Name: Muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor RNA analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer hoe je wit vetweefsel verzamelt bij muizen en hoogwaardige RNA isoleert voor genexpressieonderzoek. Deze methode is essentieel voor metabole en moleculair-biologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door Diabetes Canada.

<ol><li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC. Public Health. 9, 88(2009).</li>
<li>Wronska, A., Kmiec, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characteristics+of+various+white+adipose+tissue+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots.</a> Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).</li>
<li>Ibrahim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue%3A+structural+and+functional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Rev%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences.</a> Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+identification%2C+and+excision+of+murine+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/246759856_RNA_Isolation_from_Adipose_Tissue_An_Optimized_Procedure_for_High_RNA_Yield_and_Integrity">RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity.</a> Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).</li>
<li>Cirera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+isolation+of+total+RNA+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue.</a> BMC Res Notes. 6, 472(2013).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+protein+extraction%3A+the+past+and+the+present%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present.</a> J Biomed Biotechnol. 2009, 574398(2009).</li>
<li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnol. 14, 94(2014).</li>
<li>Tan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+prorenin%2Frenin+receptor+on+the+development+of+obesity+and+associated+cardiometabolic+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver.+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors.</a> Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), 1-5 (2010).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+a+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+increases+in+circulating+prorenin+are+not+associated+with+renal+or+cardiac+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies.</a> Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).</li>
<li>Dusaulcy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-specific+disruption+of+autotaxin+enhances+nutritional+fattening+and+reduces+plasma+lysophosphatidic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid.</a> J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines%3A+a+link+between+obesity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease.</a> J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+RT-quantitative+PCR%3A+firsthand+observations+of+implementation+of+minimum+information+for+the+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments+%28MIQE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE).</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).</li>
<li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Volgende HF-dieet voeding, zwaarlijvig muizen bleken te zijn toegenomen lichaam en wit vetweefsel gewichten in vergelijking met muizen gevoed een N-dieet. RNA geëxtraheerd met behulp van fenol oplossing leverde monsters met goede zuiverheid. Leptine is een adipokine dat voornamelijk geproduceerd door vetweefsel en te correleren positief met vet massa16is bekend. Zoals verwacht, leptine mRNA uitdrukking toename in obesitas muizen samengaan met hun dikke massa.
Deze metho...

Obesitas is een wereldwijde epidemie die tot complicaties, zoals type 2 diabetes1 leiden kan. Zwaarlijvig en genetisch gemodificeerde voeding-geïnduceerde dierlijke modellen worden vaak gebruikt voor onderzoek in de obesitas en zijn bijbehorende complicaties. Traditioneel, witte vetweefsel is bekend als een opbergvak voor overtollige energie en bestaat meestal uit lipiden terwijl bruin vetweefsel energie in warmte2,3 omzet. Vetweefsel zal is dynamisch en uitbreiden en verkleinen afhankelijk van vele factoren zoals de voedselinname en lichaamsbeweging. Vandaar, om te bepalen bijdragende factoren aan deze veranderingen, voldoende adipeus weefsel collectie en behandeling zijn vereist4.
Onder witte vetweefsel, is het algemeen aanvaard dat onderhuids en viscerale vet depots verschillende eigenschappen zoals anatomische lokalisatie hebben en functie van2,5. Dus, om te voorkomen dat tegenstrijdige resultaten of grote variabiliteit, aandacht zouden worden genomen om te voorkomen van kruisbesmetting tussen deze verschillende vet depots bij het verzamelen van vet pads.
Bovendien zijn er drie grote uitdagingen bij het isoleren van RNA of eiwit uit muizen witte adipeus weefsel. Ten eerste is verzamelen vet pads in zwaarlijvige muizen niet een gemakkelijke taak als de grens die scheidt van verschillende wit vet depots niet altijd duidelijk, in tegenstelling tot andere organen zoals de nieren en hart6 is. Ten tweede, vanwege het hoge vetgehalte van vetweefsel, tijdens RNA of eiwit isolatie, een laag van lipiden boven en directe toegang tot het monster verhindert. Ten derde, in tegenstelling tot bruin vetweefsel of andere weefsels, witte vetweefsel heeft aanzienlijk lager RNA en eiwit gehalte en dit is van groot belang bij het gebruik van de jonge muizen, muizen gevoed een normale (N) dieet en muizen die naar verwachting hebben lage vet massa (d.w.z. KO modellen, behandeling met geneesmiddelen, oefening, opleiding, enz.) 7 , 8.
Dus, het kiezen van de juiste methode om te isoleren van RNA van vetweefsel is essentieel. Alternatieve methoden voor de winning van fenol/chloroform zijn commerciële kits. Ze zijn meestal gebaseerd op een eerste fenol extractie stap, gevolgd door RNA zuivering op een kolom9. Echter, deze kits zijn meestal duurder en geven van monsters van lagere opbrengst, terwijl de RNA-kwaliteit zou variabele maar zijn minder tijdrovend. Een van de grootste voordelen van fenol oplossing/chloroform extractie hier beschreven is echter de mogelijkheid van het isoleren van RNA, DNA en eiwit uit een monster10. Omdat muizen vet pads meestal klein zijn en kleine hoeveelheid RNA en eiwitten (vooral in mager Muismodellen geven), maximaliseren deze protocollen de gegevens die men uit een kleine steekproef krijgen kan.
Het doel van deze paper is om te beschrijven in detail een methode om te zorgen voor adequaat monster collectie van drie muizen witte vetweefsel depots evenals de hoeveelheid en de kwaliteit van RNA isolatie. RNA verkregen door het volgen van dit protocol kan worden gebruikt om uit te voeren real-time PCR-testen. Dit protocol is niet bedoeld voor RNA isolatie van gekweekte primaire adipocytes.

