Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw
May 11th, 2018
We hebben de Eiwitmantel proteïne van hepatitis E virus ontworpen als een theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP assembleert zelf in een stabiele icosahedrale kooi in mucosale levering. Hier beschrijven we de wijziging van de HEVNPs voor tumor gericht op door muteert residuen oppervlak-blootgesteld aan cysteines, die conjugaat van synthetische liganden die specifiek tumorcellen binden.
Het algemene doel van chemische functioneelmaking van het oppervlak van HEV-nanodeeltjes is om een herhaalbare en consistente aanpak te bieden voor de conjugatie van immünogene, therapeutische en diagnostische moleculen op het oppervlak van HEV-nanodeeltjes voor diagnostische en behandelingsdoeleinden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van nanogeneeskunde, zoals hoe verbeterde targeting van kanker en de distributie van nano-therapeutica kunnen worden gemonitord. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer reproduceerbaar, efficiënt en veel gemakkelijker te bereiken is in vergelijking met genetische engineering.
Michelle Nguyen en Ivan Ruiz, onderzoeksassistenten uit ons lab, zullen de procedures demonstreren. Begin dit protocol met de productie en zuivering van hepatitis E-virusnanodeeltjes zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdun de HEV-nanodeeltjemonsters tot tussen de 0,5 en twee milligram per milliliter met 10 millimolair MES, pH 6,2 voor TEM-beeldvorming.
Ioniseer de koolstofgecoate roosters met 40 milliamp gloeiontlading gedurende 30 seconden om een hydrofiele koolstofoppervlakte te produceren. Het hydrofiele koolstopoppervlak van de roosters kan slechts 30 minuten na de gloeiontladingsbehandeling duren. Na ionisering, houd de rooster en de pincetten vast en voeg twee microliter van het HEV-nanodeeltjemonster toe aan het rooster.
Na 15 tot 30 seconden, dep het rooster af met filterpapier. Spoel vervolgens onmiddellijk het rooster af met dubbel gedestilleerd water en dep het opnieuw af met filterpapier. Voeg onmiddellijk twee microliter van twee procent uranylacetaat toe aan het rooster.
Na 15 seconden, dep het rooster af met filterpapier. Droog de monsterroosters door ze een nacht in een elektronische ontvochtigingsdroogkast te plaatsen. Afhankelijk van het monster kan cryogene elektronenmicroscopie of cryo-EM nodig zijn voor structuurvisualisatie en karakterisering.
Breng het rooster over in een TEM en beeld bij 10 tot 80 K vergroting. HEV-nanodeeltjes verschijnen in TEM als lege icosahedroneiwitten met een diameter van ongeveer 27 nanometer vanwege de afwezigheid van viraan RNA. Om de eenstaps conjugatie van HEV-nanodeeltjes en maleïmide-gekoppelde biotine uit te voeren, breng eerst de HEV-nanodeeltjes aan op mini dialyse-eenheden.
Dialyseer de nanodeeltjes tegen 0,01 molair PBS pH 7,4 bij kamertemperatuur gedurende één uur volgens het protocol van de fabrikant. Na dialyse, breng de HEV-nanodeeltjes over naar 1,5 milliliter buisjes en meet de eiwitconcentratie bij 280 nanometer met behulp van een spectrofotometer. Meng de nanodeeltjes bij één milligram per milliliter met een gelijke hoeveelheid van 100 micromolair maleïmide biotine en 0,01 molair PBS pH 7,4 om een een-op-vijf molair verhouding te maken.
Na overnacht reageren bij vier graden Celsius, verwijder ongebonden maleïmide biotine met een spinontziltingskolomprocedure volgens het protocol van de fabrikant. Analyseer de monsters door een standaard reducerende SDS-pagina. Gebruik de standaardprocedures om een chemiluminescente Western blot te bereiden met HRP-gekoppelde streptavidine en vang het chemiluminescente signaal op door middel van röntgenfilm.
Om twee-staps conjugatie van het borstkankercelspecifieke ligand, LXY30, uit te voeren op het blootgestelde cysteïne op HEV-nanodeeltjes, breng eerst de nanodeeltjes aan op mini dialyse-eenheden en dialyseer tegen 0,01 molair PBS pH 7,4 bij kamertemperatuur gedurende één uur. Breng vervolgens de HEV-nanodeeltjes over naar 1,5 milliliter buisjes en meet de eiwitconcentratie bij 280 nanometer met behulp van een spectrofotometer. Combineer vervolgens 650 micromolair maleïmide azide en 650 micromolair alkyn LXY30 met 200 micromolair kopersulfaat en één millimolair ascorbinezuur.
Dit vormt maleïmide-gekoppelde LXY 30 bij 650 micromolair. Incubeer het mengsel gedurende één nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, meng de HEV-nanodeeltjes tot één milligram per milliliter met ongeveer 10% volume van maleïmide-gekoppelde LXY 30 om een een-op-drie molair verhouding te maken.
Reageer overnacht bij vier graden Celsius. Vanwege de relatief hoge concentratie van maleïmide LXY 30, worden de uiteindelijke concentraties van de reactanten zoals kopersulfaat na het mengen ongeveer tien keer verminderd. Om schade aan de hepatitis E-virusnanodeeltjes te voorkomen, is een andere optie de koperbevrijde bijdragemethode.
Verwijder ongebonden maleïmide click LXY 30 met een spinontziltingskolom volgens het protocol van de fabrikant. Bewaar de LXY 30-gekoppelde HEV-nanodeeltjes bij vier graden Celsius. Om een eenstaps conjugatie van de LXY 30 HEV-nanodeeltjes en Cy5,5-fluorescente tag uit te voeren, meng eerst de LXY 30-gekoppelde nanodeeltjes tot één milligram per milliliter met een gelijk volume van Cy5,5-fluorescente tag om een een-op-vijf molair verhouding te maken.
