Name: In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Leer intestinale epitheliale celpermeabiliteit meten in vitro en in vivo bij muizen. Deze methoden helpen onderzoekers gastro-intestinale ziekten en epitheelbarrièrefunctie bestuderen voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij Dr. Jerrold R. Turner, van Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, bedanken voor zijn genereuze hulp bij het voltooien van deze studie. Dit werk wordt ondersteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (subsidie nummer 81470804, 31401229 en 81200620), de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (subsidie nummer BK20180838 en BK20140319), The Research Program voor innovatie College afgestudeerden van de oostelijke provincie Jiangsu (subsidie nummer KYLX16-0116), Advanced Research projecten van Soochow Universiteit (subsidie nummer SDY2015_06), en ziekte van Crohn & Colitis Foundation Research Fellowship Award (verlenen nummer 310801).

Deze studie werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Protocol van Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow Universiteit.
1. plating en het onderhoud van Caco-2bbe op poreuze polycarbonaat membranen
<ol><li>Groeien van cellen in een maatkolf van T75 met media (DMEM met 10% FBS). Kolven moeten regelmatig, afhankelijk van de celdichtheid worden gevoed. Opmerking: Voor optimale beplating, cellen moeten verdelen snel en hebben een plat "gebakken-ei"-vorm, die aangeeft dat cellen in de groeifase.</li>
	<li>Zodra de cellen 80% confluente, nemen de kolf uit de incubator zijn en verwijder het medium. Spoel alle resterende media met 1-2 mL steriele PBS (zonder Ca2 +). Pipetteer 1,5 mL trypsine-EDTA in de kolf en zachtjes rock van de kolf; dan, plaats de kolf in de incubator van de 37 ° C gedurende 20 minuten zonder schommelen.</li>
	<li>Terwijl de cellen zijn trypsinizing, plaats ingevoegd die bevat, poreuze polycarbonaat membranen (poriegrootte, 0.4 µm; oppervlakte, 0,33 cm2; Zie Tabel van materialen) in 24-Wells-platen. Voeg 1,0 mL voedingsbodems in de basale zaal (de lagere ruimte van het membraan).</li>
	<li>Pipetteer 5 mL van de media in de kolf en krachtig Pipetteer de cellen tegen de zijkant van de kolf 5 - 10 keer om losse, afzonderlijke cellen of 2-3 cel samengeklonterd.</li>
	<li>
Plaat 0.166 milliliters cellen (het bereiken van een verdunningsverhouding 1:8) in de apicale kamer (de bovenste ruimte van het membraan). Incubeer bij 37 ° C gedurende maximaal 3 weken.
	<ol>
<li>Voeden cellen drie keer wekelijks door zorgvuldig aspirating de media van de basale compartiment van elk goed met een drukpomp. Voorzichtig druppelen 1 mL van de media in de apicale kamer van elke toevoeging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. gebruik van epitheliale Meter (Volt/Ohm) voor het meten van de TER
Opmerking: Na ongeveer 3 weken cultuur op polycarbonaat membranen, Caco-2BBe cellen zijn klaar voor TER meting.
<ol><li>Voor cytokine studies, één dag vóór de meting, vervangen door de basale media media met 10 ng/mL van IFNγ. Op de dag van het experiment, door de media te vervangen door HBSS met 2.5 of 7.5 ng/mL van TNF. Opmerking: IFNγ behandeling verhoogt expressie van TNF receptor 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Om te corrigeren de meter, de correctie-elektrode in de invoerpoort invoegen en kies "Ohm" modus. Pas de R Adj schroef met een schroevendraaier, totdat de meter een lezing van 1000 Ω geeft.</li>
	<li>De elektroden steriliseren door ze te plaatsen in 70% ethanol voor 15-30 min en laat ze in de lucht droog voor 15 s. spoeling de elektrode in de experimentele cel-cultuur-media.</li>
	<li>Zet de macht, en de "Ohm" modus kiest. Zorgvuldig plaatst de lange uiteinden van de elektrode bruggen in de basale zaal en de korte uiteinden in de apicale kamer. Ervoor zorgen dat de langere elektroden de onderkant van de schotel, raken terwijl de kortere elektroden onder het oppervlak van de media, maar vooral de weefselkweek inserts. Houd de elektroden verticale.</li>
	<li>Meet de weerstand van de steekproef inzetstukken en lege inserts (dat wil zeggen, de cultuur wordt ingevoegd zonder cellen maar met HBSS) op 0, 1, 2, 3, 4 uur na de behandeling van cytokine. Record de weerstand.</li>