<table><tbody><tr><td>1 mL spuiten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE-oplossing (10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA•Na2. pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G naalden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G naalden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Block heater (droogbad)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 U/µl)&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent kleurstof&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Filterspuittips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Gaas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrijk knaagdierdieet</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Leptine voorwaartse PCR-primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptine omgekeerde PCR-primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transcriptase (enzym en 5x buffer)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Nanopure water (ook wel ultrapuur water)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril onderzoekshandschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitril handschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normaal knaagdierdieet</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenoloplossing (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Vooraf geïdentificeerde aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwarts spectrofotometer cuvet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack voor PCR-buisjesstrips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Racks voor RT-PCR-buisjesstrips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Random hexamers&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR Rotor Gene systeem&nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde tafelcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase-remmer&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrije 1,5 mL eppendorfbuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrije 1,5 mL schroevendopbuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrije PCR-buisjesstrips (0,2 mL) en doppen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrij water&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR machine</td><td>Qiagen</td><td>Roto-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR-buisjesstrips (0,1 mL) en doppen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 voorwaartse PCR-primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 omgekeerde PCR-primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>RVS mortel en stamper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische pads</td><td>Zelfgemaakt van een schuimbord omhuld door een wegwerpbare absorberende onderlaag</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermische cycler&nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weegspatels</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor rna analyse

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Vergeleken met andere weefsels, heeft witte vetweefsel een aanzienlijk minder RNA en eiwit gehalte voor downstream toepassingen zoals real-time PCR en Western Blot, omdat het meestal lipiden bevat. RNA isolatie van adipeus weefselmonsters is ook een uitdaging zoals er extra stappen vereist zijn om te voorkomen dat deze lipiden. Hier presenteren we een procedure voor het verzamelen van drie anatomisch verschillende witte vetweefsel van muizen, voor het verwerken van deze monsters en uitvoeren van RNA isolatie. Verder beschrijven we de synthese van cDNA en gen expressie experimenten met behulp van PCR in real time. De hierbij beschreven protocol staat toe de vermindering van de verontreiniging van de haren en bloed op vet pads evenals kruisbesmetting tussen de verschillende dikke pads tijdens weefsel collectie van het dier. Het is ook geoptimaliseerd om ervoor te zorgen voldoende kwantiteit en kwaliteit van het RNA gehaald. Dit protocol kan worden alom toegepast op elk muismodel waar adipeus weefselmonsters nodig voor routinematige experimenten zoals PCR in real time zijn, maar is niet bedoeld voor de isolatie van de cultuur van de cel van de primaire adipocytes.

Volgens de procedure van de necropsie, drie witte vetweefsel wordt ingezameld en gewogen van de twee groepen muizen (N en HF dieet-gevoed muizen). Zoals verwacht, toegenomen muizen op het HF dieet definitieve lichaamsgewicht en gewichtstoename ten opzichte van nestgenoten op N dieet (tabel 1). Deze observaties werden begeleid door meer dan een 2-fold verhoging van het gewicht van de PGF, PRF en SCF in zwaarlijvige muizen vergeleken met die op N dieet.
<p class="jove_c...

Het doel van deze paper is te presenteren een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van verschillende witte vetweefsel van muizen, de vet monsters te verwerken en extraheren van RNA.

Muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor RNA analyse

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Het algemene doel van deze procedure is om een adequate monsterverzameling van witte adipeuse weefselopbrengst van verschillende muizen te garanderen en om een hoge hoeveelheid goede kwaliteit RNA uit het weefsel te isoleren. Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van metabolisme, biochemie en moleculaire biologie die, bijvoorbeeld, betrekking hebben op genexpressie in vetweefsel van behandelde of genetisch gemodificeerde muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de isolatie mogelijk maakt van grote hoeveelheden goede kwaliteit RNA uit vetweefsel dat doorgaans een lage RNA-inhoud heeft.Emilie Pepin, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Na het euthaniseren van een muis, snijdt u de huid over de linea alba volgens het tekstprotocol en maakt u vervolgens twee sneden van ongeveer twee centimeter vanuit het midden van de ribbenkast richting de rechterarm en dichtbij de geslachtsorganen boven de rechterachterpoot. Strek een hoek van de geopende huid en gebruik een 22-gauge naald om het op de pad vast te pinnen.Pik vervolgens de andere hoek vast. Gebruik chirurgische schaar die zo plat mogelijk tegen de huid is gepositioneerd, om een stompe dissectie van het abdominale subcutane vet, of SCF, uit te voeren en breng het over naar een voorgesneden stuk aluminiumfolie. Herhaal de dissectie voor de linkerkant van het dier.Trek vervolgens zowel de linkse als de rechter verzamelde vetkussens in de aluminiumfolie en gebruik vloeibare stikstof om het monster te bevriezen. Om toegang te krijgen tot het viscerale vetweefsel, snijdt u de buikspier langs de linea alba. Maak vervolgens een snede in de buikspieren van de geslachtsdelen naar de rug van de muis aan beide kanten.Het vet rond de voortplantingsorganen is het perigonadale vet, of PGF. Los de linker- en rechtervetkussens los van de epididymis, de testikels en de ductus deferens en breng het over naar de vooraf gelabelde aluminiumfolie. Bevriest vervolgens het monster in vloeibare stikstof.Beginnend met de linkerkant, legt u de nieren bloot door de darmen van de buikholte naar de rechterkant te verplaatsen. Het vetweefsel dat hier rond de nier en de bijnieren te zien is, is het perirenale vet, of PRF. Isoleer en verwijder de bijnieren voordat u het PRF verzamelt.Dit kan vervelend zijn omdat ze net iets rozeër zijn dan het vetweefsel. Isoleer nu het PRF van de achterste spierwand en snijdt de urineleider, de nierslagader en de ader door die de PRF en nier scheidt van de rest van het lichaam. Isoleer vervolgens het PRF van de nier door de nierscapsule te snijden en te verwijderen.Na het isoleren van de rechter PRF, brengt u het monster over naar de aluminiumfolie met het weefsel van de linkerkant en gebruikt u vloeibare stikstof om de monsters te bevriezen. Koel 1,5-milliliter RNase-vrije conische buisjes, een mortel en stamper en een spatel in vloeibare stikstof volgens het tekstprotocol. Doe het vetweefselmonster in de mortel en gebruik vervolgens een paar lagen bruin papier om de stamper van de vloeibare stikstof te tillen en deze in de mortel te passen.Terwijl u de stamper met het papier vasthoudt, gebruikt u de hamer om een of twee keer op de bovenkant van de stamper te slaan. Maal vervolgens het monster met een roterende beweging tot een fijn poeder is verkregen. Verwijder vervolgens de stamper, haal de spatel uit de vloeibare stikstof en gebruik deze om het monster over te brengen naar het overeenkomstige voorgekoelde 1,5-milliliter conische buisje.Dompel de spatel van tijd tot tijd terug in vloeibare stikstof om te voorkomen dat het monster smelt. Houd ook het conische buisje op droog ijs om te voorkomen dat het monster ontdooit. Vul het conische buisje tot ongeveer 2/3 van de capaciteit met gemalen monster voor een adequate RNA-opbrengst.Bereid vervolgens de resterende monsters volgens het tekstprotocol. Onder een chemische kap en terwijl u een laboratoriumjas, handschoenen en veiligheidsbril draagt, verwijdert u een gemalen monster uit vloeibare stikstof. Open de buis langzaam en voeg 500 microliter fenooloplossing toe.Sluit het deksel van de buis en vortex met maximale snelheid gedurende ongeveer vijf seconden, open vervolgens langzaam en voorzichtig de buis om de druk van de stikstof vrij te geven. Het geluid van lucht dat uit de buis komt, zal worden gehoord. Pipetteer nog eens 500 microliter fenooloplossing in de buis.Vortex vervolgens en open het langzaam zoals eerder. Vortex het monster totdat het volledig is opgelost. Open vervolgens de buis om de druk vrij te geven voordat u aanvullende monsters verwerkt.Zodra alle monsters zijn verwerkt, vortex ze kortstondig met maximale snelheid en incubeer ze vijf minuten op kamertemperatuur. Centrifugeer de buisjes 12.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de buisjes terug naar kamertemperatuur.Om besmetting te voorkomen, gebruikt u voor elk monster een P1000 pipet met een gefilterde tip om zoveel mogelijk RNA te isoleren uit de middelste roze laag door de lipidefase nabij de zijkant van de buis te doorboren. Spuit het RNA in de nieuwe conische buisjes zonder de zijden van de buizen aan te raken om te voorkomen dat lipiden die op de buitenkant van de tip aanwezig zijn, worden overgebracht. Voeg 200 microliters zuiver chloroform toe aan elk monster en meng de buisjes door 15 seconden om te keren.Nadat de monsters gedurende 10 minuten op kamertemperatuur zijn geïncubeerd, centrifugeer de buisjes 12.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten en breng de buisjes terug naar kamertemperatuur. Gebruik voor elk monster een P1000 pipet en gefilterde tips om zoveel mogelijk waterige transparante RNA-bevattende bovenste fase over te brengen naar de tweede set overeenkomstige conische buisjes. Voeg vervolgens 500 microliters 100% isopropanol toe aan elk monster en meng de buisjes door 15 seconden om te keren.<

