Name: Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer eencellige fotoconversie in levende zebravis voor ontwikkelingsbiologie met behulp van het Eos-eiwit. Deze minimaal invasieve methode maakt visualisatie van celmigratie in vivo mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Bernard Kulemaka en leden van the Smith lab voor hun nuttige opmerkingen en de oriëntatie van de reagens, Sam Connell en Brent Redford van 3i voor imaging vragen en Deborah Bang, Karen Heed en Kay Stewart fielding zebrafish ziekenverpleger. Dit werk werd gesteund door de University of Notre Dame, de Elizabeth en Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation Center voor Zebrafish onderzoek aan de Universiteit van Notre en Center van de cellen van de stam en regeneratieve geneeskunde aan de Universiteit van Notre Dame. Alle dierlijke studies werden gedaan met inachtneming van de Universiteit van Notre Dame IACUC aan Dr. Cody Smith.

Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Notre Dame institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. voorbereiding voor Zebrafish Specimen
<ol><li>Een volwassen mannetje en één volwassen vrouwelijke GS (converteerbare eiwit) in een paring kamer per standaardprocedures13plaatsen. In dit manuscript, gebruiken Tg(sox10:eos) vis9 vanwege toegang, maar andere transgene lijnen met photoconvertible eiwit kan eveneens worden gebruikt. Meer dan één kamer instellen in het geval dat vis niet doen leggen. Laat de vis in de bedwelmingsruimte blijven 's nachts.</li>
	<li>De volgende ochtend, verzamel eieren in petrischalen van 100 mm. Laat de eieren om te rijpen tot 24u na bevruchting (hpf) voor screening.</li>
	<li>Als dieren bovenstaande heterozygoten voor de transgenic, filter scherm 24 hpf gerechten voor Tg(sox10:eos) + embryo's met een 488 nm lichtbron en GFP sets op een ontleden Microscoop. Isoleren Tg(sox10:eos) + embryo's en toestaan om te rijpen tot en met 48 hpf.</li>
	<li>Dechorionate embryo's handmatig met een naald of pincet.</li>
	<li>Bereiden en magnetron 5 mL van 0,8% laag-melting point agarose oplossing.<ol>
<li>Zodra agarose koel aanvoelt is, plaats 3-4 narcose GS (sox10:eos) 48 hpf vis in het midden van een 10 mm glas-dekglaasje aan onderste petrischaal.</li>
		<li>Voeg genoeg agarose ter dekking van het oppervlak van het dekglaasje aan, ongeveer 1 mL. Via een sonde naald vis aan hun zijden rangschikken. Agarose te stollen zodat montage van dieren toestaan. Mogelijk moet voortdurend Re-Arrange de zebravis totdat de agar14 stolt. Stolling duurt ongeveer 2 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat de agarose heeft verhard gedurende 2 minuten, Voeg langzaam embryo opslagmedium met 0,02% aminobenzoic acid ester (tricaïne) om schotel totdat de onderkant van de agar en schotel is ondergedompeld. Dit moet ongeveer 3mL.</li>
</ol>2. Microscoop montage en pre conversie Imaging
<ol><li>Confocale software openen en selecteer de opname en focus Vensters [Figuur 1]. Selecteer de lab-specifieke conversie imaging instelling onder de opname instellen van de drop-down tabblad [Figuur 1] onder het opnamevenster. Hier, de lab-specifieke instelling heet "vis Imaging."</li>
	<li>Plaats specimen op confocal toepassingsgebied en brengen in beeld met behulp van de cursus en fijnafstelling knoppen.</li>
	<li>Open het venster focus en ga naar het gewenste gebied van belang (d.w.z. dorsal root ganglia).</li>
	<li>Selecteer de c488 laser onder het menu Filter ingesteld. Instellen van de blootstelling aan 300 ms, laser macht tot en met 5 en intensiveren tot 75 [Figuur 2].</li>
	<li>Het 3D selectievakje onder de sectie type vastleggen . In het gedeelte 3D-vastlegging Selecteer Gebruik huidige positie en controleer bereik rond huidige. In dezelfde sectie, moet u het bereik opgeven tot en met 35, het aantal vliegtuigen tot en met 36, en de stap-grootte op 1. Het bereik kan worden vergroot of verkleind om ruimte voor de diepte van het imaginggebied. Voor het ruggenmerg is de waarde van een bereik tussen 35-40 stapels doorgaans voldoende [Figuur 5].</li>
	<li>Selecteer huidige locatie [Figuur 5].</li>
	<li>Klik op start aan de onderkant van het Opnamevenster te verwerven van de afbeelding.</li>
</ol>3. eencellige Photoconversion
<ol><li>Confocale software openen en selecteer de opname en focus Vensters [Figuur 1]. Selecteer de lab-specifieke conversie imaging instelling onder de opname instellen van de drop-down tabblad [Figuur 1] onder het opnamevenster. Hier, de lab-specifieke instelling heet "Vis lasertherapie volledige chip."</li>