	<li>Om consistentie in verschillende plaat formaten, berekenen het product van de weerstand en het gebied van effectieve membraan: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> Voor 24-well inzetstukken is het gebied van effectieve membraan 0.33 cm2.</li>
</ol>3. lymfkliertest Model van Dextran (II) sulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde Colitis
<ol><li>Meng DSS met gesteriliseerde met autoclaaf water om een eindconcentratie van 3,5% (wt/vol).</li>
	<li>Beheren van 3,5% DSS naar 8-week-oude mannelijke C57BL/6 muizen voor een totaal van 7 dagen. Regelmatige drinkwater zonder DSS geven controle muizen.<ol>
<li>Activeer de DSS-bevattende water regelmatig drinkwater na dag 7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Weeg muizen en beoordelen van klinische scores van elke muis elke dag. Lichaamsgewicht van elke muis te zijn eerste lichaamsgewicht te normaliseren. Scores worden gedefinieerd volgens de ernst van de ziekte door vier parameters: rectale verzakking (0-2), consistentie van de ontlasting (0-2), bloeden (0-2) en activiteit (0-2)5. Som van de scores van deze parameters voor een klinische eindscore.</li>
	<li>Als u wilt analyseren de histopathologische conditie van het weefsel van de dikke darm, euthanaseren muizen door intraperitoneaal (i.p.) injectie met 1,2% (vol/vol) Avertin (0,6 mL/10 g lichaamsgewicht) 7 dagen de behandeling van de post-DSS. Ter voorbereiding van een voorraad van 100% avertin, meng 10 g van 2,2,2-tribromoethanol met 10 ml van tert-amyl alcohol.  Opslaan in het donker bij 4° C. Als u wilt gebruiken, Verdun 100% voorraad tot 2% in water.</li>
	<li>Isoleren van de dikke darm en blindedarm en meet de lengte van de dikke darm5.</li>
	<li>Gesneden 0.5 cm segmenten van de distale dubbelpunt en correctie in een tube van 15 mL falcon met 10 mL 10% formaline 's nachts. Wassen van de vaste weefsels met gesorteerde ethanol (75, 95 en 100%) en xyleen. Het weefsel inbedden in paraffine en snijd 6 mm secties voor de haematoxyline en eosine-kleuring van8.</li>
</ol>4. meten van de permeabiliteit van de epitheliale barrière bij DSS-geïnduceerde Colitis muizen
<ol><li>Het meten van de permeabiliteit van de barrière 7 dagen na het begin van DSS administratie.</li>
	<li>Op de dag van de test, snel muizen gedurende 3 uur.</li>
	<li>Autoclaaf een maagsonde naald zodat steriliteit, vervolgens maagsonde muizen met 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran in steriel water, en houden de ongebruikte FITC-Dextraan voor het meten van de standaard curve na serum collectie. Weeg de muizen voor de berekening van de permeabiliteit. Nota: De FITC-dextran oplossing moet worden gemaakt in water.</li>
	<li>Met behulp van een paar van schaar, clip van een stuk van 1 cm van de staart, en verzamelen van 100 µL bloed uit de staart in serum collectie buizen. Draai het verzamelde bloed bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verdun de serum 1:4 in water. Te maken van een standaard kromme, ongebruikte FITC-dextran met water bij 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000, verdunnen 1:10, 000, 1:30, 000, 1:100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000 en 1:3, 000, 000. Voeg 100 µL per putje van het serum en de standaard curve monsters in 96-wells-platen.</li>
	<li>Lees de fluorescentie in een afleesapparaat met 485 excitatie/528 emissie. Berekenen van de waarden van de permeabiliteit gebaseerd op de standaard curve, en vermenigvuldig met 4 om te corrigeren voor de verdunning.</li>
	<li>De concentratie van FITC-dextran delen door het gewicht te normaliseren van de waarden (dit helpt normaliseren van het verschil in de FITC-dextran levering als muizen ziek zijn en hebben verloren gewicht).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. CaCO-2BBe (brush border-uitdrukken) cellen worden altijd gebruikt voor TER meting, geselecteerd uit de Caco-2 cellijn voor expressie van borstel-grens eiwitten. CaCO-2BBe cellen hebben een villosités absorberend fenotype als volledig-gesplitste (na ongeveer 3 weken voor cultuur na confluence)17. Het is noodzakelijk om te voorkomen dat besmetting tijdens de meting, en te steriliseren van de elektrode. Omdat de procedure niet-steriele is, alle...