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We rapporteren een procedure om RNA met hoge integriteit te isoleren uit de ribonuclease-rijke muizenpancreas.

RNA isolatie van Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rijke Tissue

Opeenvolgende cryo-secties verzameld histologische toepassingen en verrijking van RNA voor genexpressie metingen met aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Hoogwaardige RNA wordt verkregen 20-30 mg samengevoegd vriescoupes en metingen worden direct vergeleken verschillende applicaties.

Cryosectioning aaneengesloten Regio&#39;s van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses

Hier beschrijven we een protocol voor een reproduceerbare laser vangt microdissection (LCM) voor het isoleren van trabecular gevlochten (TM) voor downstream RNA analyse. De mogelijkheid om het analyseren van wijzigingen in genexpressie in het Vertaalgeheugen zal helpen bij het begrijpen van de moleculaire mechanismen van TM-gerelateerde oogbeschadigingen en/of ziekten.

Laser vangt Microdissection voor zeer zuivere Trabecular Zitschalen van muis ogen gen expressie p.a.

Een laser Capture microdissection (LCM)-protocol werd ontwikkeld om voldoende hoeveelheid kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen voor genexpressie analyse in botcellen. De huidige studie focust op de muis dijbeen secties. Het hier gerapporteerde LCM-protocol kan echter worden gebruikt om genexpressie in cellen van een hard weefsel te bestuderen.

Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten

Een cryogene verpulveringsmethode om muriene poten te verwerken met behulp van een vloeibare stikstof vriezer molen werd ontwikkeld om de opbrengst en kwaliteit van RNA of eiwit geëxtraheerd uit de weefsels te verbeteren en de analyse van Moleculaire profielen in verband met inflammatoire Reacties.

Een Cryo-pulverisatie protocol voor het verwerken van muis poten voor het evalueren van moleculaire trajecten van weefsel ontsteking in een model van collageen geïnduceerde artritis

Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools.

Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

Hier bieden we een praktische procedure voor het ontleden en uitvoeren van histologische en genexpressie-analyses van supraclaviculair bruin vetweefsel bij muizen.

Dissectie, histologische verwerking en genexpressieanalyse van supraclaviculaire bruine vetweefsel bij muizen

Dit protocol beschrijft een methode om RNA te isoleren uit gedefinieerde histologische gebieden van paraformaldehydegebonden, Optimal Cutting Temperature-verbinding-ingebedde muizenleverweefsel met behulp van lasercapture-microdissectie, waardoor gerichte downstream genexpressie-analyse mogelijk is.

Laservangstmicrodissectie van paraformaldehyde-gefixeerd muizenleverweefsel voor RNA-analyse

Leer hoe je wit vetweefsel verzamelt bij muizen en hoogwaardige RNA isoleert voor genexpressieonderzoek. Deze methode is essentieel voor metabole en moleculair-biologische studies.

Muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor RNA analyse

Meer video's verkennen