	<li>Selecteer de c488 en c541 laser onder het menu Filter ingesteld. Als niet gebruikend de zelfde Microscoop software, vinden het menu om te Selecteer verschillende lasers en selecteer het 488 nm en 541 nm lasers. Instellen van de risico's op 300 ms, laser macht tot en met 5 en intensiveren tot 75 [Figuur 2]. Deze laser-instellingen zijn geselecteerd op basis van het produceren van voldoende fluorescent signaal zonder photobleaching of toxiciteit te veroorzaken. Als toxiciteit of photobleaching wordt gevisualiseerd, verminderen laser macht of blootstelling.</li>
	<li>Open het venster focus en klik op het tabblad photomanipulation in het venster focus. Laser parameters aanpassen. De kracht van de stapel laser omzetten in 2 en klik op Ga naar. Wijzig de blokgrootte Raster 1 en klikt u op instellen. Het Dubbelklik op formaat wijzigen tot en met 4. Wijzig de regel van laser v405 [Figuur 3].</li>
	<li>Open de instellingen voor geavanceerde vastlegging in het opnamevenster. Selecteer het tabblad photomanipulation en wijzig de herhalingen dubbelklikken in 2. Klik op OK [Figuur 4].</li>
	<li>Selecteer het tabblad XY in het venster focus. Controleer de laser parameters uit stap 2 in het tabblad photomanipulation [Figuur 3, Figuur 4]. Laser instellen op photoconvert de cel van belang zonder photoconversion van de omringende cellen.<ol>
<li>Als photoconversion van aangrenzende cellen aanwezig is, verminderen laser. Als photoconversion van cellen niet optreedt, kunnen de laser bevoegdheden worden verhoogd. Optimaal, stel laser macht om photoconvert alleen de regio van belang en niet omliggende gebieden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vink het selectievakje timelapse onder type vastleggen. Klik vervolgens op Start [figuur 6A].</li>
	<li>Zodra het levende timelapse-venster opent, selecteer het gereedschap cirkel op de bovenste taakbalk [Figuur 7]</li>
	<li>Teken een cirkel in de regio van de centermost van de cel. Klik met de rechtermuisknop de getekende cirkel, selecteer FRAP regioen wacht 3 seconden. Het geselecteerde gebied moet worden dimmer [Figuur 8]. Klik op opname stoppen.</li>
	<li>Als meer dan één dier imaging, ga terug naar de XY-tabblad in het focus menu en selecteer positie 2. Herhaal vervolgens stap 4.1-4.6.</li>
	<li>Als u wilt converteren van een bevolking van cellen, volg de parameters van het protocol en laser voor stappen 4.1-4.4 behalve in plaats van het tekenen van een cirkel om de regio van belang FRAP, gebruikt u het hulpmiddel lijn. Trek een lijn op de regio van belang en de regio met dezelfde parameters hierboven vermelde FRAP.</li>
</ol>4. post-photoconversion Imaging
<ol><li>Nadat alle punten photoconverted zijn. Selecteer de stack van de lab-specifieke standaardafbeelding instellen in de precoversion imaging stap 3 beschreven. Dit is gevonden onder de opname instellen van drop-down tabblad in het Opnamevenster [Figuur 5].</li>
	<li>De c488 laser selecteren en instellen van de blootstelling aan 300ms, laser macht tot en met 5 en intensiveren tot 75 [Figuur 2].</li>
	<li>Selecteer de c541 laser vinden onder hetzelfde menu als de c488 laser. Instellen van de blootstelling aan 500 ms, laser macht tot en met 10 en intensiveren tot 75 [Figuur 9].</li>
	<li>Het 3D selectievakje onder de sectie type vastleggen . In het gedeelte 3D-vastlegging Selecteer Gebruik huidige positie en controleer bereik rond huidige. In dezelfde sectie, moet u het bereik opgeven tot en met 35, het aantal vliegtuigen tot en met 36, en de stap-grootte op 1. Het bereik getal kan vergroten of verkleinen zodat de gewenste beeldvorming diepte [Figuur 5].</li>
	<li>Als er meerdere punten in het tabblad XY focus, de optie multipoint lijst in het opnamevenster. Als dat niet het geval is, selecteert u huidige locatie.</li>
	<li>Klik op start aan de onderkant van het Opnamevenster te verwerven van de afbeelding.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In complexe weefsels organiseren verschillende celtypes in specifieke domeinen. Onlangs hebben technieken zijn gebruikt om de afzonderlijke cellen label binnen deze grote weefsel structuren1,2,3. Wij tonen hier twee technieken die kunnen ook worden gebruikt om het visualiseren van zowel eencellige interacties en cel bevolking interacties binnen complexe weefsels. Het voordeel van de photoconversion-techniek is de ruimtelijke con...

