeer van 95% lucht en 5% CO2 totdat NS confluente geworden. Één confluente T-75 plaat zal 3-5 X 106 cellen opleveren.</li>
		<li>Wanneer de cellen confluente worden, NS Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min, giet het supernatant en voeg 1 mL van cel dissociatie medium. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 min. Voeg 5 mL van medium en de cellen met behulp van een hemocytometer10tellen. Opmerking: 1 x 106 cellen zijn per immunoprecipitation (IP) reactie nodig. Let erop dat een vooraf immuun serum of IgG besturingselement ook opgenomen11moet zijn.</li>
		<li>Centrifugeer de NS in een tube van de microcentrifuge van de 1,5 mL bij 300 x g gedurende 5 min, giet het supernatant en resuspendeer de pellet van de NS met 1 mL van evenwichtige zoutoplossing en spoel de suspensie laag eiwitgehalte bindende 1,5 mL microcentrifuge buizen.</li>
		<li>Centrifuge NS bij 300 x g voor 5 min, giet het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 95 µL van spijsvertering buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl2, 0,2% polyethyleenglycol octylphenyl ether) per 1 x 106 cellen aangevuld met protease remmer cocktail in een hoge concentratie (1:100). Onmiddellijk Pipetteer de cellen op en neer ter voorkoming van samendoen en voorkomen dat er bubbels.</li>
		<li>Resuspendeer MNase in 50% glycerol te maken van 1 mg/mL oplossing (1,15 eenheden/µL, opgeslagen bij-20 ° C), die zal worden verwezen als "1 x" voorraad. Maak een "0.1 x" voorraad verwerkingsopties in op een tweede 1:9-verdunning met 50% glycerol (bv., 900 µL van "1 x" MNase en 100 µL 50% glycerol) en opslaan bij-20 ° C.</li>
		<li>Meng 5 µL van "0.1 x" MNase en 145 µL van spijsvertering buffer. Houd het enzym op ijs al the times. Voeg 5 µL van verdunde MNase in spijsvertering buffer per 1 x 106 cellen. Flick de buis te mengen en de buis in 37 ° C blok voor precies 12 min. proces de monsters één tegelijk om een nauwkeurige incubatietijd van 12 min.</li>
		<li>Voeg 10 µL van 10 x MNase stoppen Buffer (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, 55 mM EDTA) per 1 x 106 cellen. Monsters moeten worden bewaard op ijs vanaf dit moment.</li>
		<li>Voeg 110 µL "2 x RIPA buffer" (280 mM NaCl, 1,8% polyethyleenglycol octylphenyl ether 0,2% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 0,2% Na-deoxycholate, 5 mM ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA); opgeslagen bij 4 ° C) aangevuld met proteaseinhibitor cocktail in hoge concentraties (1:100) per 1 x 106 cellen. Flick de buis te mengen.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen gedurende 15 min. in een microfuge bij 4 ° C en 1700 x g. het supernatant overbrengen in een nieuwe reguliere 1,5 mL microcentrifuge buizen (laag eiwitgehalte bindende microcentrifuge buizen zijn niet meer nodig) en bewaar ze op ijs. Gooi de pellet.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunoprecipitation (IP)<ol>
<li>Meng EiwitA en eiwit G magnetische kralen in een 1:1 verhouding. Voor elke IP, 25 µL van parels te bereiden.</li>
		<li>Wassen van de kralen door toevoeging van 1 mL van de buffer RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% polyethyleenglycol octylphenyl ether, 0,1% SDS, 0,1% nb-deoxycholate; opgeslagen bij 4 ° C) aangevuld met proteaseinhibitors bij lage concentratie (1:1000).</li>
		<li>Gebruik een magneet om parels te scheiden van de oplossing van het wassen en decanteren van de Supermarket-oplossing (ongeveer 1 minuut). De wassen stap tweemaal uitvoeren.</li>
		<li>Resuspendeer de kralen op het oorspronkelijke volume met behulp van de buffer RIPA aangevuld met proteaseinhibitors (1:1000).</li>
		<li>Indien nodig, verdunde Reserve de chromatine met behulp van de buffer RIPA aangevuld met proteaseinhibitors (1:1000), zodat elk IP een volume van 100-200 heeft µL. 10% van het volume per IP-adres van de chromatine gebruikt voor de input. Opmerking: bijvoorbeeld als 200 µL worden gebruikt per IP, 20 µL van de verdunde chromatine moeten worden gereserveerd voor de input. Voor een totaal van vier IPs, moet totale chromatine volume worden verdund tot 820 µL.</li>
		<li>De ingang voor te bereiden. Voeg 100 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) aangevuld met proteïnase K (0,5 mg/mL) aan op de ingang en de input bij 55 ° C gedurende 1 uur uit te broeden. Opmerking: De stappen 2.2.6-2.2.7 kan worden uitgevoerd samen met stappen 2.3.4 en 2.4.1.</li>
		<li>Zuiveren van de invoer met behulp van een PCR zuivering kit na instructies van de fabrikant en elueer in 50 µL van elutie buffer geleverd in kit.</li>
		<li>De concentratie van de invoer met behulp van een microvolume spectrofotometer meten en de resultaten daarvan vastleggen in een notitieblok. Lege met elutie buffer van kit. Opmerking: In de muis neurospheres gebruikten we ongeveer 6 µg van DNA voor elk IP.</li>
		<li>Input uitvoeren op een 1% gel of laden 1 µL op een DNA-Bioanalyzer met behulp van de standaard instellingen. Bewaar de rest voor gebruik als input in downstream toepassingen.</li>
		<li>Voeg 10 µL van gewassen EiwitA & G magnetische kralen voor elke IP en IP Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opmerking: Voeg bijvoorbeeld 30 µL van EiwitA & G magnetische kralen voor drie IP-adressen.</li>
		<li>Leg de monsters op een magneet en laat kralen om te scheiden. Verdeel de chromatine door het vooraf bepaalde bedrag over te brengen in een nieuwe 1,5 mL-buis.</li>
		<li>Toevoegen van het antilichaam en wikkel de doppen met kunststof paraffine film om verdamping. Incubeer de monsters 's nachts bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut. Opmerking: Concentratie moet worden bepaald empirisch na aanbevelingen van de fabrikant.</li>
