Muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor RNA analyse

Het algemene doel van deze procedure is om een adequate monsterverzameling van witte adipeuse weefselopbrengst van verschillende muizen te garanderen en om een hoge hoeveelheid goede kwaliteit RNA uit het weefsel te isoleren. Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van metabolisme, biochemie en moleculaire biologie die, bijvoorbeeld, betrekking hebben op genexpressie in vetweefsel van behandelde of genetisch gemodificeerde muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de isolatie mogelijk maakt van grote hoeveelheden goede kwaliteit RNA uit vetweefsel dat doorgaans een lage RNA-inhoud heeft.

Emilie Pepin, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Na het euthaniseren van een muis, snijdt u de huid over de linea alba volgens het tekstprotocol en maakt u vervolgens twee sneden van ongeveer twee centimeter vanuit het midden van de ribbenkast richting de rechterarm en dichtbij de geslachtsorganen boven de rechterachterpoot. Strek een hoek van de geopende huid en gebruik een 22-gauge naald om het op de pad vast te pinnen.

Pik vervolgens de andere hoek vast. Gebruik chirurgische schaar die zo plat mogelijk tegen de huid is gepositioneerd, om een stompe dissectie van het abdominale subcutane vet, of SCF, uit te voeren en breng het over naar een voorgesneden stuk aluminiumfolie. Herhaal de dissectie voor de linkerkant van het dier.

Trek vervolgens zowel de linkse als de rechter verzamelde vetkussens in de aluminiumfolie en gebruik vloeibare stikstof om het monster te bevriezen. Om toegang te krijgen tot het viscerale vetweefsel, snijdt u de buikspier langs de linea alba. Maak vervolgens een snede in de buikspieren van de geslachtsdelen naar de rug van de muis aan beide kanten.

Het vet rond de voortplantingsorganen is het perigonadale vet, of PGF. Los de linker- en rechtervetkussens los van de epididymis, de testikels en de ductus deferens en breng het over naar de vooraf gelabelde aluminiumfolie. Bevriest vervolgens het monster in vloeibare stikstof.

Beginnend met de linkerkant, legt u de nieren bloot door de darmen van de buikholte naar de rechterkant te verplaatsen. Het vetweefsel dat hier rond de nier en de bijnieren te zien is, is het perirenale vet, of PRF. Isoleer en verwijder de bijnieren voordat u het PRF verzamelt.

Dit kan vervelend zijn omdat ze net iets rozeër zijn dan het vetweefsel. Isoleer nu het PRF van de achterste spierwand en snijdt de urineleider, de nierslagader en de ader door die de PRF en nier scheidt van de rest van het lichaam. Isoleer vervolgens het PRF van de nier door de nierscapsule te snijden en te verwijderen.

Na het isoleren van de rechter PRF, brengt u het monster over naar de aluminiumfolie met het weefsel van de linkerkant en gebruikt u vloeibare stikstof om de monsters te bevriezen. Koel 1,5-milliliter RNase-vrije conische buisjes, een mortel en stamper en een spatel in vloeibare stikstof volgens het tekstprotocol. Doe het vetweefselmonster in de mortel en gebruik vervolgens een paar lagen bruin papier om de stamper van de vloeibare stikstof te tillen en deze in de mortel te passen.

Terwijl u de stamper met het papier vasthoudt, gebruikt u de hamer om een of twee keer op de bovenkant van de stamper te slaan. Maal vervolgens het monster met een roterende beweging tot een fijn poeder is verkregen. Verwijder vervolgens de stamper, haal de spatel uit de vloeibare stikstof en gebruik deze om het monster over te brengen naar het overeenkomstige voorgekoelde 1,5-milliliter conische buisje.

Dompel de spatel van tijd tot tijd terug in vloeibare stikstof om te voorkomen dat het monster smelt. Houd ook het conische buisje op droog ijs om te voorkomen dat het monster ontdooit. Vul het conische buisje tot ongeveer 2/3 van de capaciteit met gemalen monster voor een adequate RNA-opbrengst.

Bereid vervolgens de resterende monsters volgens het tekstprotocol. Onder een chemische kap en terwijl u een laboratoriumjas, handschoenen en veiligheidsbril draagt, verwijdert u een gemalen monster uit vloeibare stikstof. Open de buis langzaam en voeg 500 microliter fenooloplossing toe.

Sluit het deksel van de buis en vortex met maximale snelheid gedurende ongeveer vijf seconden, open vervolgens langzaam en voorzichtig de buis om de druk van de stikstof vrij te geven. Het geluid van lucht dat uit de buis komt, zal worden gehoord. Pipetteer nog eens 500 microliter fenooloplossing in de buis.

Vortex vervolgens en open het langzaam zoals eerder. Vortex het monster totdat het volledig is opgelost. Open vervolgens de buis om de druk vrij te geven voordat u aanvullende monsters verwerkt.

Zodra alle monsters zijn verwerkt, vortex ze kortstondig met maximale snelheid en incubeer ze vijf minuten op kamertemperatuur. Centrifugeer de buisjes 12.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng vervolgens de buisjes terug naar kamertemperatuur.

Om besmetting te voorkomen, gebruikt u voor elk monster een P1000 pipet met een gefilterde tip om zoveel mogelijk RNA te isoleren uit de middelste roze laag door de lipidefase nabij de zijkant van de buis te doorboren. Spuit het RNA in de nieuwe conische buisjes zonder de zijden van de buizen aan te raken om te voorkomen dat lipiden die op de buitenkant van de tip aanwezig zijn, worden overgebracht. Voeg 200 microliters zuiver chloroform toe aan elk monster en meng de buisjes door 15 seconden om te keren.

Nadat de monsters gedurende 10 minuten op kamertemperatuur zijn geïncubeerd, centrifugeer de buisjes 12.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten en breng de buisjes terug naar kamertemperatuur. Gebruik voor elk monster een P1000 pipet en gefilterde tips om zoveel mogelijk waterige transparante RNA-bevattende bovenste fase over te brengen naar de tweede set overeenkomstige conische buisjes. Voeg vervolgens 500 microliters 100% isopropanol toe aan elk monster en meng de buisjes door 15 seconden om te keren.