Meerdere afzonderlijke cellen samen bouwen en onderhouden van complexe dierlijke en plantaardige weefsels. Deze cellen zijn vaak tussenliggende en moeilijk te onderscheiden van buren op het niveau van een enkele cel zonder hoge resolutie microscopie waarvoor fixatie van weefsel. Echter, om te begrijpen hoe deze weefsels vormen, zijn gehandhaafd en worden zieke, is het essentieel om te onderzoeken hoe één cellen binnen het weefsel na verloop van tijd zijn interactie. Ideaal, deze experimenten vereisen de etikettering van enkelvoudige cellen binnen een weefsel op een niet-invasieve wijze zonder de vereiste bevestigingsmiddelen. Wetenschappers hebben nu talrijke technieken om te bereiken deze taak1,2,3,4ontwikkeld.
De ontdekking en de uitvoering van de kwallen groen fluorescente proteïne (GFP) was een opwindende benadering die toegestaan voor het labelen van afzonderlijke cellen in een weefsel milieu1. Met behulp van cel-specifieke initiatiefnemers, is het mogelijk genetisch selecteren een subset van cellen die zijn gemarkeerd met1. U kunt ook kan virale geïnduceerde expressie van GFP worden gebruikt voor gebruiker geselecteerde expressie van GFP3,4. Hoewel vrij nuttig, kan genetische gemedieerde uitdrukking van GFP geen gebruiker geselecteerde expressie binnen een subset van cellen in het weefsel; en virale uitdrukking van GFP, hoewel voordelige, kan invasieve. Met de komst van GFP derivaten en slimme technieken zoals zwHANSje uitspreken verschillende TL eiwitten meer dun in weefsels, het mogelijk geworden om te visualiseren van afzonderlijke cellen en de interacties tussen hen in complexe weefsel2, 5. echter deze benaderingen cellen in een willekeurige mode label. Als het gewenste experiment visualisatie van een enkele cel of een bevolking van cellen die is gedefinieerd door de experimentator nodig, zijn ze dus beperkt. Met dergelijke experimenten, zou het voordeel hebben van een genetisch uitgedrukt fluorescent proteïne die kan worden gemanipuleerd om te onderscheiden, in een enkele cel mode, van andere TL- en niet-belichting fluorescerende cellen.
De wetenschappelijke gemeenschap gebruikt voor het bereiken van dit doel en visualiseren van de celbiologie van afzonderlijke cellen binnen een complexe levend weefsel, eencellige photoconversion van verschillende fluorescente proteïnen6,7,8. Genetisch gereguleerde uitdrukking van een photoconvertible-eiwit (dat wil zeggen, eos, kaede, etc.) dat van een groen rood fluorescerende staat overgangen bij blootstelling aan UV (488 nm) licht, we kunnen een eencellige onderscheiden van haar fluorescently geëtiketteerde buren6,7,8. Deze aanpak maakt gebruik van een apparaat aangesloten op onze confocal microscoop die licht uit een laser stapel naar een diffractie-beperkte regio van belang direct kan. Met deze techniek kunnen we ofwel label afzonderlijke cellen of grotere populaties in een gebruiker gedefinieerde manier9,10,11. De techniek is een minimaal invasieve vergeleken met eencellige injecties van virale GFP. Als een bewijs van concept, laten we zien dat we photoconvert enige cellen binnen een ganglion in het perifere zenuwstelsel en de grotere populaties photoconvert als cellen gelegen aan de ventrale zijde van het ruggenmerg9,10kunnen, 11,12. Wij kunt vervolgens deze photoconverted cel populaties 24 h later om inzicht in hun beweging en differentiatie tijdens ontwikkeling visualiseren.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) zebrafish dieren</td><td></td><td></td><td>Vissen werden verkregen en gekruist vanuit de visfaciliteit aan de Universiteit van Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm petrischaal</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>Embryo medium wordt wekelijks gemaakt en geleverd door de visfaciliteit aan de Universiteit van Notre Dame met 5L RO-water, 30uL methyleenblauw en 200mL zoutstock.</td></tr><tr><td>0,8% Laag smeltpunt Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm glazen dekglasbodem petrischaal</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>Naald dissecterende sonde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,002% 3-aminobenzoëzuur ester (Tricaine)</td><td>Fluka analytisch</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent dissecterend microscoop met GFP-filters</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop met lasers om GFP en RFP filtersets te exciteren</td><td>3i spinning disk confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-lichtbron (laser) voor fotoconversie</td><td>405 nm laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methyleenblauw</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eencellige photoconversion in levende intact zebravis