		<li>De volgende dag, draaien de buizen met behulp van een mini centrifuge bij kamertemperatuur, 2000 x g, voor 10 s. Dan 10 µL van kralen toevoegen aan elk IP en IP Incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut.</li>
	</ol></li>
	<li>IP-wast en vertering van de eiwitten<ol>
<li>Voeg 150 µL van RIPA buffer aangevuld met proteaseinhibitors bij lage concentratie (1:1000) naar elk IP en incubeer IP bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten plaats het monster op een magnetische standaard en laat van de magnetische kralen om te scheiden. Gebruik een pipet wilt verwijderen van de bovendrijvende substantie. Herhaal dit vijf tep-wast.</li>
		<li>Voeg 150 µL van LiCl buffer (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% NB-deoxycholate; bewaren bij 4 ° C) aangevuld met proteaseinhibitors bij lage concentratie (1:1000) naar elk IP en IP Incubeer bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten plaats het monster op een magnetische staan en toestaan van magnetische kralen om te scheiden. Gebruik een pipet wilt verwijderen van de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Voeg 150 µL van koude TE (geen proteaseinhibitors) en Incubeer het monster bij 4 ° C met rotatie bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten plaats het monster op een magnetische standaard en laat van magnetische kralen om te scheiden. Gebruik een pipet wilt verwijderen van de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Na de definitieve wassen stap, resuspendeer de steekproef in 100 µL TE buffer aangevuld met proteïnase K (0,5 mg/mL) en Incubeer het monster bij 55 ° C gedurende 1 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA zuivering en ChIP kwantitatieve Real-Time PCR (qPCR)<ol>
<li>Zuiveren van immunoprecipitated DNA met behulp van een PCR zuivering kit. Na toevoeging van DNA-bindende buffer uit de kit aan elk monster, plaats de buis op een magneet en wacht totdat het supernatant magnetische kralen statistische, vervolgens overbrengen naar de kolom opruimen. Volg de instructies van de fabrikant en elueer in 50 µL van elutie buffer geleverd in kit.</li>
		<li>Om te controleren als het IP succesvol is, een qPCR uit te voeren. Idealiter moeten de inleidingen voor positieve en negatieve controle regio's worden ontworpen. Opmerking: bijvoorbeeld, voor een IP uitgevoerd met H3K4me3 en H3K27me3, de volgende monsters moeten worden uitgevoerd op qPCR: H3K4me3, H3K27me3 en IgG ChIP DNA, invoerwaarden DNA en een sjabloon oncontroleerbaar (NTC) gebruikend inleidingen voor regio's worden verrijkt met H3K4me3 (positieve controle) en regio's worden verrijkt met H3K4me3 (negatieve controle); ook voor H3K27me3.</li>
		<li>Volg standaardprotocollen voor het uitvoeren van qPCR12. Kortom, een qPCR met SYBR groen master mix, 0,5 µL van 10 µM werken concentratie van elke voorwaartse en omgekeerde primer en 2 µL van ChIP of input DNA uitvoeren Lees platen met behulp van een Real Time PCR-systeem. Primer sequenties zijn opgenomen in tabel 2. De Gapdh primer sequenties van twee exemplaren Hwang et al. gebruikte13waren.</li>
		<li>ChIP gegevens analyseren ten opzichte van de invoer, dat wil zeggen, procent input methode (% IP)14. Bereken het percentage invoeren met behulp van de volgende formules: Aangepast input = gemiddelde ct (input)-log2(DF) waar DF is de verdunningsfactor van de startende input en DF = totaalvolume van IP / volume van input % IP = 100 × 2 ^ (aangepast input - Ct (IP)) Ct is waar de drempel-factor.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Schwartzentruber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driver+mutations+in+histone+H3.3+and+chromatin+remodelling+genes+in+paediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma.</a> Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).</li>
<li>Bjerke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3.3.+mutations+drive+pediatric+glioblastoma+through+upregulation+of+MYCN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN.</a> Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).</li>
<li>Bender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+H3K27me3+and+DNA+hypomethylation+are+major+drivers+of+gene+expression+in+K27M+mutant+pediatric+high-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas.</a> Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).</li>
<li>Maleszewska, M., Kaminska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+glioblastoma+an+epigenetic+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Is glioblastoma an epigenetic malignancy?</a> Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native chromatin immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurner%2C+B+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22">Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking</a>. , (2001).</li>
<li>Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+native+chromatin+immunoprecipitation+to+interrogate+histone+variant+protein+deposition+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediumted+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+separable+roles+for+EZH2+in+neurogenic+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia.</a> Elife. 3, e02439(2014).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11(2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier gepresenteerde protocol kan de gebruiker voor het uitvoeren van de native ChIP op NS afgeleid van genetisch gemanipuleerde hersentumoren. In tegenstelling tot dwarsbinding ChIP, is dit protocol beperkt voor de studie van eiwitten waarmee strak gekoppeld aan DNA-6. Het aantal cellen die worden gebruikt als noodzakelijk kan worden gewijzigd en het protocol kan worden opgeschaald. We gebruikten 1 X 106 cellen per IP, inheemse ChIP kan echter ook worden uitgevoerd met zo weinig als...