Na overnacht reageren bij vier graden Celsius, verwijder de ongebonden Cy5,5 NHS met een spinontziltingskolomprocedure volgens het protocol van de fabrikant. Bewaar de LXY 30 Cy5,5-gekoppelde HEV-nanodeeltjes bij vier graden Celsius. Twee methoden werden getest voor de LXY 30 functioneelmaking van HEV-nanodeeltjes voor tumorceltargeting.
Toen HEV 573C-nanodeeltjes eerst werden gebonden aan maleïmide azide, gevolgd door een clickchemiereactie met LXY 30 alkyn, leken de HEV 573C-nanodeeltjes uiteen te vallen onder TEM-observatie. Echter, een initiële clickchemiereactie tussen LXY 30 alkyn en maleïmide azide om maleïmide-gekoppelde LXY 30 te vormen gevolgd door conjugatie om gemodificeerde HEV-nanodeeltjes te assisteren, had geen invloed op de structuur en de HEV 573C-nanodeeltjes bleven intact. LXY 30 en Cy5,5-gekoppelde HEV-nanodeeltjes werden toegepast op gekweekte borst
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert de engineering van het hepatitis E-virus-capsid-eiwit in een theranostisch nanodeeltje (HEVNP) voor gerichte tumortherapie. De HEVNP's worden gemodificeerd om de tumortargetting te verbeteren door middel van de conjugatie van synthetische liganden.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Nanogeneeskunde
- Theranostica
- Oncologie
Achtergrond
- HEVNP's vormen zelf stabiele structuren.
- Modificatie van nanodeeltjes kan de targettingcapaciteiten verbeteren.
- Het begrijpen van de distributie van therapeutische middelen is cruciaal bij kankerbehandeling.
- Deze aanpak is efficiënter in vergelijking met traditionele genetische engineeringmethoden.
Doel van het onderzoek
- Om een consistente methode voor het functionaliseren van HEVNP's te ontwikkelen.
- Om de targetting van kankercellen te verbeteren met behulp van synthetische liganden.
- Om de diagnose en behandeling van tumoren te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Productie en zuivering van HEV-nanodeeltjes.
- Verdunning van HEVNP-monsters voor beeldvorming.
- Conjugatie van liganden met oppervlakte-geëxposeerde cysteïneresiduen.
- Gebruik van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- HEVNP's kunnen effectief worden gemodificeerd voor tumortargetting.
- De conjugatiemethode is reproduceerbaar en efficiënt.
- Verbeterde targetting van kankercellen werd aangetoond.
- Mogelijke toepassingen in diagnostiek en therapeutische geneeskunde werden benadrukt.
Conclusies
- HEVNP's vertegenwoordigen een veelbelovend platform voor kankertherapie.
- Oppervlaktemodificatie maakt gerichte levering van therapeutische middelen mogelijk.
- Deze methode zou het veld van nanogeneeskunde kunnen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Chemical surface functionalization of virus-like particles enables modular and reproducible conjugation of targeting ligands and imaging agents without genetic modification, supporting rapid prototyping of theranostic nanocarriers. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing systematic screening of diverse biomolecules on a stable nanoparticle scaffold. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving consistent, scalable display of functional entities for downstream oncology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise display of tumor-targeting ligands like LXY30 on HEV nanoparticles.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for evaluating ligand-receptor interactions using cysteine-directed conjugation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid comparison of ligand affinity and internalization efficiency in cancer cell models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable nanoconjugates with defined ligand density for standardized binding and uptake assays.
- Operational Value: Enables batch-to-batch consistency in nanoparticle functionalization, critical for assay reproducibility.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for high-throughput screening of targeting moieties.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Produces tumor-targeted HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) validated in breast cancer cell models, supporting progression to preclinical studies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates that pre-forming maleimide-linked LXY30 via click chemistry preserves nanoparticle integrity, reducing structural failure risk.
- Disease-Relevant System: Uses MDA-MB-231 cells to assess internalization and binding affinity, aligning with therapeutic relevance in triple-negative breast cancer.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling preparation of functionalized nanocarriers for preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing modular conjugation of immunogenic, therapeutic, and diagnostic molecules to HEV nanoparticles.
- Screening: Delivers assay-ready nanoparticles with reproducible surface modification for quantitative evaluation of targeting efficiency.
- Analytics: Generates measurable outputs via TEM, Western blot, and confocal microscopy to compare conjugation success and cellular uptake.
- Translational Research: Links discovery to preclinical continuity through demonstration of tumor-specific binding and internalization in cultured cancer cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable conjugation platform applicable to other macromolecular complexes with known structures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through precise, cysteine-specific ligand display without altering nanoparticle assembly.
- Operational Value: Offers high reproducibility and efficiency compared to genetic engineering, reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid screening of ligands and imaging tags on a stable nanocarrier.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement by generating theranostic candidates with validated tumor targeting and imaging capabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, conjugation techniques, and nanoparticle purification.
- Depends on access to dialysis units, spectrophotometry, SDS-PAGE, Western blotting, and confocal microscopy.
- Necessitates standardization across teams for consistent protein concentration measurement and reaction conditions.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other nanoparticle systems with different surface-exposed residues.
- Includes practical limitations such as nanoparticle disassembly if conjugation order is not optimized, as seen with premature maleimide azide binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