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Dier- en plantensoorten weefsel is samengesteld uit verschillende populaties van cellen. Deze cellen communiceren na verloop van tijd te bouwen en onderhouden van het weefsel en kunnen leiden tot ziekte wanneer verstoord. Wetenschappers hebben ontwikkeld, slimme technieken om te onderzoeken van de kenmerken en de natuurlijke dynamiek van deze cellen binnen intact weefsel met het uitspreken van fluorescente proteïnen in subsets van cellen. Echter, soms experimenten vereisen meer geselecteerde visualisatie van de cellen in het weefsel, soms op de wijze van eencellige of bevolking-van-cellen. Om dit bereiken en visualiseren van afzonderlijke cellen binnen een bevolking van cellen, hebben wetenschappers eencellige photoconversion van fluorescente proteïnen gebruikt. Om aan te tonen deze techniek, zien we hier hoe directe UV-licht naar een Eos-uiten-cel van belang in een intact, zebravis wonen. We beeld dan die photoconverted Eos+ cellen 24 h later om te bepalen hoe ze veranderd in het weefsel. We beschrijven twee technieken: één cel photoconversion en photoconversions van de populaties van de cel. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te visualiseren cel interacties, cel-lot en differentiatie en cel-migraties, waardoor het een techniek die geldt in veel biologische vragen.

Photoconversion van fluorescente proteïnen kan worden gebruikt om afzonderlijke cellen binnen een weefsel6label. Ter demonstratie werden Tg(sox10:eos) vis9 gebruikt om uit te drukken van het photoconvertible eiwit Eos onder de regulerende sequenties van sox10. De Tg(sox10:eos) dieren op 48 hpf werden voor het eerst gemonteerd, en vervolgens beeld voor het detecteren van een niet-specifieke photoconversion die zich ...

Hier presenteren we een protocol om te laten zien hoe de photoconversion van de cel wordt bereikt door UV blootstelling aan specifieke gebieden uiten de fluorescente proteïne, Eos, in levende dieren.