Epigenetische gebeurtenissen zijn frequent in de gliomen en waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de pathogenese van de tumor. Inderdaad, in pediatrische hoogwaardige glioma, mutaties in de genen coderend voor Histon varianten H3.3 en H3.1 komen vaak voor1. De mutaties beïnvloeden histone modificaties en hebben grote gevolgen epigenetische hebben2,3. In de adolescente tot volwassen spectrum optreden periodieke mutaties in isocitrate dehydrogenase gen 1/2 (IDH1/2), een mutatie die α-KG afhankelijk histone en DNA de-methylasaes remt, en genetische wijzigingen in andere regelgevers van de chromatine zoals ATRX en DAXX 4. Daarom is het van cruciaal belang om te bestuderen hoe mutaties die invloed hebben op de regelgevers van de epigenetische structuur van de chromatine en regelgevende histone modificaties, die op hun beurt een dramatische impact van de tumorcellen transcriptome hebben veranderen.
Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een krachtig hulpmiddel gebruikt voor het evalueren van het effect van de epigenetische aanpassingen in de genoom5,6,7. In native-ChIP, chromatine wordt verteerd met micrococcal nuclease (MNase), immunoprecipitated met behulp van een antilichaam tegen het eiwit van belang, aan de orde gesteld en vervolgens DNA wordt gezuiverd van de immunoprecipitated chromatine complexe6. Cellen zijn niet tijdens de procedure vast zodat deze techniek is alleen van toepassing voor de studie van eiwitten die nauw met DNA6 samenwerken. Het ontbreken van de cross-linking helpt antilichamenspecificiteit aangezien antilichamen zijn gewoonlijk verhoogd tegen nietgefixeerde peptiden of eiwitten7. Bovendien, aangezien er geen cross-linking stap, vermindert dit de kans op vaststelling van voorbijgaande eiwit-DNA interacties die aspecifieke en niet regelgevende7,8. ChIP kan worden gebruikt voor identificatie van de verrijking van Histon modificaties in een specifiek gebied van het genoom. Hier, detail we een protocol voor het uitvoeren van inheemse ChIP in neurospheres (NS) gegenereerd op basis van genetisch gemanipuleerde Muismodellen van glioma.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2946-90004</td><td>bioanalyzer</td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R, refrigerated</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 muis</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Aldrich</td><td>22350-6</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>Goldbio</td><td>LuckK-1g</td><td></td></tr><tr><td>DiaMag1.5 magnetic rack</td><td>Diagenode</td><td>B04000003</td><td>voor magnetische parelwasbeurten</td></tr><tr><td>DiaMag Rotator EU</td><td>Diagenode</td><td>B05000001</td><td>rotator</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NSC component</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>protein A magnetische pareltjes</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>protein G magnetische pareltjes</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>bereid 20 &mu;g/mL stock in 0,1% BSA en verdeel in aliquoten.</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>ethylene glycol-bis(&beta;-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td>qPCR reagent</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>voor het invriezen van cellen</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18b</td><td>Bereid 20 &mu;g/mL stock in 0,1% BSA en verdeel in aliquoten.</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>voor dissectie van tumor</td></tr><tr><td>Glycerol, MB Grade</td><td>EMD- Millipore</td><td>356352</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>Ab8580</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Millipore</td><td>07-449</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td>evenwichtig zout oplossing</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VETone</td><td>501017</td><td>inhalatieanestheticum</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>Perkin-Elmer</td><td>124262</td><td>in vivo optisch beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>Hyqtase</td><td>HyClon</td><td>SV3003001</td><td>celdetacheringsmedium</td></tr><tr><td>Lithium Chloride</td><td>Sigma</td><td>L8895</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>Low binding microtubes</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3207</td><td>lage eiwitbinding microcentrifugebuisje</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>21-402-903</td><td>gewone microcentrifugebuisje</td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Thermo Fisher Scientific, Affymetrix</td><td>70196Y</td><td>elke batch kan verschillen; koop voldoende hoeveelheid voor experimenten en verdeel in aliquoten.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>NSC component</td></tr><tr><td>Normal Rabbit IgG</td><td>Millipore</td><td>12-372</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>NOL-36-063</td><td>antimicrobiële stof, gebruik bij 0,1 mg/mL.</td></tr><tr><td>NP-40 (Igepal CA-630)</td><td>Sigma</td><td>18896-50ML</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>Kimble Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749515-0000</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>verdeel in aliquoten en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Protinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>maak 10 mg/mL stock in water; verdeel in aliquoten en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA zuiveringskit</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-16</td><td>voor dissectie van tumor</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>0241-5KG</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D670-25G</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L-4390</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Bp152-1</td><td>bufferreagens</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP 151-500</td><td>polyethyleenglycol octylfenylether</td></tr><tr><td>Standard Mini Centrifuge</td><td>Fisherbrand</td><td>12-006-901</td><td>standaard mini centrifuge</td></tr><tr><td>SZX16 microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>fluorescerende dissectiemicroscoop</td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td><td>Applied Biosystems</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr></tbody></table>