Intestinale epitheliale cellen zijn niet alleen verantwoordelijk voor de absorptie van voedingsstoffen, maar vormen ook een belangrijke barrière te verdedigen tegen de pathogene micro-organismen en microbiële toxines. Deze functie van de intestinale barrière wordt gereguleerd door de strakke junction permeabiliteit en epitheliale cel integriteit1,2,3, en dysfunctie van de epitheliale barrièrefunctie is geassocieerd met ontstoken darm ziekte (IBD). De perijunctional actomyosine ring (PAMR) ligt in de cel die zich nauw aaneengesloten aan de strakke kruispunten. De inkrimping van de PAMR, die wordt geregeld door de myosin lichtketting (MLC), is van cruciaal belang voor de regulering van strakke junction permeabiliteit4,5,6,7,8, 9,10. Tumornecrosefactor (TNF) staat centraal in de intestinale barrière verlies door upregulating intestinale epitheliale MLC kinase (MLCK) expressie en inducerende occludin internalisering11,-12,13.
Ionen zoals Na+ en Cl- kunnen kruisen de paracellular ruimte door de porie of lek route14. In een "lekke" epitheel weerspiegelen veranderingen in TER voornamelijk veranderde tight junction permeabiliteit. TER meting is een veelgebruikte elektrofysiologische aanpak te kwantificeren tight junction doorlatend zijn, vooral voor nb+ en Cl-, op basis van de impedantie van de cel monolayers. Diverse celtypen, met inbegrip van intestinale epitheliale cellen, pulmonale epitheliale cellen en vasculaire endotheliale cellen, zijn gemeld voor TER metingen. Voordelen van deze methode zijn dat TER metingen niet-invasief zijn en kunnen worden gebruikt om levende cellen in real-time controleren. De meettechniek TER is bovendien handig voor drug toxiciteit studies15.
CaCO-2BBe cellen zijn cellen van de menselijke epitheliale colorectal adenocarcinoom met een structuur en functie vergelijkbaar met de gedifferentieerde kleine intestinale epitheliale cellen: bijvoorbeeld, deze cellen hebben microvilli en enzymen die zijn gekoppeld aan kleine intestinale borstel grens. Daarom, gekweekte Caco-2BBe monolayers worden gebruikt als een in vitro model voor het testen van de barrièrefunctie.
Bij muizen is unidirectioneel om te studeren van intestinale paracellular permeabiliteit door het meten van het vermogen van FITC-dextran te steken van de lumen in het bloed. Zo kan de intestinale permeabiliteit door gavaging FITC-dextran direct in muizen en het meten van de fluorescentie in het bloed worden beoordeeld. Het volgende protocol worden twee eenvoudige methoden om te beoordelen van de permeabiliteit van het intestinaal epitheel beschreven zowel in vitro als in vivo.

<table><tbody><tr><td>22 G gavage needle</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Zwarte 96-well platen voor fluorescentie</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6 muizen</td><td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2BBe cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>Dextraansulfaat natrium</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>DMED met hoge glucose en natriumpyrovaat</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>Epitheliaal (Volt/Ohm) Meter</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm ChemicalReagent</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Falcon buis (15 mL)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose&nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Modulair weefsel-inbeddingscentrum</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Serum collectiebuizen</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 fles</td><td>corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaat membranen (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Drukpomp</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Roterende Microtomie</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>XYleen</td><td>Sinopharm ChemicalReagent</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro en in vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