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Het algemene doel van deze fotoconversietechniek is om enkele cellen in een enkel dier te onderscheiden van andere fluorescerende celpopulaties. Deze methode kan helpen om belangrijke ontwikkelingsvragen in het veld te beantwoorden en ons in staat stellen om celmigratie over tijd te visualiseren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het minimaal invasief is en kan worden gebruikt om enkele cellen of grotere populaties te labelen.Bovendien kan de gebruiker het specifieke gebied van belang selecteren en het gewenste doelwit fotoconversie ondergaan. Na het paring van mannelijke en vrouwelijke transgene zebravissen die een fotoconversibel eiwit tot expressie brengen en het verzamelen van de eieren volgens het tekstprotocol, gebruik een dissectief microscoop met een lichtbron van 488 nanometer en GFP-filtersets om 24 hpf embryo's te screenen. Gebruik een naald of pincetten om de embryo's handmatig te dechorioneren.Bereid in de magnetron vijf milliliter 0,8% low melting point agarose-oplossing. Zodra de agarose is afgekoeld tot het aanraken, plaats drie tot vier verdoofd transgene sox10 eos-positieve 48 hpf vissen in het midden van een tien millimeter glazen dekselbodem Petri-schaal. Voeg ongeveer een millimeter, of genoeg agarose om het oppervlak van het deksel te bedekken, toe.Gebruik vervolgens een sondenaald om de vissen op hun zij te rangschikken, ze indien nodig aan te passen, terwijl de agarose stolt, wat ongeveer twee minuten zal duren. Nadat de agarose gedurende twee minuten is gestold, voeg langzaam embryomedium toe dat 0,02% aminobenzoëzuur ester tricaïne bevat in de schaal, totdat het onderste oppervlak van de agar en de schaal is ondergedompeld. Om confocale microscopie uit te voeren, open de confocale software en selecteer de opname- en focusvensters.Voer voorafgaande beeldvorming uit, selecteer onder het opnamevenster en de dropdown-tab van de opname-instellingen de beeldvormingsparameters. Hier worden de lab-specifieke stackinstellingen genoemd, visbeeldvorming. Plaats het monster op de confocale microscoop en gebruik de grove en fijne afstelknoppen om het scherp te stellen.Open vervolgens het focusvenster en lokaliseer het gewenste gebied van belang, zoals het dorsale wortelganglion. Selecteer onder het filtersetmenu de c488-laser, stel de belichting in op 300 milliseconden, de laservermogen op vijf en de intensiteit op 75. Selecteer vervolgens onder het gedeelte opnametype het 3D-vakje.In het 3D-opnamegedeelte, selecteer gebruik huidige positie en vink het bereik rond de huidige aan. In hetzelfde gedeelte stelt u het bereik in op 35, het aantal vlakken op 36 en de stapgrootte op een. Selecteer de huidige locatie en klik vervolgens op start onderaan het opnamevenster om een afbeelding te verkrijgen.Voor de fotoconversieprocedure, zorg ervoor om de laserparameters dubbel en drievoudig te controleren. Soms is het noodzakelijk om de conversie-instellingen opnieuw aan te passen wanneer het conversievenster open is. Selecteer in het opnamevenster, onder het dropdown-tab van de opname-instellingen, de lab-specifieke conversie-beeldvormingsinstelling.Hier wordt de lab-specifieke instelling genoemd, fish ablate full chip. Selecteer in het filtermenu de c488 en c541-lasers. Stel de belichtingen in op 300 milliseconden, het laservermogen op vijf en de intensiteit op 75, wat voldoende fluorescerend signaal zal produceren zonder fotobleking of toxiciteit te veroorzaken.Klik in het focusvenster op het fotomanipulatietab en verander de laserstack-vermogen in twee en klik vervolgens op gaan. Wijzig de rasterblokgrootte in een en klik op instellen. Wijzig vervolgens de dubbelklikgrootte in vier en de laserlijn in v405.Open vervolgens in het opnamevenster de geavanceerde opname-instellingen. Selecteer het fotomanipulatietab en wijzig de dubbelklikherhalingen in twee en klik vervolgens op oké. Selecteer het xy-tab in het focusvenster.Controleer in het fotomanipulatietab de laserparameters. Stel vervolgens de laserinstellingen in om de cel van belang te fotoconverteren, zonder fotoconversie van de omringende cellen. Schakel onder opnametype het vakje tijdsverloop in en klik vervolgens op start.Zodra het venster voor live tijdsverloop wordt geopend, selecteert u het cirkelgereedschap in de bovenste werkbalk. Teken een cirkel in het middelste gebied van de cel, klik vervolgens met de rechtermuisknop op de getekende cirkel, selecteer FRAP-gebied en wacht drie seconden. Het geselecteerde gebied zou donkerder moeten worden, wanneer u dat doet, klikt u op stoppen opnemen.Als u meer dan een dier beeldvormt, gaat u terug naar het xy-tab in het focusmenu en selecteert u positie twee. Herhaal vervolgens de fotoconversie. Om een celpopulatie te converteren, volgt u het protocol en de laserparameters door het venster voor tijdsverloop te openen.Gebruik nu, in plaats van een cirkel te tekenen om het gebied van belang te FRAP, het lijngereedschap om een lijn te tekenen op het gebied van belang. FRAP vervolgens het gebied met behulp van dezelfde parameters die zojuist zijn gedemonstreerd. Zodra alle punten zijn fotogeconverteerd, selecteert u onder het dropdown-tab van de opname-instellingen in het opnamevenster de lab-specifieke standaardstackinstelling die eerder in deze video is beschreven.Selecteer de c488-laser en stel de belichting in op 300 milliseconden, het laservermogen op vijf en de intensiteit op 75. Selecteer de c541-laser en stel de belichting in op 500 milliseconden, het laservermogen op tien en de intensiteit op 75. Schakel onder het gedeelte opnametype het 3D-vakje in.In het 3D-opnamegedeelte, selecteer gebruik huidige positie en vink het bereik rond de huidige aan. In hetzelfde gedeelte stelt u het bereik in op 35, het aantal vlakken op 36 en de stapgrootte op een.