native chromatine immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest brain tumor neurospheres

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Epigenetische aanpassingen kunnen worden betrokken bij de ontwikkeling en de progressie van glioma. Wijzigingen in methylation en acetylation voor initiatiefnemers en regelgevende gebieden oncogenen en tumor suppressors kunnen leiden tot wijzigingen in genexpressie en spelen een belangrijke rol in de pathogenese van hersentumoren. Native chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een populaire techniek waarmee de opsporing van wijzigingen of andere eiwitten strak gebonden aan DNA. In tegenstelling tot de kruiselings gekoppelde ChIP, in native-ChIP, worden de cellen niet behandeld met formaldehyde covalent eiwit te koppelen aan DNA. Dit is voordelig omdat soms crosslinking eiwitten die alleen Transient interactie met DNA en hebben geen functionele betekenis in genregulatie kan oplossen. Bovendien zijn antilichamen over het algemeen ingebracht nietgefixeerde peptiden. Daarom is antilichamenspecificiteit verhoogd in native ChIP. Het is echter belangrijk om in gedachten houden dat inheemse ChIP alleen geldt voor het bestuderen van histones of andere eiwitten die strak aan het DNA binden. Dit protocol beschrijft de inheemse chromatine immunoprecipitation op lymfkliertest hersenen tumor neurospheres.

