Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Het algemene doel van deze fotoconversietechniek is om enkele cellen in een enkel dier te onderscheiden van andere fluorescerende celpopulaties. Deze methode kan helpen om belangrijke ontwikkelingsvragen in het veld te beantwoorden en ons in staat stellen om celmigratie over tijd te visualiseren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het minimaal invasief is en kan worden gebruikt om enkele cellen of grotere populaties te labelen.

Bovendien kan de gebruiker het specifieke gebied van belang selecteren en het gewenste doelwit fotoconversie ondergaan. Na het paring van mannelijke en vrouwelijke transgene zebravissen die een fotoconversibel eiwit tot expressie brengen en het verzamelen van de eieren volgens het tekstprotocol, gebruik een dissectief microscoop met een lichtbron van 488 nanometer en GFP-filtersets om 24 hpf embryo's te screenen. Gebruik een naald of pincetten om de embryo's handmatig te dechorioneren.

Bereid in de magnetron vijf milliliter 0,8% low melting point agarose-oplossing. Zodra de agarose is afgekoeld tot het aanraken, plaats drie tot vier verdoofd transgene sox10 eos-positieve 48 hpf vissen in het midden van een tien millimeter glazen dekselbodem Petri-schaal. Voeg ongeveer een millimeter, of genoeg agarose om het oppervlak van het deksel te bedekken, toe.

Gebruik vervolgens een sondenaald om de vissen op hun zij te rangschikken, ze indien nodig aan te passen, terwijl de agarose stolt, wat ongeveer twee minuten zal duren. Nadat de agarose gedurende twee minuten is gestold, voeg langzaam embryomedium toe dat 0,02% aminobenzoëzuur ester tricaïne bevat in de schaal, totdat het onderste oppervlak van de agar en de schaal is ondergedompeld. Om confocale microscopie uit te voeren, open de confocale software en selecteer de opname- en focusvensters.

Voer voorafgaande beeldvorming uit, selecteer onder het opnamevenster en de dropdown-tab van de opname-instellingen de beeldvormingsparameters. Hier worden de lab-specifieke stackinstellingen genoemd, visbeeldvorming. Plaats het monster op de confocale microscoop en gebruik de grove en fijne afstelknoppen om het scherp te stellen.

Open vervolgens het focusvenster en lokaliseer het gewenste gebied van belang, zoals het dorsale wortelganglion. Selecteer onder het filtersetmenu de c488-laser, stel de belichting in op 300 milliseconden, de laservermogen op vijf en de intensiteit op 75. Selecteer vervolgens onder het gedeelte opnametype het 3D-vakje.

In het 3D-opnamegedeelte, selecteer gebruik huidige positie en vink het bereik rond de huidige aan. In hetzelfde gedeelte stelt u het bereik in op 35, het aantal vlakken op 36 en de stapgrootte op een. Selecteer de huidige locatie en klik vervolgens op start onderaan het opnamevenster om een afbeelding te verkrijgen.

Voor de fotoconversieprocedure, zorg ervoor om de laserparameters dubbel en drievoudig te controleren. Soms is het noodzakelijk om de conversie-instellingen opnieuw aan te passen wanneer het conversievenster open is. Selecteer in het opnamevenster, onder het dropdown-tab van de opname-instellingen, de lab-specifieke conversie-beeldvormingsinstelling.

Hier wordt de lab-specifieke instelling genoemd, fish ablate full chip. Selecteer in het filtermenu de c488 en c541-lasers. Stel de belichtingen in op 300 milliseconden, het laservermogen op vijf en de intensiteit op 75, wat voldoende fluorescerend signaal zal produceren zonder fotobleking of toxiciteit te veroorzaken.

Klik in het focusvenster op het fotomanipulatietab en verander de laserstack-vermogen in twee en klik vervolgens op gaan. Wijzig de rasterblokgrootte in een en klik op instellen. Wijzig vervolgens de dubbelklikgrootte in vier en de laserlijn in v405.

Open vervolgens in het opnamevenster de geavanceerde opname-instellingen. Selecteer het fotomanipulatietab en wijzig de dubbelklikherhalingen in twee en klik vervolgens op oké. Selecteer het xy-tab in het focusvenster.

Controleer in het fotomanipulatietab de laserparameters. Stel vervolgens de laserinstellingen in om de cel van belang te fotoconverteren, zonder fotoconversie van de omringende cellen. Schakel onder opnametype het vakje tijdsverloop in en klik vervolgens op start.

Zodra het venster voor live tijdsverloop wordt geopend, selecteert u het cirkelgereedschap in de bovenste werkbalk. Teken een cirkel in het middelste gebied van de cel, klik vervolgens met de rechtermuisknop op de getekende cirkel, selecteer FRAP-gebied en wacht drie seconden. Het geselecteerde gebied zou donkerder moeten worden, wanneer u dat doet, klikt u op stoppen opnemen.

Als u meer dan een dier beeldvormt, gaat u terug naar het xy-tab in het focusmenu en selecteert u positie twee. Herhaal vervolgens de fotoconversie. Om een celpopulatie te converteren, volgt u het protocol en de laserparameters door het venster voor tijdsverloop te openen.

Gebruik nu, in plaats van een cirkel te tekenen om het gebied van belang te FRAP, het lijngereedschap om een lijn te tekenen op het gebied van belang. FRAP vervolgens het gebied met behulp van dezelfde parameters die zojuist zijn gedemonstreerd. Zodra alle punten zijn fotogeconverteerd, selecteert u onder het dropdown-tab van de opname-instellingen in het opnamevenster de lab-specifieke standaardstackinstelling die eerder in deze video is beschreven.

Selecteer de c488-laser en stel de belichting in op 300 milliseconden, het laservermogen op vijf en de intensiteit op 75. Selecteer de c541-laser en stel de belichting in op 500 milliseconden, het laservermogen op tien en de intensiteit op 75. Schakel onder het gedeelte opnametype het 3D-vakje in.

In het 3D-opnamegedeelte, selecteer gebruik huidige positie en vink het bereik rond de huidige aan. In hetzelfde gedeelte stelt u het bereik in op 35, het aantal vlakken op 36 en de stapgrootte op een.