De intestinale barrière verdedigt tegen pathogene micro-organismen en microbiële toxine. De functie wordt gereguleerd door de strakke junction permeabiliteit en epitheliale cel integriteit en verstoring van de intestinale barrièrefunctie bijdraagt aan progressie van gastro-intestinale en systemische ziekte. Twee eenvoudige methoden worden hier beschreven voor het meten van de permeabiliteit van het intestinaal epitheel. In vitro, Caco-2BBe cellen zijn verguld in weefselkweek wells als een enkelgelaagde en transepithelial elektrische weerstand (TER) kan worden gemeten door een epitheliale (volt/ohm) meter. Deze methode is overtuigend vanwege de gebruiksvriendelijke bediening en herhaalbaarheid. In vivo muizen zijn gavaged met 4 kDa fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran, en de FITC-dextran-concentraties worden gemeten in verzamelde serummonsters van muizen om de epitheliale permeabiliteit. Mondelinge maagsonde biedt een nauwkeurige dosering, en daarom is de geprefereerde methode voor het meten van de intestinale permeabiliteit in vivo. Samen genomen, deze twee methoden kunnen meten de permeabiliteit van het intestinaal epitheel in vitro en in vivo, en vandaar worden gebruikt bij het bestuderen van de verbinding tussen ziekten en barrièrefunctie.

Cultuur, Caco-2BBe cellen groeien als een enkelgelaagde en langzaam onderscheiden in volwassen absorberend enterocyten borstel randen. In dit protocol, Caco-2BBe cellen werden bedekt met een hoge dichtheid op polycarbonaat membranen en cellen bereikt 100% confluentie één dag na het zaaien. Cellen zijn echter ongedifferentieerde in dit stadium: als volledig onderscheid de cellen, de media elke 2-3 dagen voor 3 weken wordt gewijzigd. Cellen werden gekleurd met kernen en F-actine vlekken om ...

Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Het algemene doel van dit experiment is om de ziekten te bestuderen die worden veroorzaakt door epitheliale barrièredisfunctie door de darmeppitheelceldoorlaatbaarheid in vitro en in vivo te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van de darmbarrièrefunctie, zoals die met betrekking tot de inflammatoire darmziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat darmeppitheelceldoorlaatbaarheid zowel in vitro als in vivo kan worden beoordeeld.De implicaties van deze techniek strekt zich uit tot therapie of diagnose van maag-darmziekten, omdat darmeppitheelbarrière disfunctie bijdraagt aan deze ziekten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de darmbarrièrefunctie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals medicijntoxiciteitsstudies en barrière-integriteit van andere celtypen. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat sommige stappen moeilijk te leren zijn.Een nauwkeurige werking van deze methode kan nu worden begrepen door tekstuele beschrijving. Om te beginnen, groeien Caco-2bbe cellen in een T75 kolf met medium. Voer de kolven regelmatig, afhankelijk van de celdichtheid.Wanneer de cellen zijn 80%confluent, verwijder het medium en gebruik 1-2 milliliter steriele PBS zonder calcium om ze te spoelen. Voeg 1,5 milliliter Trypsin-EDTA toe en wieg de kolf voorzichtig. Plaats het vervolgens 20 minuten in de 37 graden Celsius-incubator, zonder te schommelen.Terwijl de cellen trypsinizing zijn, plaats inserts met poreuze polycarbonaat membranen in 24 put platen. Voeg vervolgens 1 milliliter cultuurmedium toe aan de basale kamer, de onderste ruimte van het membraan. Voeg 5 milliliter medium toe aan de kolf en pipet de cellen 5 tot 10 keer krachtig tegen de binnenkant van de kolf, om de cultuur te scheiden in losse individuele cellen, of twee tot drie celklontjes.Plaat 0.166 milliliter van de cellen in de apicale kamer die de bovenste ruimte van het membraan is. Dan incubeer de platen op 37 graden Celsius voor maximaal drie weken. Voer de cellen drie keer per week, met behulp van een drukpomp om het medium voorzichtig aan te halen uit het basale compartiment van elke put.Druppel vervolgens voorzichtig een milliliter medium in de apicale kamer van elke insert. Voor cytokinestudies vervangt u een dag voor transepitheliale elektrische weerstand of TER-metingen het basale medium door medium, dat 10 nanogram per milliliter interferongamma bevat. Vervang het medium op de dag van het experiment door HBSS met 2,5 of 7,5 nanogram per milliliter TNF.Als u de meter wilt corrigeren, plaatst u de correctieelektrode in de invoerpoort en kiest u de Ohm-modus. Gebruik vervolgens een schroevendraaier om de R-aanpassingsschroef aan te passen totdat de meter een uitlezing van 1.000 ohm weergeeft. Steriliseer de elektroden in 70% ethanol gedurende 15 tot 30 minuten en laat ze 15 seconden aan de lucht drogen.Spoel vervolgens de elektroden in experimentele celkweekmedium. Schakel vervolgens de stroom in en kies de Ohm-modus. Terwijl de elektroden verticaal blijven, plaats je voorzichtig de lange uiteinden van elektrodebruggen in de basale kamer, zodat ze de schotel raken.Plaats vervolgens de korte uiteinden in de apicale kamer, ervoor te zorgen dat ze blijven onder het oppervlak van het medium, maar boven de weefselcultuur inserts. Meet de weerstand van het monster en lege inserts op 0, 1, 2, 3 en 4 uur na cytokinebehandeling. Neem dan de weerstand op.Om consistentie te bereiken tussen verschillende plaatformaten, berekent u het product van de weerstand en het effectieve membraangebied zoals hier wordt weergegeven. Voor 24 putinsert, het effectieve membraangebied is 0,33 vierkante centimeter. Om colitis te induceren, voeg DSS toe aan autoclaved water tot een uiteindelijke concentratie van 3,5% gewicht per volume.Gebruik dan de DSS-oplossing om het drinkwater in de kooien van 8 weken oude mannelijke C57 zwarte zes muizen te vervangen voor een totaal van zeven dagen. Geef regelmatig drinkwater zonder DSS om muizen te controleren. Na dag zeven, schakel het DSS water om naar gewoon drinkwater.Elke dag, weeg de muizen en beoordeel de klinische scores zoals gedefinieerd op basis van de ernst van de ziekte door vier parameters: rectale verzakking, ontlasting consistentie, bloeden, en activiteit. Som de scores van deze parameters op voor een eindklinische score. Om de histopathologische toestand van darmweefsels zeven dagen na DSS-behandeling te analyseren, na het euthanaseren van muizen volgens het tekstprotocol, isoleer de dikke darm en cecum en meet de lengte van de dikke darm.Snijd 0,5 centimeter segmenten uit de distale dikke darm, en bevestig het weefsel in een 15 milliliter valk buis met 10 milliliter van 10% formaline 's nachts. Was de vaste weefsels met ingedeelde ethanol en xyleen. Dan insluiten de weefsels in paraffine en snijd zes millimeter secties voor de hematoxyline en eosine vlekken.Om epitheelbarrièredoorlatendheid bij DSS-geïnduceerde muizen te meten, zeven dagen na het begin van DSS-toediening, snel de muizen drie uur. Autoclave een gavage naald om steriliteit te garanderen, gebruik dan 150 microliters van 80 milligram per milliliter vier kilodalton FITC dextran in steriel water om de muizen te controleren, en houd de ongebruikte FITC dextran om de standaard curve te meten na het verzamelen van het serum. Vervolgens, gewicht van de muizen voor de doorlaatbaarheid berekening.Vier uur later, na het verdoven van de muizen door IP-injectie, bevestigen de juiste verdovendering door het gebrek aan reflexen en snorharen beweging. Plaats de muizen vervolgens vijf minuten op een hitteblok. Met behulp van een schaar, clip een stuk van een centimeter van de staart en verzamel 100 microliters van bloed uit de staart in een serum collectie buis.Draai het verzamelde bloed op 10.000 keer g en kamertemperatuur gedurende tien minuten. Verdun het serum met water één tot vier. Gebruik vervolgens water om de verdunningen van de ongebruikte FITC dextran voor te bereiden om een standaardcurve te maken.Voeg 100 microliter per put van het serum en de standaard curve monsters toe aan 96 putplaten. Met behulp van een plaatlezer, lees de fluorescentie bij een excitatie van 485 en een emissie van 528. Bereken de doorlaatbaarheidswaarden op basis van de standaardcurve en vermenigvuldig met vier om de verdunning te corrigeren.Verdeel de concentratie van FITC dextran door het gewicht om de waarden te normaliseren. Dit helpt om het verschil in FITC dextran levering te normaliseren als muizen ziek zijn, en hebben verloren gewicht. De Hier getoonde Caco-2bbe cellen werden gelabeld met kernen en F-actine vlekken om het verschil tussen ongedifferentieerde en gedifferentieerde cellen aan te tonen.Stressvezels zijn duidelijk te zien in ongedifferentieerde cellen. Gedifferentieerde cellen hebben een kleiner volume, grotere kernen en minder stressvezels dan ongedifferentieerde cellen. TNF staat centraal bij het verlies van darmbarrières door MLCK-afhankelijke strakke verbindingsregeling.Zoals in dit cijfer te zien is, vermindert TNF de TER van de Caco-2bbe monolayer aanzienlijk op een dosisafhankelijke manier, wat suggereert dat TNF de epitheeldoorlaatbaarheid verhoogt. Vergeleken met hun oorspronkelijke lichaamsgewicht verliezen muizen die met DSS worden behandeld een aanzienlijke hoeveelheid gewicht. De ernst van colitis wordt gescoord door rectale verzakking, ontlasting consistentie, bloeden, en activiteit.Dwarsdoorsnedes van darmweefsels bevlekt met hematoxylin en eosine vertonen darmslijmvliesschade bij met DSS behandelde muizen. Bovendien is de lengte van de dubbele puntcrypte, evenals de dikke darm zelf, afgenomen in met DSS behandelde muizen. Ten slotte is er een ongeveer tweevoudige toename van de niveaus van FITC dextran kleuring in DSS-behandelde muizen, in vergelijking met controlemuizen.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om fouten te minimaliseren, door het standaardiseren van operationele procedures en het gebruik van statistische methoden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van darmbarrièrefunctie om maag- en darmziekten in zowel modelorganismen als cellijnen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe darm epitheeldoorlatendheid te bepalen door het meten van de TER, gavaging FITC dextran, en het observeren van morfologische en histochemische veranderingen.