Een schematische weergave van NS gegenereerd op basis van een hersentumor waar de tumor hersencellen Katushka positieve zijn tumor wordt gepresenteerd in Figuur 1. Figuur 2 is een schematische weergave van de hele techniek van de ChIP. Figuur 3 toont de representatieve resultaten van de chromatine van hersentumor NS verteerd met MNase voor 12 min, opbrengst van een meerderheid van mono, di- en tri-nu...

Epigenetische mechanismen worden regelmatig gewijzigd in glioma. Chromatine immunoprecipitation kan worden gebruikt om de gevolgen van genetische wijzigingen in glioma die voortvloeien uit wijzigingen in histone modificaties tot regeling van de chromatine structuur en gene transcriptie. Dit protocol beschrijft een native chromatine immunoprecipitation op lymfkliertest hersenen tumor neurospheres.

Native chromatine Immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest Brain Tumor Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Het algemene doel van deze procedure is om de verrijking van histonmarkeringen op een specifieke genomische locatie te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van epigenetica, zoals hoe mutaties in epigenetische regulatoren die histonmodificaties veranderen, het transcriptoom van tumorcellen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat cellen niet zijn gekruiskoppeld, dus ze bevinden zich in een meer natuurlijke toestand, wat de specificiteit van antilichamen kan bevorderen.Begin met het dissecteren van de experimenteel geïnduceerde tumor uit de hersenen van een muis in een 10 centimeter Petri-schaal. Als de tumor een fluorescerend eiwit tot expressie brengt, visualiseer de tumor door een fluorescerend dissecterend microscoop ingesteld op het juiste fluorescente kanaal met 0,3 keer vergroting. Gebruik een scalpel en pincetten om het tumorweefsel van de normale hersenen te scheiden en hak de tumor in kleine stukjes in de Petri-schaal.Breng de gedissecteerde tumor over naar een 1,5 milliliter buis met 300 microliter NSC-medium en gebruik een wegwerpspuit om de tumor voorzichtig te homogeniseren. Voeg vervolgens een

native-chromatin-immunoprecipitation-using-murine-brain-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

De cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking voor de studie van de epigenetische markeringen in chromatine, omdat de meeste assays gebrek aan enkele cel resolutie. Neuronen meestal vermengd met glia en andere niet-neuronale cellen. Wij bieden een protocol te halen en neuronale kernen verzamelen van menselijke hersenen.

Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Deze video protocol toont de isolatie en de uitbreiding van stamcellen als cellen van chirurgisch gereseceerd menselijke glioblastoom mutliforme (GBM) tumor weefsel met behulp van de neurosphere assay kweekmethode.

Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

The video demonstrates the isolation of tumor-infiltrating peripheral blood mononuclear cells from a mouse brain using mechanical dissociation and enzymatic digestion. This is followed by density gradient centrifugation to collect the immune cells for further analysis.

Isolating Tumor-Infiltrating Immune Cells from a Murine Brain

Source: Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.  (2018).This video demonstrates the isolation of protein-DNA complexes from neurosphere cells derived from a mouse brain tumor using native chromatin immunoprecipitation. It details the steps for chromatin preparation, immunoprecipitation, washing, and protein digestion to release DNA for downstream analysis.

Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells

Source: Núñez, F. J., et al. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates an immunohistochemical technique for labeling tumor biomarkers in paraffin-embedded brain tumor neurospheres. The neurosphere sections undergo paraffin removal and rehydration, followed by treatment to expose biomarker sites. Primary and secondary antibodies are then applied to label these biomarkers. The...

Immunohistochemical Staining of Biomarkers in Brain Tumor Neurosphere Sections

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Hier beschrijven we een efficiënt en veelzijdig protocol om nieuwe glioblastoma (GBM) te induceren, monitoren en analyseren met behulp van transposon DNA dat in de ventrikels van neonatale muizen wordt geïnjecteerd. Cellen van de subventriculaire zone, die het plasmide opnemen, transformeren, prolifereren en genereren tumoren met histo-pathologische kenmerken van menselijk GBM.

Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

Leer native chromatine immunoprecipitatie voor epigenetisch onderzoek naar gliomen met behulp van murine hersentumor-neurospheres. Deze methode behoudt de natuurlijke toestand van cellen voor betere antilichaamspecificiteit.

Native chromatine Immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest Brain Tumor Neurospheres

Meer video's verkennen