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo's. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Hier presenteren we een methode voor het foto-geactiveerd schakelen van photoconverteerbare fluorescerende eiwitten (PCFPs) in het levende zebravisembryo en het verdere volgen van het photoconverteerde eiwit op specifieke tijdstippen tijdens de ontwikkeling. Deze methodologie maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen te monitoren die ten grondslag liggen aan verschillende ontwikkelingsprocessen in een levend gewerveld organisme.

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes' migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Het bestuderen van de vroegste gebeurtenissen van preneoplastische cel progressie en aangeboren immuunsysteem interactie cel is cruciaal om te begrijpen en behandelen van kanker. Hier beschrijven we een methode om epitheelcellen transformaties en de daaropvolgende live beeldvorming van aangeboren immuunsysteem interactie cel met HRAS G12V uiten huidcellen in de zebravis larven voorwaardelijk induceren.

Live-Imaging van aangeboren immuunsysteem en preneoplastische cel interacties Met behulp van een Inducible Gal4 / UAS Expression System in larvale zebravis Skin

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

We hebben het fotoomzetbare PSmOrange-systeem geïntroduceerd als een krachtig, eenvoudig en kosteneffectief hulpmiddel voor in vivo celtracking in GFP transgene achtergrond. Dit protocol beschrijft de toepassing ervan in het zebravis modelsysteem.

Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

Dit protocol beschrijft een methode voor de photoconversion van Kaede fluorescent proteïne in endocardial cellen van de levende zebrafish embryo waarmee het volgen van endocardial cellen tijdens de atrioventriculaire kanaal en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling .

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

Presenteren we een efficiënt en gemakkelijk te gebruiken protocol voor het voorbereiden van primaire celculturen van zebravis embryo's voor transfectie en levende cel imaging, evenals een protocol bij het bereiden van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen.

Cultuur en de transfectie van zebravis primaire cellen

Leer eencellige fotoconversie in levende zebravis voor ontwikkelingsbiologie met behulp van het Eos-eiwit. Deze minimaal invasieve methode maakt visualisatie van celmigratie in vivo mogelijk.

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Meer video's verkennen