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft het gebruik van uitgesneden darmweefselpreparaten of 'darmzakken' als een ex vivo model van de darmwandfunctie. Dit model kan worden gebruikt om de integriteit van zowel de epitheliale barrière als de slijmvlieglaag op specifieke darmlocaties in diermodellen van spijsverteringsziekten te beoordelen.

Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

Huidige behandelingen van inflammatoire darmziekten (IBD) zijn gericht op het verlichten van de ziektesymptomen, maar kan ernstige bijwerkingen veroorzaken. Zo worden alternatieve strategieën onderzocht in dierlijke modellen colitis. Hier leggen we uit hoe de gunstige effecten van voedingssupplementen op de klinische IBD borden worden geanalyseerd in een dergelijk colitis model.

Het analyseren van gunstige effecten van voedingssupplementen op darmepitheel Barrier Functies tijdens de Experimental Colitis

Dit protocol beschrijft de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time volgende farmacologische behandeling in menselijke intestinale organoids met behulp van fluorescentie microscopie en levende cel microscopie.

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

De toegang van voedingsstoffen, microbiota metabolieten en medicijnen voor het verkeer wordt geregeld door de darm-bloed-barrière (GBB). Beschrijven we een directe methode voor het meten van de GBB permeabiliteit in vivo, die, in tegenstelling tot veelgebruikte indirecte methoden, wordt vrijwel niet beïnvloed door de functies van lever en nieren.

Een In Vivo -methode voor het uitrekenen van de Gut-bloed barrière en lever metabolisme van Microbiota producten

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

Dit protocol beschrijft de oprichting van enteroïden, een driedimensionaal darmmodel, uit foetaal darmweefsel. Immunofluorescente beeldvorming van epitheliale biomarkers werd gebruikt voor modelkarakterisering. Apicale blootstelling van lipopolysacchariden, een bacterieel endotoxine, met behulp van micro-injectietechniek geïnduceerde epitheliale permeabiliteit op een dosisafhankelijke manier gemeten door de lekkage van fluorescerende dextran.

Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

Het huidige protocol schetst een methode die lucifergeel gebruikt in een apicale enteroïde model om de darmdoorlaatbaarheid te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te bepalen bij enteroïden die inflammatoire darmziekten modelleren, zoals necrotiserende enterocolitis.

Intestinale permeabiliteit bepalen met lucifergeel in een apical-out enteroïde model

Hier beschreven worden protocollen die worden gebruikt om het dynamische proces van MG53-gemedieerde celmembraan te herstellen in zijn geheel dieren en op cellulair niveau te visualiseren. Deze methoden kunnen worden toegepast op de celbiologie van de plasma membraan opnieuw sluiten en regeneratieve geneeskunde te onderzoeken.

Visualisatie van MG53-gemedieerde celmembraan Reparatie gebruik In vivo En In vitro Systemen

Leer intestinale epitheliale celpermeabiliteit meten in vitro en in vivo bij muizen. Deze methoden helpen onderzoekers gastro-intestinale ziekten en epitheelbarrièrefunctie bestuderen voor therapeutische toepassingen.

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

Meer video's verkennen